Inibitori di PI3k per la terapia antitumorale: quanto è stato realizzato finora?

Inibitori di PI3k per la terapia antitumorale: quanto è stato realizzato finora?

La fosfoinositide 3-chinasi (PI3k) è un grosso duello fra lipidi e proteine chinasi che catalizzano la fosforilazione dell’ossidrile in posizione 3 del fosfatidilinositide (PIs) e gioca un ruolo importante nel network di comunicazione cellulare. L’inibizione delle vie di segnale della fosfatidilinositolo 3-chianasi (PI3k) è una nuova strategia identificata per la scoperta e lo sviluppo di diversi agenti terapeutici.

Trai vari sottotipi di PI3k, la classe IA PI3kα ha ottenuto una attenzione particolare come promettente target per i farmaci usati nella cura del cancro a causa delle sue frequenti mutazioni ed amplificazioni in vari tipi di cancro umano

.

La via della fosfoinositide 3-chinasi (PI3k) è un segnale a cascata cruciale, coinvolto in vari processi cellulari e che regola molte funzioni fisiologiche tra le quali la crescita cellulare, la sopravvivenza, l’amplificazione e l’apoptosi. Le PI3ks sono chinasi doppie, lipidiche e proteiche, che sono attivate da un grande range di recettori tirosin chinasici, portando alla formazione di fosfatidilinositolo-3,4,5-trifosfato (PIP

) come importante secondo messaggero che regola funzioni cellulari attraverso la fosforilazione a valle di effettori e adattatori. Le PI3k sono suddivise in tre classi (I,II,III), le Pi3k di classe I sono eterodimeri costituiti da una subunità catalitica ed una subunità regolatrice. La subunità catalitica contiene quattro isoforme: p110α, p110β, p110γ e p110δ.

Pik3ca, il gene che codifica la subunità catalitica del PI3kα è mutato e/o

iperespresso frequentemente in un largo range di cancri umani. Mutazioni

rare sono state trovate anche nella subunità regolatrice di p85α. Cancri

con mutazioni che attivano la chinasi sono frequentemente trattati con

successo con opportuni inibitori di queste particolari chinasi. La

connessione significativa tra PI3kα e la genesi di tumori fa del PI3kα un

target ideale per lo sviluppo di farmaci antitumorali.

La strategia di avere come target le chinasi in certe importanti vie di segnale per lo sviluppo di farmaci è altamente supportato da esempi di successo di inibitori delle chinasi, tra cui l’Imatinib (Gleevee®, Novartis), Gefitinib (Iressa®, Astra-Zeneca), Erlotinib (Tarceva®, OSI Pharmaceutical), Sorafenib (Nexavar®, Bayer & Onyx Pharmaceuticals), Sunitinib (Sutent®, Pfizer), Lapatinib (Tykerb®, Glaxo Smith Kline) e Desatinib (Sprycel®, Bristol-Myers Squibb)

Gefitinib

Lapatinib

Fin dalla scoperta della prima generazione di inibitori Pan-PI3k, come ad esempio Wortmannin e LY294002, grandi risultati sono stati ottenuti nella ricerca di inibitori isoforma-specifici come ad esempio gli inibitori selettivi delle isoforme β, δ e γ del PI3k.

PI3k e vie di PI3k

Famiglia delle fosfoinositide 3-chinasi (PI3k)

I PI3k costituiscono un grande gruppo di chinasi doppie, lipidiche e proteiche, che svolgono un ruolo importante in diversi eventi di segnalazione cellulare. La superfamiglia delle PI3k include tre classi principali: I, II e III, in base ai domini proteici che le costituiscono e ne determinano la specificità (Figura 12) e in accordo con le loro differenze

Dasatinib

nelle analogie di sequenza, nelle preferenze per i substrati e nelle funzioni.

Figura 12. Classificazione delle isoforme di PI3K. Le chinasi di tutte e tre le classi vengono ampiamente espresse nell’intero organismo, ad eccezione della classe IA con subunità catalitica p110δ, presente prevalentemente nei linfociti.

Ciascuna classe primaria delle PI3k è coinvolta in distinti processi di

segnalazione cellulare e può essere ulteriormente divisa in base ad una

omologia di sequenza o per i meccanismi di regolazione (Figura 13).

La classe I delle PI3k, il gruppo di PI3k maggiormente studiato fino ad oggi, è costituita da eternatomi che formano una subunità catalitica ed una regolativi. Le PI3k di classi I catalizzano il trasferimento di un gruppo fosforico dell’ ATP sulla posizione D

del fosfatidilinositolo-3,4,5-trifosfato (PIP

) il quale a sua volta funge da ligando per reclutare, sulla faccia interna della membrana cellulare, proteine contenenti domini Pleckstrin Homologi (PH) tra cui Akt

.

La classe I delle PI3k presenta quattro subunità catalitiche altamente omologhe e strettamente correlate (110 kDa, ma anche note come p110):

p110α, p110β, p110γ e p110δ, codificate da quattro geni distinti, rispettivamente noti come Pik3ca, Pik3cb, Pik3cd e Pik3cg.

In corrispondenza delle subunità catalitiche, le isoforme della classe I delle Pi3k sono indicate come PI3kα, PI3kβ, PI3kγ e PI3kδ.

Basandosi sulle loro connessioni con le subunità regolatorie e il meccanismo di attivazione, le quattro isoforme della classe I di PI3k possono ulteriormente essere raggruppate in 2 sottoclassi: IA e IB.

Le isoforme PI3kα, PI3kβ e PI3kδ appartengono alla classe IA e possono essere attivate da recettori tirosin chinasici (RTK). Subunità regolatorie associate alla classe IA sono le p85α, p85β, p55γ e la p50α. L’unica subunità catalitica della classe IB è la p110γ, nonostante sia altamente omologa alle quattro subunità catalitiche della classe IA, la p110γ è attivata esclusivamente da piccoli recettori accoppiati a proteine G (GPCRs) e può legarsi in maniera specifica con adattatori non correlati con la proteina p85. Il p110γ è associato con al subunità regolatrice p101 codificata dal gene Pik3r6 e con un regolatore denominato p84 o p87 (PIKAP) codificato dal gene Pik3r6.

Studi patofisiologici hanno spiegato le strette connessioni tra PI3kα e

l’oncogenesi, PI3kβ e le trombosi, PI3kδ e le funzioni immunitarie, PI3kγ e

l’infiammazione.

