Preparazione, vantaggi ed utilizzo di biocatalizzatori immobilizzati

Preparazione, vantaggi ed utilizzo di

biocatalizzatori immobilizzati

Definizione di biocatalizzatori immobilizzati :

Enzimi o cellule che, seppur confinati fisicamente, conservano la loro capacità di catalizzare reazioni chimiche con efficienza

e specificità.

Ricordiamoci che non esiste una procedura universalmente impiegabile per l’immobilizzazione delle cellule microbiche. La scelta deve tener conto di fattori diversi, quali il tipo di cellula e

relativa applicazione, la stabilita’ del sistema e la tecnologia di processo.

Metodiche chimiche

Perché è conveniente immobilizzare un enzima?

PRINCIPALI VANTAGGI DERIVANTI DALLA IMMOBILIZZAZIONE:

•Interazione con il supporto può stabilizzare l’E

•Facilità di separazione dell’E dalla miscela di substrati (S) e prodotti (P)

•Possibilità e facilità di riutilizzo del catalizzatore

•Possibilità di confinare stabilmente un E in un ambiente chimico-fisico molto diverso dall’usuale

Immobilizzare un enzima (E) significa aumentano i costi di produzione! Ne deve valere la pena…

Un E

è spesso un catalizzatore con proprietà diverse

dall’E

Qualunque sia la specifica metodica impiegata per confinare un E nello spazio, le sue proprietà cinetiche o chimico-fisiche potranno risultare alterate

Eimm

Possibilità di condurre delle catalisi in condizioni non convenzionali Possibilità di nuove reazioni

Le caratteristiche fondamentali di una ottimale

procedura di immobilizzazione sono:

- Procedura innocua per la cellula microbica, l’operatore, l’impianto e l’utilizzatore finale;

- Tecnologia semplice;

- Ottenimento di un sistema immobilizzato che abbia lunga vita;

- Procedura economica.

Cellule microbiche immobilizzate in palline di alginato

Immobilizzazione passiva

Colonizzazione:

conseguenza dello sviluppo microbico su un supporto solido,

poroso, in cui risultano coinvolti meccanismi non del tutto chiariti.

Sfrutta la naturale tendenza delle cellule ad aderire ad un supporto solido. Scelta del materiale con approccio empirico! Effetto di shearing del liquido Da 0.001 a 3-4 mm

Adsorbimento:

+ + + + + + Fenomeno questo particolarmente evidente in S.cerevisiae e C.utilis grazie

alla presenza di mannani nella loro parete.

Metodica molto usata nella pratica industriale nei processi che prevedono

l’uso di E in sistemi organici

(lipasi in solventi immiscibili in acqua)

Vantaggi: metodica molto semplice.

Svantaggi:non può essere utilizzata se Eimm deve

Immobilizzazione attiva

a) Legame covalente: si basa sulla

formazione di un legame covalente tra un supporto attivato e la cellula

Legame stabile, no problema di diffusione, possibilita’ di danneggiamento della cellula o di

inattivazione dell’attivita’ enzimatica.

Metodica spesso usata con Saccharomyces

cerevisiae.

Un’altra possibilita’ e’ quella di legare covalentemente un coenzima, un

Metodi di immobilizzazione mediante legami covalenti (1)

Uso di reattivi per il cross-link intermolecolare

Storicamente la prima metodologia di immobilizzazione sviluppata!

Vantaggi: facilità di reazione

Svantaggi: scarsa stabilità meccanica ed idrodinamica

dell’aggregato proteico possibile inattivazione covalente dell’enzima

(es. modifica di gruppi funzionali del sito attivo, irrigidimento della struttura)

Un reattivo frequentemente

impiegato è la glutaraldeide

Essa lega gruppi amminici liberi, molto frequenti sulla superficie delle proteine

Metodi di immobilizzazione mediante legami covalenti (2)

Legame su carrier pre-assemblati

Resine a matrice attivata per il legame covalente e di superficie dei gruppo amminici liberi

Resine attivate con bromuro di cianogeno

Supporti polisaccaridici

Vantaggi: il catalizzatore è confinato sulla superficie

gli addotti hanno proprietà compatibili con processi industriali

Svantaggi: possibile inattivazione covalente dell’enzima ingombro sterico del supporto

(utilizzo di bracci spaziatori per minimizzare gli effetti sterici)

Resine attivate con carbodiimmide

Intrappolamento: prevede l’intrappolamento in matrici

polimeriche, dispositivi a membrana, microcapsule. Le cellule sono miscelate all’agente immobilizzante prima che avvenga la

polimerizzazione.

Spesso non prevede la interazione tra il supporto e l’E (ciò può essere uno svantaggio nel caso in cui queste interazioni stabilizzino l’E_imm). Possibilità di dilavamento del catalizzatore

I pori del gel hanno dimensioni tali da consentire la diffusione del substrato e del prodotto ma non la

Per

l’intrappolamento possiamo usare:

Polimeri sintetici quali la poliacrilammide.

