2 MATERIALI E METODI
2.1 Genotipaggio
Dopo aver effettuato una biopsia a livello della coda degli animali transgenici di cui deve essere determinato il genotipo si procede all’estrazione del DNA genomico. Il tessuto è incubato in 400 ?l di Tail Buffer e lasciato “over night” (o/n) a 50°C. Dopo un passaggio in centrifuga per rimuovere le parti di tessuto non digerite si procede alla precipitazione del DNA con isopropanolo. Successivamente il “pellet” è lavato con etanolo 70% e risospeso in TE (100 mM TRIS pH 8,1 mM EDTA). Mediante PCR con oligonucleotidi specifici per le diverse linee transgeniche i campioni sono successivamente migrati su un gel di agarosio al 1% (peso/volume) e visualizzati con colorazione di etidio bromuro (EtBr) ai raggi UV.
Soluzioni: Tail Buffer Tris pH 8.5 100mM NaCl 200mM SDS 0.2% EDTA 5mM ProteinasiK 1 mg/ml
2.2 Colorazione cromogenica per la
?-galattosidasi
Dopo aver estratto gli embrioni dall’utero della femmina gestante tramite taglio cesario, questi vengono mantenuti in una soluzione salina (1x PBS), e dopo l’estrazione dell’encefalo si procede alla fissazione in una soluzione contenente PBS 1x / formaldeide 2% per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) mantenendo il preparato in lenta agitazione. Successivamente, vengono effettuati tre lavaggi da 5 minuti ciascuno in PBS per rimuovere la formaldeide. A questo punto gli encefali vengono incubati in presenza di xgal nella soluzione di colorazione LacZ a 30°C per un tempo compreso tra 4 ore ed o/n. Al termine della reazione di colorazione gli encefali risultati positivi alla colorazione LacZ sono lavati 3 volte per 5 minuti in PBS prima di essere post fissati in parafolmaldeide (PFA) al 4% in PBS a 4°C o/n.
Soluzioni:
Tampone fosfato salino (PBS):
Nacl 137mM KCL 2.7 mM Na2HPO4 10 mM KH2PO4 2 mM Colorazione LacZ: K4Fe(CN)6 5 mM K3Fe(CN)6 5 mM X-gal 1.0 mg/ml
MgCl2 2 mM
NP40 0.2%
Sodio deossicolato 0.1% PBS 1x a volume
2.3 Taglio dei preparati
Gli embrioni sono fissati o/n in 4% paraformaldeide (PFA) / 1x PBS a 4°C. Successivamente vengono effettuati tre lavaggi da 5 minuti in PBS per rimuovere la PFA. A questo punto i preparati sono equilibrati in 30% saccarosio / 1x PBS a 4°C. Quando è avvenuta l’equilibratura i preparati sono messi nel mezzo di inclusione, “Tissue Tek”, e congelati a –80°C. Successivamente vengono tagliati al criostato. I vetrini porta-oggetto con le sezioni sono conservati a –20°C. Alternativamente, gli embrioni o gli encefali estratti possono essere deidratati in una serie crescente di alcool metilico in PBS fino all’equilibratura in 100% metanolo (MeOH). I preparati così trattati possono essere conservati a –20°C per alcuni mesi ed impiegati in esperimenti di immunoistochimica ed ibridazione in situ “whole mount”.
2.4 Immunoistochimica su sezione
I vetrini vengono lasciati scongelare a RT. Si effettuano lavaggi successivi in PBS per rimuovere il “Tissue Teck”. A questo punto si ha l’incubazione nella soluzione di “blocking” 0.3 % PBT (1x PBS/ 0.3% Triton 100 ), 5% siero di agnello
per 1 ora a RT. Dopodiché si aggiunge alla soluzione di “blocking” l’anticorpo policlonale primario specifico contro LacZ (1:1500),GFP (1:2000) per una incubazione o/n a 4°C. Il giorno seguente i vetrini vengono lavati per 4-5 ore in PBT 0.3% e poi messi in una nuova soluzione di “blocking” contenente l’anticorpo secondario “anti-rabbit” coniugato con rodamina (Cy3, 1:500) e lasciati o/n a 4°C. Il giorno successivo i vetrini sono lavati con PBT 0.3% per 2 ore e successivamente viene aggiunta, per 5 minuti, una soluzione che permette di marcare i nuclei delle cellule (DAPI (1:10000), PBT 0.3%.). A questo punto i vetrini sono lavati prima in PBT per 1 ora e poi passati in acqua per rimuovere l’eccesso di sali. I vetrini sono poi messi ad asciugare e montati con “Aqua Poly-Mount”.
2.5 Ibridazione “in situ”
Per preparare una sonda a RNA è necessario digerire il plasmide contenente il cDNA del gene di interesse con un enzima che taglia una sola volta nel plasmide al 5’ dell’inserto di cDNA in modo da ottenere un frammento di DNA lineare. Questo DNA viene purificato mediante estrazione fenolica e poi utilizzato in una reazione di trascrizione in vitro con la polimerasi che riconosce il promotore posto al 3’ dell’inserto, in modo da ottenere un trascritto “antisenso”.