Attivazione delle PI3K di classe IA

Il meccanismo che porta all’attivazione delle PI3K di classe IA (Figura. 14) prevede che in condizioni di riposo il complesso p85-p110 sia presente in forma inattiva all’interno del citoplasma e che, in seguito a stimolazione di RTK da parte di specifici ligandi, i recettori dimerizzino e si fosforilino in trans sui residui di tirosina presenti a livello delle loro porzioni citoplasmatiche.

Figura 14. Meccanismo di attivazione della PI3K di classe IA

La dimerizzazione del recettore e la sua attivazione per fosforilazione permettono, quindi, il reclutamento alla membrana plasmatica del complesso p85-p110 della PI3K tramite interazione dei domini SH2 di p85 con i residui di fosfo-tirosina di RTK.

Il legame della subunità regolatoria p85 al recettore determina, a sua volta, variazioni conformazionali della PI3K che, a livello della subunità catalitica, giunge in prossimità del suo substrato lipidico

.

Evidenze scientifiche dimostrano che p110 può essere attivata anche in

maniera indiretta attraverso l’intervento di Ras o di molecole adattatrici, tra

cui GRB2 (growth factor receptor-bound protein 2). Questa proteina è in

grado, infatti, di legare le tirosine fosforilate di RTK e reclutare a sua volta

la famiglia di molecole adattatrici GAB (GRB2-associated binding proteins) che legano p85

(Figura 14).

Le PI3k di classe II sono monomeri e mancano di subunità regolatrici.

Sono state identificate tre isoforme delle PI3k di classe II: PI3k-C2α, PI3k- C2β e PI3k-C2γ, le prime due sono espresse nella maggior parte dei tessuti mentre l’ultima è espressa esclusivamente nel fegato. La classe II delle PI3k, a differenza della ben caratterizzata classe I, sta ricevendo un aumento di attenzione solo di recente ed i ruoli esatti di queste isoforme non sono ancora chiari.

I componenti della classe III sono eterodimeri, costituiti da una subunità regolatrice (p150) e da una catalitica (Vps34). La Vps34 condivide significativa similarità di sequenza con la subunità catalitica della classe I delle PI3k ed il suo prototipo è la proteina vacuolare del Sacchoromyces cerevisiae (lievito) classificante la proteina mutante 34 (Vps34p).

Vie di PI3k ed eventi cellulari downstream regolati

Sull’attivazione da vari stimoli biologici, le PI3k fosforilano fosfolipidi, portanti l’inositolo nella posizione 3

OH dell’anello dell’inositolo.

Diverse classi di PI3k hanno come substrato preferenziale i fosfolipidi.

Il substrato più comune è il fosfatidilinositolo-4,5-bifosfato (PIP

), la cui fosforilazione produce il fosfatidilinositolo-3,4,5-trifosfato (PIP

) (Figura 15) come importante secondo messaggero scatenante molti processi di segnalazione cellulare.

Il PIP

funziona come una piattaforma di docking per i domini leganti lipidi

di varie downstream di proteine. Il dominio PH è il principale dominio

implicato in questa interazione. Le principali proteine downstream di PI3k

includono proteine chinasi B (PKB, note anche come serina/treonina

chinasi Akt) e proteine chinasi 1 3-fosfoinositide-dipendenti (PDK1).

Figura 15. Struttura del fosfatidilinositolo-3,4,5-trifosfato (PIP3)

PBK/Akt è il nodo centrale nel processo di segnalazione cellulare downstream e regola una vasta gamma di proteine, tra le quali la glicogenosintetasi chinasi 3 (GSK3), promotori di morte associati a Bcl-2 (BAD), la caspase 9, p70 S6-kinase (p70-S6K), le proteine leganti elF4E (4E-BPI) e membri del fattore di trascrizione Forkhead box (FOXO), sia in modo positivo che negativo.

Una volta reclutato dal PIP

, il PKB/Akt è fosforilato dal PDK1 sulla membrana plasmatici ed attiva altri effettori downstream, come ad esempio proteine chinasi 2 fosfoinositide dipendenti (PDK2) che attualmente costituiscono il target principale nei mammiferi della rapamicina (mTOR) attraverso le fosforilazioni su residui serinici e treoninici.

L’attivazione delle vie delle PI3k è regolata negativamente da due fosfoinositide fosfatasi. Una è la fosfatasi PTEN (Phosphatase and Tensin homologue), una 3’fosfatasi dotata di doppia specificità in quanto è in grado di defosforilare sia proteine che lipidi ed è in grado di rimuovere il gruppo 3’OH di PIP

e lo converte in PIP

; questo agisce come soppressore del tumore.

Un’attivazione costitutiva della PI3k e la perdita di funzione del PTEN

coesiste spesso in vari tipi di cancro. L’altra è la fosfatasi a dominio SH2

contenente inositolo (SHIP), che rimovendo il gruppo fosfato in posizione

5 defosforila il PIP

a fosfatidilinositolo-3,4-bifosfato.

La via della PI3k, biforcandosi in molti punti ed integrando i segnali da molte vie come quelli che coinvolgono la Ras della p53, è la cascata trasduzionale chiave del network di segnalazione cellulare.

Questa regola molti processi biologici inclusi la crescita cellulare, la differenziazione, la sopravvivenza, la proliferazione, l’apoptosi, la trascrizione e la traslazione, la migrazione e l’invasione, la mobilità, l’angiogenesi, l’immunità ed il metabolismo.

PI3kα ed il cancro

Caratteristiche strutturali del PI3kα

Il PI3kα, un membro della classe IA delle PI3k, è composto dalla subunità catalitica del p110α e da tre subunità regolatorie: p85α, p55α e p50α, che controllano la sua espressione, attivazione e localizzazione. La subunità p110α della PI3kα ha 5 domini: un dominio che lega l’adattatore (ABD) che si lega alla subunità regolatoria, un dominio che lega il Ras (RBD), un dominio omologo alla proteina chinasi C (C2) che si lega alle membrane cellulari, un dominio PI3k accessorio a spirale (PI3ka) ed un dominio catalitico chinasico (PI3kc) che contiene il sito di legame con l’ATP a livello del terminale-C.

Anche la subunità regolatoria p85α ha 5 domini: un dominio Src-homology 3 (SH3) ed un Bcr-homology (BH) sul terminale-N, un dominio Src- homology 2 (nSH2), un dominio Src-homology (cSH2) sul terminale-C, ed un dominio inter-Src-homology 2 (iSH2) che interagisce con la subunità catalitica (Figura 16).