Possibilita’ di controllare la dimensione dei pori! Il monomero puo’ essere tossico per la vitalita’ cellulare. Limitata resistenza meccanica e costi

elevati. Esempio pratico: produzione di acido aspartico da parte di E.coli.

Possiamo

combinare varie metodiche tra di

loro!

Polimeri naturali quali agar, K carragenina, l’alginato.

L’agar mostra una scarsa resistenza meccanica. La K carragenina in molti casi ha sostituito la

poliacrilammide ma I migliori risultati sono stati ottenuti con l’alginato (sfere di 0.2-3 mm di

diametro). L’alginato mostra buone doti di

resistenza meccanica che pero’ possono venir meno in presenza di anioni. Esempio: produzione di

Materiali per la matrice (1)

Alginati

Organizzazione strutturale delle catene di alginato

a seguito della complessazione di ioni Ca

Un esempio di immobilizzazione mediante inclusione: la

preparazione di palline di calcio alginato

L’alginato di sodio forma soluzioni acquose, in cui può essere mescolato l’E da immobilizzare

La miscela viene quindi fatta gocciolare in una soluzione di CaCl₂. Gli ioni Ca++

sostituiscono Na+ _determinando

l’indurimento delle goccioline a formare palline “rigide”

L’immobilizzazione con calcio alginato è reversibile!!

Le palline possono essere ri-disciolte in una soluzione contenente un agente chelante quale EGTA o EDTA

Proprietà e parametri operativi degli E

Resa di immobilizzazione: indica la porzione dell’E che è stato immobilizzato

Stabilità operativa: esprime il numero di processi catalizzati dall’Eimm prima che la sua attività sia dimezzata

Performance: efficienza del processo catalizzato

Effetti di trasferimento di massa sui parametri cinetici

Effetti connessi all’impedimento alla libera diffusione dell’E_imm, dei substrati e dei prodotti di reazione (protoni compresi). Possono

derivare:

•Metodica di immobilizzazione (interazioni tra S, P e supporto)

•Dimensioni del carrier

•Concentrazione dell’E nella particella e sua distribuzione •Composizione del buffer di reazione

Giustificano le eventuali diverse

proprietà cinetiche dell’Eimm rispetto

all’E_free e la diversa dipendenza dell’attività dell’E_imm/pH

E’ fondamentale minimizzare l’impatto di questi

effetti!!!

Esempi di applicazione degli E

Produzione di acido 6-aminopenicillanico (6-APA) da PenG

6-APA è il substrato di partenza per la sintesi chimica delle Pen semisintetiche! L’E (penicillina amidasi o acilasi) è

immobilizzato su carrier mediante legami covalenti

La reazione è condotta in reattori STR dotati di piastre a setaccio che consentono la

separazione dei S/P dall’Eimm

Lo stesso catalizzatore è utilizzato per svariati cicli di produzione finchè l’attività dell’Eimm

non risulta dimezzata

Il CONSUMO di Eimm risulta pari a 10 (mg enzima)/(kg 6-APA prodotto)

Ad alte concentrazioni di PenG (268 mM) l ’ efficacia del sistema e ’ particolarmente elevata. Quando la concentrazione di S si riduce, la velocità di reazione di E_imm scende quasi a 0 per l ’ insorgere di altri fenomeni (inibizione da prodotto)

Esempi di applicazione degli E

Biosensori

Sensore elettrochimico basato su l’attività di un E, ottenuto depositando un sottile strato di E_imm sulla superficie della membrana di un elettrodo. L ’ analita da determinare diffonde nello strato e raggiunge l ’ E che nell’espletamento dl suo ciclo catalitico consuma un S o genera un P rilevabile elettrochimicamente. Il segnale elettrochimica verrà correlato infine alla concentrazione dell’analita nella soluzione incognita

Vantaggi: affidabilità

specificità, sensibilità accuratezza,

facilità d’uso basso costo

Biosensori per la determinazione ematica del glucosio

Sensore elettrochimico basato su l’attività della Glucosio ossidasi

L’E è ridotto durante la reazione; nel riossidarsi genera H₂O₂, la specie attiva elettrochimicamente

Sistemi per il rilascio regolato di insulina Membrana rigonfiabile pH sensibile: permeabile all’H₂O e al glucosio a pH neutro permeabile anche all’insulina a pH acidi

Reservoir contenente b-glucosidasi e insulina

Alte concentrazioni di glucosio determinano elevata attivita’ dell’enzima con innalzamento del pH nella microcapsula

I successi ottenuti nei processi che prevedono l’impiego di microrganismi in forma immobilizzata, hanno reso

competitivo l’utilizzo delle cellule intere rispetto ai singoli enzimi!

Questo approccio assume particolare importanza nei processi in cui ci sia l’esigenza di una continua rigenerazione di

cofattori delle attivita’ enzimatiche. Nel caso delle cellule la rigenerazione dei cofattori e’ una conseguenza del

metabolismo cellulare.

Le tecniche di intrappolamento in polimeri sono risultate soddisfacenti sia nell’attivita’ che nel

reimpiego delle cellule usate coma biocatalizzatori