Si effettua una reazione di trascrizione standard (Melton et al., 1985) usando Sp6, T7 o T3 RNA polimerasi, aggiungendo alla miscela di reazione un ribonucleotide sostituito in posizione 11, con digossigenina. La miscela di reazione viene preparata aggiungendo i reagenti a temperatura ambiente.
Esempio di reazione condotta in 20?l: Tampone di trascrizione 5x 4 ?l DTT 100mM 2 ?l DNA linearizzato (0.5 ?g/?l) 2 ?l Rnase-lnhibitor (40 UE/?l) 0.5 ?l RNA polimerasi 2 ?l Miscela di ribonucleotidi (dNTPs) e UTP-dig 2.5 mM 8?l H2O RF fino a 20 ?l
Per purificare la sonda trascritta dai nucleotidi non incorporati si procede ad una precipitazione alcolica in cui si aggiungono 2.2 ?l di litio cloruro 4M e 66 ?l di EtOH assoluto. Dopo aver mescolato, capovolgendo il tubo diverse volte, si mette il tutto a precipitare a -20°C, per almeno 4 ore, oppure, a -80°C per 1 ora. A questo punto si centrifuga a 12000 rpm a 4°C, per 20 minuti; poi, eliminato il sovranatante, si aggiungono al pellet 100 ?l di EtOH 70% pre-raffreddato e si centrifuga a 12000 rpm a 4°C, per 5-10 min. Si libera, infine, il pellet da tutto l’etanolo residuo, lasciandolo evaporare all’aria a temperatura ambiente e si risospende in 20 ?l di H2O RF (oppure TE pH 7.5 RF). La stima della quantità del trascritto ottenuto viene effettuata mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio, servendosi dell’ausilio di tRNA a concentrazione nota, comemarcatore di quantità. I trascritti possono essere conservati in “stock” 10X (10 ?g/ml) nella miscela di ibridazione.
Cloni usati per l’ibridazione in situ
Brn 3.2: linearizzato con Xho; trascritto con T7. GFP: linearizzato con Not1; trascritto con T7.
2.5.1 Ibridazione in situ “whole mount”
L’ibridazione viene realizzata in tubi “vials” di vetro e gli encefali vengono mantenuti nelle “vials” per tutta la durata dell’esperimento. E’ importante che tutte le soluzioni ed i materiali usati, fino al termine della ibridazione, siano “RNasi free” (RF); la vetreria viene trattata in stufa a 180°C per almeno 4 ore mentre l’acqua distillata e le altre soluzioni vengono sterilizzate in autoclave.
Tutti i passaggi, se non diversamente indicato, sono eseguiti sistemando i “vials” orizzontalmente su un agitatore, aggiungendo e rimuovendo ogni volta 5 ml circa di soluzione. I preparati vengono prima reidratati, effettuando lavaggi di 5 min. ciascuno, in una serie decrescente di alcoli:
MetOH 100%
MetOH 95% + H2O 5% MetOH 60% + H2O 40% MetOH 30% + H2O 70% PBT per 3 volte
A questo punto gli encefali sono trattati con una soluzione H2O2 al 6% in PBT. Segue trattamento in una soluzione di 10 ?g/ml di proteinasi K in PBT e si incuba, a RT, per 20 minuti, senza agitazione. Si lava quindi 2 volte per 5 min., sempre a RT, in PBT. I preparati vengono quindi rifissati in 0.2% glutaraldeide / 4% PFA a RT in
agitazione. Seguono 3 lavaggi in PBT, di 5 min. ciascuno. Si rimuove quindi il PBT da ogni tubo e lo si sostituisce con miscela di preibridazione, disponendo i tubi sull’agitatore verticalmente per un tempo che va da 2 a 4 ore a 65°C. Si sostituisce, infine, con di tampone di ibridazione addizionato con la sonda marcata alla concentrazione finale di 0.5-1 ?g/ml e si ibrida a 65°C o/n.
Il giorno successivo vengono effettuati i lavaggi per rimuovere l’eccesso di sonda non ibridata o ibridata in maniera aspecifica; si fanno a tale scopo lavaggi in 3 soluzioni a stringenza ionica crescente.