Nonostante che entrambe le strutture del p110γ animale ed umano siano

state risolte nel 1999, soltanto nel 2007 è stata ottenuta la struttura

cristallina del p110α animale.

La struttura del p110α umano con parte del p85α (domini nSH2 ed iSH2) è stata chiarita sperimentalmente da Huang ed i suoi collaboratori ad una risoluzione di 3.05 angstrom alla fine del 2007.

È stato osservato che il p110α umano era prodotto a livelli facilmente rilevabili solo quando ce-espresso con la subunità regolatrice p85α, e che la coespressione del p110α con l’intera lunghezza di p85α portava all’aggregazione.

La struttura eterodimero p110α/niSH2 ha in genere una forma triangolare con la lunga spirale avvolta; l’ABD e l’RBD sono entrambi piccoli domini globulari con una topologia ad α/β-sandwich, connessi da un lungo connettore contenente quattro eliche; il domino C2 è un β-sandwich di due foglietti a quattro filamenti antiparalleli, connessi con l’RBD attraverso una lunga spira; il dominio PI3kc è una struttura a due lobi formata da due sottodomini α/β separati da una fessura. Molte delle mutazioni avvengono sul residuo situato all’interfaccia tra il tipi p110α ed il p85α o tra i sandwich α/β del dominio catalitico della chinasi ed altri domini collegati alla subunità (Figura 17,

).

Nonostante siano stati ottenuti progressi notevoli nel chiarimento della struttura di PI3kα, la struttura cristallina di p110α con inibitori a piccola molecola, uno strumento importante e solida base per lo sviluppo di inibitori isoforma-specifici di PI3kα con potenziali terapeutici, non è ancora stata utilizzata.

Figura 16. Struttura del dominio di PI3Kα: la subunità catalitica p110α e la subunità regolatoria p85α.

È stato convalidato che la sacca interiore legante l’ATP è altamente conservata nella classe I delle PI3k, anche per PI3kα e PI3kγ, è stato osservato il 35% di identità di sequenza e fino al 54% di omologia di sequenza. Perciò prima della comparsa della struttura cristallina di PI3kα con inibitori a piccola molecola, basati sul target (modellamento e legame per omologia) e sul ligando (3DQSAR), sarebbe di grande importanza l’impegno nel generare modelli di interazione integrati capaci di correlare le strutture chimiche degli inibitori di PI3kα con le loro attività biologiche per sostenere lo sviluppo di inibitori PI3kα per il trattamento del cancro.

Figura 17. Visione dell’eterodimero p110α/niSH2. (A) Schema dell’organizzazione del dominio. Le regioni in grigio sono linker tra i domini. (B) Diagramma a nastro dell’etrodimero p110α/niSH2. I contatti iSH2 ABD e iSH2 C2 sono messi nel riquadro. (C) Diagramma a nastro dell’etrodimero p110/niSH2, visualizzazione alternativa.

Attivazione e segnalazione della PI3kα

Come la maggior parte delle PI3k della classe I, la PI3kα è attivata da segnali a monte da recettori tirosin-chinasici, stimolazioni da fattori di crescita esterni, ormoni, neurotrasmettitori ed altri mediatori.

Nelle cellule quiescenti, il p85 si lega al p110α stabilizzando le sue attività chinasiche. La presenza di stimoli cellulari fa si che i domini nSH2 e cSH2 di p85 si leghino con alta affinità ai motivi Tyr-X-X-Met di tiroxine fosforilate in recettori attivati in proteine adattatrici (RTKs).

Questo legame aiuta l’inibizione di p110α e media il reclutamento delle subunità catalitiche verso la membrana plasmatici senza rilasciamento di p85α da p110α

.

L’attività di PI3k è ulteriormente incrementata dall’interazione tra p110α e l’oncoproteina Ras in maniera GTP-dipendente attraverso il sito effettore Ras ed attraverso un punto di mutazione nel sito di interazione.

La PI3kα attivata catalizza la fosforilazione del fosfatidilinositolo-4,5- bifosfato (PIP

) sul gruppo 3’OH e porta al fosfatidilinositolo-3,4,5-trifosfato (PIP

). Il PIP

a sua volta recluta ed attiva proteine downstream con un dominio di omologia pleckstrim (PH), come ad esempio la Caspasi9, BAD, FOXO, GSK3 e mTOR, amplificando la cascata del segnale e regolando la crescita cellulare, la proliferazione, la sopravvivenza e l’apoptosi.

La PTEN agisce come un soppressore tumorale defosforilando il gruppo 3’OH del PIP

e convertendolo in PIP

. PTEN mutata, porta a simili conseguenze del segnale come ad esempio un’elevata attività delle PI3k, ed è comune nei vari tipi di cancro umano (Figura 18, PI3kα).

In combinazione con quanto descritto, il meccanismo per l’attivazinoe

della via della PI3kα include 5 aspetti: attivazione dei recettori per i fattori

di crescita, amplificazione o mutazione della PI3kα, amplificazione o

mutazione di Akt, perdita della funzione del soppressore tumorale PTEN

ed esposizione a carcinogeni.

Figura 18, PI3Kαααα. Interazioni significative della segnalazione di PI3Kα

PI3kα e genesi dei tumori

La trasmissione del segnale delle PI3k è strettamente connesso alla crescita cellulare, alla proliferazione ed alla sopravvivenza, che sono step critici nella genesi dei tumori.

La correlazione delle PI3k con i tumori è stata notificata e supportata negli ultimi decenni da molti studi importanti e di grande valore. Le funzioni fisiche delle isoforme altamente omologhe delle PI3k, specialmente quelle di classe I, non sono state chiarite prima dell’impiego sia di topi geneticamente modificati che di strumenti farmacologici selettivi.

Le PI3k sono state scoperte negli anni ottanta per la loro associazione con oncoproteine, e pochi anni più tardi, è stata identificata la subunità catalitica p110α come un oncogene aviario codificato da retrovirus (sarcoma virus aviario 16, ASV 16) che può trasformare i fibroblasti dell’embrione del pollo.

Nella regolazione della proliferazione e nella genesi dei tumori, le proteine

PI3k più importanti sono quelle appartenenti alla classe IA - la subunità

catalitica p110α e la subunità regolatoria p85 ad essa associata.

L’amplificazione o l’iperespressione del p110α si manifesta comunemente in vari tipi di cancro, inclusi quelli della testa e del collo, dei polmoni, della tiroide e nel cancro cervicale, così come nell’adenocarcinoma dell’esofago e nel carcinoma a cellule squamose. Inoltre, l’aumento di attività in mutazioni cancro-specifiche di Pik3ca, il gene che codifica la subunità catalitica p110α, è stato identificato in vari forme maligne, a partire dal cancro al seno, al colon, alle ovaie e da quello epatocellulare fino al glioblastoma ed al carcinoma gastrico.

La maggior parte delle frequenze di queste mutazioni sono state determinate. La distribuzione delle frequenze mutate porta all’emergere di tre “siti caldi”, caratterizzati da un singolo residuo amminoacidico: Glu542 e Glu545 all’interno del domino elicoidale e His1047 all’interno del domino catalitico della chinasi (PI3kc).

Tutti e tre i siti hanno elevate attività enzimatiche e di trasformazione, responsabili dell’80% delle mutazioni di p110α e presenti in circa il 30%

dei tumori solidi. Il Glu542 ed il Glu545 sono spesso mutati a lisina, mentre l’His1047 viene mutata ad arginino. Fra tutte le mutazioni di PI3kα, all’incirca il 40% trasportano la mutazione dell’His1047, che genera il potenziale oncogenico PI3Kα e che ricorre con altissima frequenza.

In questi tre “siti caldi” esistono molte altre mutazioni rare in ogni parte dei cinque domini di p110α e solo poche di esse sono prive di aumento si funzionalità. Sono state riportate anche diverse alterazioni cancro- associate di Pik3r 1, il gene che codifica la subunità regolatoria p85α.

Nonostante che le alterazioni della subunità p85α siano rare, aiutano ad enfatizzare l’importanza di PI3kα. Tutto ciò suggerisce che l’attivazione costitutiva del PI3kα promuove mutazioni e migrazioni di cellule e contribuisce alla formazione di tumori e metastasi.

Nonostante che le mutazioni cancro-specifiche nelle isoforme non-α

potrebbero avere ruoli subordinati nei tumori andando ad agire su fattori

quali l’attività catalitica, le proprietà fisiche, interazioni e riconoscimenti

comuni, etc.

Nella maggior parte delle situazioni, le mutazioni frequenti di PI3kα coesistono con alterazioni geniche di altre componenti della cascata del segnale per ottenere effetti sinergici, come ad esempio l’Akt ed il PTEN, entrambi target di frequenti cambiamenti genetici in diversi cancri umani.

Inibitori delle PI3k ed inibitori di PI3kα

Inibitori delle PI3k: quadro generale

Le PI3k sono state largamente riconosciute come potenziali target dei farmaci a causa dell’importanza della via di segnale PI3k. Alcuni composti che hanno come target altre componenti di questa via sono già entrati nelle sperimentazioni cliniche, come ad esempio l’inibitore di PDK1, UCN- 01, l’inibitore di Akt, NSC39966, gli inibitori di mTOR, CCI-779, RAD001 ed AP13576. Dato che ciascun elemento della classe I delle PI3k svolge importanti ruoli in processi fisiopatologici, gli inibitori delle PI3k con determinati livelli di selettività potrebbero avere promettenti applicazioni terapeutiche in un ampio range di malattie.

Inibitori delle PI3k di prima generazione: Wortmannin e LY294002

I pionieri degli inibitori delle PI3k, Wortmannin e LY294002, sono ampiamente conosciuti e largamente studiati. Entrambi presentano struttura co-cristallina con PI3kγ ed hanno svolto ruoli importanti nel chiarimento dei meccanismi di trasmissione delle vie delle PI3k, come anche nella spiegazione delle funzioni esatte di ciascuna isoforma di queste chinasi.

Il Wortmannin è il metabolita di un fungo, isolato per la prima volta nel

1957 ed ampiamente riconosciuto in termini di struttura nel 1974.

È stato descritto come un potente inibitore dell’esplosione respiratoria nei neutrofili e nei monoliti nel 1987 e determinato come potente inibitore delle PI3k nel 1993.

Il Wortmannin inibisce irreversibilmente le PI3k, inclusa PI3kα, a concentrazioni nel basso nanomolare. La relazione struttura-attività (SAR) ha rivelato che il suo meccanismo inibitorio coinvolge interazioni covalenti con il residuo catalitico della lisina all’interno del sito di legame per l’ATP delle PI3k. Oltre a questo, la struttura co-cristallina con PI3kγ indica che interazioni mediante legami a idrogeno con VAL-882, SER-806 e ASP-964 stabilizzano ulteriormente le sue interazioni con il recettore. Comunque, a causa della sua natura reattiva, principalmente per la presenza di un anello furanico, il Wortmannin è instabile in soluzione ed è incline a formare interazioni inaspettate con altre molecole biologiche.

Modificazioni del Wortmannin hanno già fornito analoghi con aumentate caratteristiche farmacocinetiche e ridotta tossicità

.

L’LY294002, un inibitore sintetico del pan-PI3k, è stato descritto per la prima volta dai laboratori di ricerca Lilly come un inibitore competitivo delle PI3k nel 1994, con valori micromolari di IC

nei confronti della classe I delle PI3k. Nonostante che l’LY294002 non presenti soddisfacenti proprietà farmacocinetiche, è più utile del Wortmannin per la sua stabilità.

La struttura co-cristallina di LY294002 con PI3kγ ha mostrato un legame a idrogeno tra l’ossigeno morfolinico del farmaco e l’ammide strutturale della

Wortmannin LY2940002

dall’ATP, è di importanza primaria nel mantenimento dell’attività inibitoria nei confronti di queste chinasi.

La relazione struttura-attività dell’LY294002 conferma le conclusioni sopra citate visto che buoni risultati sono stati ottenuti nell’attività inibitoria a seguito di modificazioni apportate al gruppo morfolinico.

Nonostante che l’LY294002 sia un inibitore pan-PI3k che presenta come target non solo le PI3k ma anche altre chinasi, come il Wortmannin, dai derivati dell’LY294002 possono essere ottenuti solo inibitori con limitata selettività.

Inibitori specifici delle isoforme di PI3k

Nonostante che le isoforme di PI3k siano altamente omologhe, specialmente per quanto riguarda il sito di legame per l’ATP dove la maggior parte degli inibitori delle proteine chinasi interagiscono, ci sono esempi di buoni inibitori di PI3k isoforma-specifici sviluppati sia da gruppi industriali che accademici.