- 2 lavaggi per 30 minuri in soluzione 1 a 65°C
- lavaggio in soluzione 1 e soluzione 2 (1:1) per 10 minuti a 65°C - seguono 3 lavaggi in soluzione 2°di 5 min. ciascuno a RT
Il lavaggio successivo si effettua in soluzione 2 addizionata di RNasi A, a concentrazione finale di 100 ?g/ml, a 37°C per 1 ora. Per rimuovere l’RNasi, si lava in soluzione 2 a RT per 5 min e una volta in soluzione 3 a 65°C, per 5 minuti. Si fanno altri due lavaggi di 1 ora ciascuno a 65° C sempre in soluzione 3 Prima di iniziare la procedura di incubazione con anticorpo, si lava due volte in MAB a RT per 10-15 minuti. Segue una preincubazione di 1 ora a RT in 0.5 ml di MAB + 2% reagente bloccante + 5%. siero di pecora. Si incuba per tutta la notte a 4°C in presenza di un anticorpo specifico anti digossigenina (1:8000), diluito in una soluzione di MAB + 2% reagente bloccante + 5% siero di pecora . Per rimuovere l’eccesso di anticorpo dagli encefali si effettuano lavaggi con MAB a RT di 60 minuti ciascuno per tutto il giorno.
Dopo l’ultimo lavaggio viene aggiunto il tampone per la fosfatasi alcalina (APB), 3 volte per 15 minuti. Nell’ultimo lavaggio con l’APB si aggiunge Levamisole (0.0005 gr/ml), una sostanza in grado di inibire le fosfatasi endogene .
Si aggiungono infine alla soluzione i substrati cromogeni NBT e BCIP (3.5
?l/ml di ciascun substrato) in APB. In questa fase la fosfatasi alcalina coniugata all’anticorpo scinde il substrato generando un prodotto colorato che rende possibile evidenziare le zone in cui la sonda si è ibridata evidenziando l’espressione del gene in esame. Se il segnale è soddisfacente si procede bloccando la reazione cromogenica rimuovendo il tampone per la fosfatasi alcalina e fissando o/n con PFA al 4% per stabilizzare la colorazione. Gli embrioni così fissati possono essere conservati in PBT/EtOH a 4°C. Soluzioni: Tampone di ibridazione Formammide 50% SSC 5x tRNA 100?g /ml Eparina 50 ?g/ml SDS 1%
MAB (Maleic Acid Buffer) pH 7.5
NaCl 150 mM ò Soluzione1 Formammide 50% SSC 5x SDS 1% H2O a volume Soluzione 2 NaCl 0.5M Tris HCl pH 7.5 0.01M Tween 20 0.1% H2O a volume Soluzione 3 Formammide 50% SSC 2x SDS 0.1% H2O a volume
Tampone di reazione cromogenica della fosfatasi alcalina (APB)
Tris 100 mM pH 9.5
MgCl2 50 mM
NaCl 100 mM
Tween 20 0.1 %
2.5.2 Ibridazione in situ su sezione
I vetrini vengono lasciati scongelare a RT. Si effettuano lavaggi successivi in PBS per rimuovere l’eccesso di “Tissue Teck”. Su ogni vetrino vengono aggiunti 200
?l di “Hybridisation buffer” addizionato con la sonda marcata alla concentrazione finale di 0.5-1 ?g/ml e si ibrida a 65°C o/n. Si effettuano 4 lavaggi con “washing solution” per 30 minuti ciascuno a 65°C. Successivamente si fanno 2 lavaggi con MAB per 30 minuti ciascuno a RT. Segue una preincubazione di 1 ora a RT in MAB + 2% reagente bloccante + 20%. siero di pecora. Si incuba per tutta la notte a 4°C con anticorpo antidigossigenina (1:4000), diluito in una soluzione di MAB + reagente bloccante 2% reagente bloccante + 20%. siero di pecora. Per rimuovere l’eccesso di anticorpo dalle sezioni si compiono lavaggi con MAB a RT di 60 minuti per 4 ore. L’ultimo lavaggio viene sostituito con il tampone per la fosfatasi alcalina (APB), 2 volte per 10 minuti. Nell’ultimo lavaggio con l’APB si aggiunge Levamisole (0.0005 gr/ml), una sostanza in grado di inibire le fosfatasi endogene .
Si aggiunge infine la soluzione di rivelazione composta da NBT e BCIP (3.5
bloccando la reazione cromogenica rimuovendo il tampone per la fosfatasi alcalina e lavando i vetrini in PBT. A questo punto si effettua un passaggio veloce in acqua per rimuovere l’eccesso di sali dalle sezioni che successivamente vengono lasciate asciugare all’aria e poi coperte con vetrino copri oggetto ed un montante tipo “Eukitt”.
Soluzioni: Hybridisation buffer: 10 x salt 1 x Formammide 50% Solfato di destrano 10% rRNA 1 mg/ml 100x Denhardt’s 1x H2O a volume Washing solution: Formammide 50% SSC 1x Tween 20 0.1%
2.6 Immagini
I preparati sono stati analizzati con un microscopio Nikon ed uno
stereomicroscopio. Le immagini sono state acquisite con fotocamera “CoolSnap” Photometric. Le tavole delle figure sono state ottenute impiegando software di grafica tipo Photoshop e programmi dedicati per la sovrapposizione delle immagini in