Gli inibitori PI3kβ più selettivi sono il TGX-126, il TGX-221 ed il TGX-286

[53]

. Tra questi il TGX-221 ha mostrato una selettività circa 1000 volte maggiore nei confronti di PI3kβ rispetto alle altre PI3k di classe I ed ha effetti inibitori minimi sulle PI3k di classe II.

N

N N

O R₁

O

R₂

TGX-126: R1 = CH3; R2 =PhCH2NH–

TGX-221: R1 = CH3; R2 =PhNHCH(CH3)2–

TGX-286

Esempi di inibitori selettivi di PI3kδ includono i derivati dell’LY294002 quali: IC87114, PIK-39 e PIK294. I derivati tiazolidindionici quali AS- 252424, AS-604850 e AS-605240, sono esempi di inibitori selettivi delle PI3kγ; modificazioni strutturali di questi ultimi composti, potrebbero portare allo sviluppo di agenti antinfiammatori

.

Inibitori di PI3kα

Il PI3kα è un target ideale per inibitori specifici a piccola molecola che

potrebbero diventare altamente efficienti come farmaci antitumorali grazie

alla connessione significativa tra il PI3kα e la genesi dei tumori, metastasi

Seguendo la scoperta degli inibitori pan-PI3k, nell’ultimo decennio sono stati ottenuti anche inibitori specifici delle PI3k e, in particolare, sono stati ottenuti inibitori altamente specifici, prima, per le isoforme β e δ, in seguito anche per l’isoforma γ. Nonostante che ad oggi sia disponibile una quantità molto limitata di inibitori altamente selettivi per il PI3kα, alcuni composti sono stati sviluppati per il trattamento del cancro, e 7 di essi sono attualmente in fase di sperimentazione clinica.

Strutturalmente gli inibitori delle PI3k con elevata attività inibitrice nei confronti di PI3kα sono essenzialmente derivati arilmorfolinici imidazopiridinici.

Derivati arilmorfolinici ed analoghi

Analoghi 4-morfoliino-2-fenilchinazolinici

Il 4-morfilino-2-fenilchinazolin-6-olo (65) è stato ottenuto come potente inibitore selettivo del PI3kα attraverso lo screening high throughput (HTS), con un valore di IC

di 1.3 µM per il PI3kα in un saggio enzimatico per vie scintillografiche. Sono stati valutati vari cambiamenti strutturali al fine di acquisire informazioni sulla relazione struttura-attività del composto (63).

Una sostanziale diminuzione di attività è stata riscontrata quando il gruppo

morfolinico in C4 viene sostituito con una ammina ciclica, incluse le

piperidine ed i loro derivati. Questa scoperta è in linea con lo studio SAR

sull’LY294002, che suggerisce che il gruppo morfolinico, che

probabilmente occupa la stessa regione quando si lega alle PI3k, è di

importanza vitale nel mantenimento dell’attività inibitoria per questa serie

di composti. L’introduzione di sostituenti in posizione 2- e 4- dell’anello

fenilico in C2 diminuisce l’attività, mentre sostituenti in posizione 3- la

fanno aumentare. Variare la posizione del gruppo ossidrilico in 6

sull’anello chinazolinico porta ad una diminuzione dell’attività. Il gruppo

presente un gruppo 3-idrossifenilico in posizione C2 dell’anello chinazolinico (64), che ha mostrato valori di IC

di 0.056 µM.

Lo scambio dell’anello chinazolinico con altri eterocicli, come ad esempio le pirido [4,3-d]-pirimidine e le pirido [3,4-d]-pirimidine, fa aumentare l’attività inibitoria sia nei confronti della PI3kα che delle cellule di melanoma umano A375. il derivato della tieno [3,2-d]-pirimidina (67) è risultato il più potente della serie, con valori di IC

di 0.002 µM e 0.58 µM verso le PI3kα, rispettivamente in saggi enzimatici e cellulari.

Il composto (65) ha mostrato selettività per la PI3kα all’incirca 10 volte maggiore rispetto alla PI3kβ (IC

: 0.016 µM), >100 volte rispetto alla PI3kγ (IC

: 0.66 µM) ed alla classe II delle PI3k (IC

: 0.22 µM) e 1000 volte rispetto ad altre proteine chinasi, inclusa la proteina chinasi A (PKA, nota anche come proteina chinasi cAMP-dipendente, cAPK) (IC

: 91 µM),, ai recettori KDR (Kinase Domain Region), noti anche come recettori

per i fattori di crescita endoteliali VEGFR (IC

: 3.4 µM) e chinasi 2 cicline- dipendenti (CDK2) (IC

: 28 µM). In ogni caso, non è stato efficace in vivo a causa dello scarso ed inadeguato profilo farmacocinetico per via di una breve emivita minore di 10 minuti. In Figura 19 è riportato un riassunto degli studi SAR.

63 64 65

Figura 19 . Studi SAR sulle 4-morfolino-2-fenilchinazoline

Piridotienopirimidine e piridofuropirimidine

Come nel caso del composto 1, anche il derivato pirido [3’,2’:4,5]tieno[3,2- d]pirimidinico (66), è stato ottenuto da uno screening HTS come inibitore di PI3kα con valori di IC

di 1.4 µM.

Studi SAR hanno rivelato che la sostituzione del solfuro con l’ossigeno nel

composto (66) aumenta l’attività inibitoria nei confronti di PI3kα mentre la

sostituzione con un azoto porta ad una totale perdita di attività. La

sostituzione dell’azoto nella porzione piridinica di (66) con un carbonio

porta a diminuzione di attività. L’introduzione di un anello fenilico sul C2

della porzione pirimidinica mantiene attività simile. L’introduzione di anelli

fenilici 2-sostituiti conserva l’attività, anelli 3- e 4-sostituiti determinano un

aumento della potenza di circa 10 volte.

67 68 69

Il composto più potente è il 3-idrossifenil derivato, PI-103, (PI3kα IC

: 0.0036 µM) un composto promettente con favorevoli proprietà farmacologiche. Il PI-103 è attualmente sotto valutazione ed ottimizzazione da parte di molti gruppi; ha mostrato potenti effetti antiproliferativi in vitro con valori di IC

di 0.33 µM probabilmente grazie alla sua buona permeabilità attraverso la membrana cellulare ed ha soppresso in modo significativo la crescita tumorale del 45% quando somministrato per via intraperitoneale a 100mg/kg al giorno per 2 settimane in un modello HELA trapiantato di cancro cervicale umano senza determinare perdita di peso.

Nonostante che il PI-103 abbia mostrato eccellenti effetti selettivi (~100 volte) per PI3kα rispetto a PI3kγ (IC

: 0.25µM), la sua maggiore selettività rispetto a PI3kβ (IC

: 0.0030 µM) non è del tutto chiara. Valutazioni ulteriori hanno scoperto che il PI-103 non solo inibisce le PI3k ma anche altre chinasi come ad esempio la mTOR, che pure gioca ruoli importanti

PI-103

nei processi di crescita cellulare. L’inibizione sinergica di queste due chinasi contribuisce all’eccezionale attività cellulare di questo composto. In Figura 20 è descritto un riassunto degli studi SAR per questa classe di composti.

Figura 20. Studi SAR sulle piridotienopirimidine.

Derivati imidazopiridinici

Imidazopiridine arilsulfonpirazolo-sostituite

Scoperto dallo screening di librerie chimiche, il derivato imidazopiridinico (67) inibisce PI3kα con un valore di IC

di 0.67 µM, una attività inibitoria che è quasi la stessa di quella dell’LY294002 (IC

: 0.63 µM) nelle medesime condizioni sperimentali. Modificazioni strutturali di (67) hanno portato ai composti (68) e (69), altri due potenti inibitori di PI3kα con migliori proprietà farmacocinetiche.

L’introduzione di un atomo di cloro o di bromo al C6 dell’anello

imidazo[1,2-a]piridinico mantiene l’attività. La sostituzione dell’atomo di

floro in 4 sull’anello fenilico con un nitro gruppo ha dato come risultato la

perdita dell’attività su PI3kα, ed il 3-nitro derivato ha mostrato una attività

di circa 2 volte maggiore, mentre il 2-metil-5-nitro derivato (68) presenta un’attività notevolmente migliorata, con una IC

di 0.0031 µM.

Studi di modellazione molecolare hanno rivelato che l’incremento significativo del composto (68) potrebbe essere attribuito all’interazione con l’ossigeno del solfone ed il gruppo metilico dell’anello fenilico, che giocano un ruolo importantissimo nell’inibizione di PI3kα .

La sostituzione dell’azoto in posizione-2 dell’anello pirazolico di derivati 2- metil-5-nitrofenilici ha portato ad una grande diminuzionedi attività rispetto al composto (68), indicando quanto questo azoto sia cruciale per l’attività inibitoria su PI3kα. La rimozione del gruppo metilico in C2 dell’anello imidazo[1,2-a]piridinico incrementa leggermente l’attività.

Nonostante che il composto 6 fosse un inibitore PI3kα estremamente potente, non si è dimostrato efficace in modelli trapiantati a causa dello scarso profilo farmacocinetico dovuto all’instabilità del legame azoto- solfone.

Tuttavia, vari tentativi sono stati fatti per rimpiazzare il legame azoto- solfone con un legame carbonio-solfone che ha portato al composto (69), un inibitore di PI3kα altamente selettivo con IC

di 0.0028 µM, e la sua selettività nei confronti di PI3kβ (IC

: 0.17 µM), di PI3kγ (IC

: 0.23 µM) e della classe II delle PI3k (IC

: 0.10 µM) è aumentata di circa 80 volte.

Inoltre, il composto (69) ha dimostrato potenti effetti anti-proliferativi in

vitro con valori di IC

di 0.21 µM nelle cellule Hela ed ha soppresso in

modo significativo la crescita tumorale del 37% in modelli di topi Hela

trapiantati senza causare significativa perdita di peso. Un riassunto degli

studi SAR è riportato in Figura 21.

Figura 21. Studi SAR sulle imidazolopiridine arilsulfonpirazolo sostituite

Imidazopiridine arilsulfonidrazido-sostituite

Il composto (68), un potente inibitore selettivo di PI3kα come descritto sopra, è instabile in soluzione probabilmente a causa della rottura del legame pirazolo-solfone.

La sostituzione dell’anello pirazolico di (68) con l’idrazone ha portato ad una nuova serie di inibitori PI3kα contenenti appunto l’idrazone, che sono risultati potenti, selettivi ed efficaci in vivo, come ad esempio il composto (70) (IC

: 0.4 µM).

L’ottimizzazione strutturale di (70) ha portato a risultati esaltanti.

La rimozione del gruppo metilico in R

ha aumentato l’attività di circa 20 volte. La demetilazione in R

non altera l’attività. L’introduzione di un gruppo metilico in R

ha portato ad un aumento dell’attività di circa 2 volte rispetto al composto (70). La metilazione in R

insieme alla demetilazione in R

ed R

ha portato al composto PIK-75, che inaspettatamente ha un’attività di circa 1300 volte più elevata rispetto al composto (70).

La qualità più significativa di PIK-75 è la sua eccezionale ed eccellente

(circa 130 volte) e rispetto alla classe II delle PI3k (IC

: 0.1 µM) (circa 330 volte). Inoltre PIK-75 è un potente inibitore della crescita di varie cellule tumorali in vitro e sopprime la crescita tumorale del 62% quando somministrato per via intraperitoneale a 50 mg/kg al giorno per 2 settimane senza causare la perdita di peso in modelli trapiantati di cellule di cancro cervicale umano Hela.

Un altro merito di PIK-75 risiede nella sua migliore stabilità, confermata da test in metanolo a 37°C per 24 ore.

Modificazioni strutturali di PIK-75 sono state ottenute rimpiazzando l’atomo di bromo in posizione C6 dell’anello imidazo [1,2-a]piridinico con altri sostituenti, come ad esempio il fluoro, il cloro, ed il gruppo metilico, tutti quanti portano ad una diminuzione di attività, ad eccezione del ciano- derivato (71) (IC

: 0.00026 µM). Vari tentativi sono stati fatti anche per determinare se l’anello imidazo[1,2-a]piridinico fosse cruciale e necessario per l’attività PI3kα, attraverso la sua sostituzione con altrieterocicli, come ad esempio la 5,6,7,8-tetraidroimidazo[1,2-a]piridina, l’1-metil-1H- imidazolo, l’1-metil-1H-indolo, il benzo[c]isossazolo, l’imidazo[1,5- a]piridina, il benzofurano, il benzo[b]tiofene e la crinolina, che hanno portato o a grandi diminuzioni di attività o alla sua completa perdita.

Un riassunto degli studi SAR è riportato in Figura 22.

Figura 22. Studi SAR imidazopiridine arilsulfonilidrazido sostituite

Inibitori PI3k in test clinici per il cancro

Recentemente sono stati fatti grandi progressi nello sviluppo degli inibitori

PI3k per il trattamento del cancro e 7 molecole hanno raggiunto la fase

degli studi clinici (Figura 23).

Figura 23. Inibitori PI3k per il trattamento del cancro che hanno raggiunto la fase degli studi clinici

PX-866

Il PX-866 (Oncothyreon Inc., ProIX Pharmaceuticals), un analogo semisintetico del Wortmannin, è un inibitore pan irreversibile delle PI3k (IC

: 5.5, 9.0 e 2.7 nM rispettivamente nei confronti di PI3kα, PI3kβ e PI3kδ). Ha mostrato buoni livelli di selettività nei confronti di PI3kβ (IC

>

300 nM) ed ha migliorato le proprietà farmaceutiche rispetto al Wortmannin. Ha dimostrato una significativa attività antitumorale in modelli di cancro umano delle ovaie, cancro ai polmoni e glioblastoma intracranico sia usato da solo che in associazione con chemioterapici ed altri agenti antitumorali. Il trattamento con PX-866 porta ad una maggiore perdita di fosforilazione Akt, suggerendo che l’aumento della potenza di PX-866 sia legato ad una inibizione più duratura del segnale delle PI3k.

Il PX-866 inibisce la motilità delle cellule tumorali a concentrazioni subnanomolari. L’attività antitumorale del PX-866 è dovuta sia alla prolungata inibizione delle PI3k sia all’inibizione della motilità cellulare.

Nonostante che PX-866 sia un analogo perfezionato del Wortmannin, presenta ancora alcune lacune, come ad esempio quella di provocare una diminuzione del peso corporeo, leucocitosi ed iperglicemia con diminuzione di tolleranza per il glucosio.

Questi effetti sono dose dipendenti e reversibili per un uso discontinuo del farmaco. Sperimentazioni di fase I del PX-866 per tumori solidi in fase avanzata sono iniziati nel mese di giugno del 2008.

SF-1126

L’SF-1126 (Semafore Pharmaceuticals, Figura 23), un nuovo profarmaco

di LY294002 RGDS-coniugato, è stato progettato sia per migliorare la

solubilità che per prolungare l’emivita. Come l’LY294002, l’SF-1126

inibisce tutte le isoforme delle PI3k di classe IA (IC

: 0.5-5.7 µM) ed altri

membri chiave della superfamiglia delle PI3k, inclusi il DNA-Pk e l’m-TOR.

porta ad una migliore distribuzione del composto attivo LY294002 nel target ed una aumentata efficacia antitumorale.

L’SF-1126 ha dimostrato migliore tollerabilità in un grande numero di studi preclinici inclusi modelli di cancro trapiantato U87MG, PC-3, DU-145, U251MG, LN229, 786-O.

L’SF-1126 è attualmente nella fase di studi clinici per il cancro e fornisce un nuovo paradigma per il trattamento dei tumori attraverso l’applicazione di profarmaci pan PI3k inibitori.

XL-147 ed XL-765

XL-147 è un potente inibitore delle PI3k di classe I (IC

: 39, 383, 23, e 36 nM nei confronti rispettivamente di PI3kα, PI3kβ, PI3kγ e PI3kδ) senza attività inibitrice verso il DNA-Pk o l’m-TOR.

Dati preclinici presentati nel 2007 alla AACR-NCI-EORTC International Conference on Molecular Targets and Cancer Therapheutics (Abstract No.

C199 e C205) hanno dimostrato che questo composto provoca inibizione sostenuta e dose dipendente delle PI3k in molti modelli di cancro umano trapiantato, se somministrato come singolo agente.

Dati clinici presentati all’EORTC-NCI-AACR Symposium on Molecular Targets and Carcer Therapeucìtics (Abstract No. 218) nell’ottobre 2008 hanno dimostrato che l’XL-147 possiede una forte attività farmacodinamica alle dosi ben tolerate.

Recentemente sono iniziati anche studi di fase I diXL-147 in associazione con Erlotinib o in combinazione con Paclitaxel (Taxol®) o con Carboplatina in pazienti con tumori solidi.

L’XL-765 ha mostrato potente attività contro le Pi3k di classe I (IC

: 39,

113, 9, e 43 nM nei confronti rispettivamente di PI3kα, PI3kβ, PI3kγ e

PI3kδ), DNA-Pk (IC

: 150 nM) e m-TOR (IC

: 157 nM). Dati preclinici

presentati alla AACR-NCI-EORTC International Conference on Molecular

nell’ottobre del 2007 hanno dimostrato che XL-765 inibisce la crescita di tumori, l’angiogenesi e la sopravvivenza di cellule tumorali in modelli trapiantati. Dati clinici presentati al 44

Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology (ASCO) (Abstract No. 3510) nel maggio del 2008 hanno dimostrato che XL-765 presenta buone proprietà farmacocinetiche e farmacodinamiche.

I risultati delle analisi farmacodinamiche sono in accordo con il profilo del target di XL-765 ed indicano che il composto inibisce nei pazienti sia le PI3k che l’m-TOR a dosi ben tollerate.

A parte i test di fase I dell’XL-765 come singolo agente antitumorale, nell’ottobre del 2008 sono iniziati anche studi di fase I dell’XL-765 in associazione con Temolozide (Temodar®) in pazienti con glomi maligni ed associazioni con Erlotinib in pazienti con cancro al polmone non a piccole cellule.

I risultati sopra descritti supportano bene gli sviluppi dell’XL-147 e dell’XL- 765 sia come singoli agenti che in associazione con altri farmaci antitumorali.

NVP-BEZ234

NVP-BEZ234 (Novartis), un derivato imidazo[4,5-c]chinolinico, è un doppio inibitore pan-PI3k/m-TOR (IC

: 4, 76, 7, 5 e 21 nM nei confronti rispettivamente di PI3kα, PI3kβ, PI3kγ e PI3kδ ed m-TOR).

NVP-BEZ234 è capace di bloccare in modo efficace e specifico l’attivazione della via delle PI3k, incluso anche l’arresto in G1 in test cellulari. Questo composto è ben tollerato quando somministrato per via orale e mostra stasi della malattia. Studi in vivo hanno dimostrato che l’efficacia di altri agenti antitumorali potrebbero essere aumentata se usati in associazione con NVP-BEZ234.

Studi recenti hanno anche rivelato che NVP-BEZ234 potrebbe

potenzialmente inibire la proliferazione e la sopravvivenza VEGF-indotta in

Sono attualmente in atto studi di fase I/II in pazienti adulti con tumori solidi in stadio avanzato, inclusi pazienti con cancro al seno.

GDC-0941

Ulteriori ricerche riguardo gli inibitori arilmorfolinici di PI3kα hanno portato alla scoperta di GDC-0941 (genetech), un potente inibitore morfoliniltienopirimidinico delle PI3k, disponibile per via orale.

GDC-0941 è risultato equipotente nei confronti di PI3kα e PI3kδ (IC

: 3 nM per entrambi) ed ha dimostrato modesta selettività verso PI3kβ (IC

: 33 nM) e PI3kγ (IC

: 75 nM). Maggiore selettività è stata osservata nei confronti delle PI3k di classe II, III e IV.

È da notare che GDC-0941 ha mostrato anche equipotenza contro due enzimi mutanti di PI3kα, il mutante Glu545 ed il mutante His1047 (IC

: 3 nM per entrambi). Glu545 e His1047 sono due dei tre fosfato in PI3kα e rappresentano l’80% di tutte le mutazioni di PI3kα menzionate fino ad ora.

In studi in vivo che coinvolgevano cellule U87MG di glioblastoma umano trapiantato è stato osservato che dopo 21 giorni di terapia a dosi di 75 mg/kg al giorno, un’inibizione dell’83% della crescita tumorale senza significativa perdita di peso.

Se confrontato con la maggior parte degli inibitori delle PI3k arilmorfolinici, il GDC-0941 incrementa in maniera significativa la biodisponibilità ed è attualmente in fase clinica di studio per il trattamento di vari tipi di cancro umano.

BGT226

BGT226 (Novartis) è un nuovo inibitore duale delle PI3k/mTOR ma la sua

struttura chimica non è ancora nota. Potrebbe innescare la traslocazione

del Bax citotossico verso la membrana esterna mitocondriale,

incrementando la permeabilità della membrana mitocondriale ed

Studi di fase I/II del BGT226 in pazienti con tumori solidi avanzati, inclusi tumori al seno, sono attualmente in corso.

Nel novembre 2008 sono stati approvati in Giappone studi di fase I per determinare la dose massima tollerabile (MTD) del BGT226 in tumori solidi avanzati.

Sviluppo di inibitori PI3k per la terapia antitumorale: cosa deve essere fatto

Come nel caso di molti altri inibitori delle kinasi, il primo vero problema è la selettività. Per quanto riguarda la questione di quale livello di selettività sia necessario per in inibitore ideale delle PI3k per la terapia antitumorale, nessuna chiara risposta è a tutt’oggi disponibile e l’ultima prova dovrà venire dalla sperimentazione clinica.

In ogni caso, due punti sono importanti.

Primo, una potente attività inibitrice delle PI3kα è un prerequisito fondamentale perché un inibitore PI3k possa essere un agente anti-cancro ideale per via della connessione stretta tra PI3kα e la genesi dei tumori, metastasi e sviluppo.

Secondo, inibitori che hanno come target non solo il PI3kα ma anche i suoi effettori a valle come ad esempio l’m-TOR sarebbero più efficaci.

I composti PI-103, XL-765, NVP-BEZ235 e BGT-226 sono buoni inibitori duali.

Composti che colpiscono selettivamente target diversi sono più potenti di composti con target singoli e meno tossici degli inibitori non selettivi.

Considerando che i processi cellulari correlati ai tumori sono regolati

attraverso un complesso network di segnali, sarebbe ragionevole

aspettarsi l’applicazione di inibitori selettivi multipli nel trattamento dei vari

tipi di cancro. A parte ciò, combinare inibitori PI3kα con inibitori di altre

chinasi o con altre terapie chimiche o radioterapie risulterebbe

probabilmente di ottima efficacia ed avrebbe un ampio range di applicazioni.

Un altro problema riguarda le proprietà farmacocinetiche degli inibitori delle PI3k per la terapia antitumorale.

Nonostante che entrambe le classi di derivati arilmorfolinici imidazopiridinici contengano inibitori molto potenti delle PI3kα, la mancanza di adeguate proprietà farmacocinetiche non consente alla maggio parte di esse di essere selezionate per la sperimentazione clinica.

L’ottimizzazione degli inibitori PI3k dovrebbe comunque considerare entrambi i parametri: attività e proprietà farmacocinetiche.

Buoni esempi in questo caso sono il PX-866, l’SF-1126 e il GDC-0941.

PX-866 e SF-1126 derivano rispettivamente dallo scheletro del Wortmannin e dell’LY294002. Entrambi hanno migliore proprietà di ADMET e migliori indici terapeutici rispetto ai loro capostipiti.

Per ottimizzazione della tiena[3,2-d]pirimidina (65) si è ottenuto il composto GDC-0941 che oltre a mantenere la potenza possiede migliore stabilità e solubilità.

Conclusioni e prospetti

Buoni progressi sono stati fatti da quando circa 30 anni fa è stata scoperta la via del segnale delle PI3k.

Oggi è chiaro che questa via è cruciale in molte attività cellulari delle cellule neoplastiche. Il ruolo importante della PI3kα in vari processi patologici e la sua frequente mutazione ed amplificazione in una larga varietà di tumori la rende un attraente target per i farmaci antitumorali.

Scoperta, ricerca e valutazione di piccole molecole inibitrici delle PI3k da

utilizzare nella terapia anti-cancro sono attualmente al centro

Nonostante che sia disponibile una quantità veramente limitata di inibitori specifici della PI3kα come il PIK-75, inibitori multipli pan- e selettivi delle PI3k con potente attività inibitoria sulla PI3kα stanno emergendo velocemente.

Una migliore comprensione del meccanismo della via di segnale delle Pi3k e i buoni risultati ottenuti dagli studi preclinici e clinici sono un valido aiuto per lo sviluppo di un numero sempre maggiore di PI3k-inibitori potenti e selettivi e con buone proprietà farmacocinetiche, da utilizzare nella terapia antitumorale.

RINGRAZIAMENTI

Particolari ringraziamenti vanno alla prof.ssa Annalina Lapucci per la sua

disponibilità e gentilezza; alla mia ragazza, Luisa, per essermi sempre

stata vicina e di sostegno nei momenti difficili e di sconforto e per l’amore

che mi ha sempre dimostrato; a mia madre e mio fratello, perché sul loro

affetto ed aiuto posso sempre contare.