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2. Scopo della ricerca
Al fine di disporre di una metodica sperimentale in grado di rilevare il danno e/o l’eventuale protezione nei confronti di episodi di ischemia-riperfusione e più adatta a studi di screening su ampie serie di farmaci rispetto alle classiche metodiche funzionali (ad es. cuore perfuso secondo Langendorff, infarto in vivo mediante legatura coronarica), è stata impiegata una linea cellulare di cardiomioblasti di ratto (H9c2) sulla quale è stata messa a punto la procedura per la valutazione dell’azione protettiva di attivatori dei canali KATP mitocondriali e di
ligandi selettivi del recettore β estrogenico nei confronti dell’insulto ischemico.
A tale scopo è stato ottimizzato un metodo utile ad indurre livelli misurabili e ripetibili di danno ischemico sulle cellule. Il protocollo sviluppato prevede che le cellule H9c2 siano sottoposte ad ischemia sotto flusso di diazocarb (miscela al 95% di N2 e 5% di O2) in mezzo
di coltura contenente basse concentrazioni di glucosio e deprivato del siero fetale bovino per 16 ore, al termine delle quali si procede alla riossigenazione (riperfusione) per un periodo di 2 ore. La valutazione del danno ischemico viene effettuata con metodiche
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spettrofotometriche tramite test di vitalità cellulare, come l'uso di WST-1 (water solubile tetrazolium).
L’attività si è concentrata sul disegno e la caratterizzazione farmacologica di nuovi potenziali attivatori di canali del potassio ATP-sensibili (KATP), che abbiano applicazione in ambito
cardiovascolare come anti-ipertensivi e/o cardioprotettivi.
Per individuare meglio il meccanismo di tali canali, il target della nostra indagine si è spostato dal canale sarcolemmatico a quello mitocondriale quale potenziale bersaglio implicato nel fenomeno del precondizionamento ischemico a livello cardiaco. Secondo tale fenomeno, a livello miocardico, episodi ischemici di lieve entità esercitano un’azione protettiva, nei confronti di una ischemia successiva più intensa. Gli attivatori dei canali KATP mitocondriali
(mitoKATP ) si sono mostrati in grado di mimare l’azione esercitata da
brevi periodi ischemici e quindi di simulare il precondizionamento ischemico. Al fine di ottenere composti KATP attivatori in grado di
raggiungere il target mitocondriale sono state disegnate molecole strutturalmente correlate al nucleo benzopiranico di un KATP attivatore
di riferimento, il cromakalim, ma con opportune modifiche a livello del pattern di sostituzione sull’atomo C-4, in analogia con molecole canali mitocondriali.
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Da tale osservazione è nata una classe di derivati spirociclici del nucleo benzopiranico recanti un anello morfolinico o morfolonico variamente sostituiti. La presenza di un centro chirale sulla molecola ha indotto a separare la miscela racemica e assegnare la configurazione assoluta ai due enantiomeri, per poterne esaminare le proprietà cardioprotettive separatamente. Attraverso la metodica di Langendorff è stato dimostrato che l’enantiomero levogiro (S)-(-)-2,2-Dimetil-N-(4’-acetamido-benzil)-4-spiromorfolone-cromano (vedi Figura 23) è l’unico dotato dell’attività cardioprotettiva anti-ischemica, che è quindi un effetto “enantioselettivo” (Rapposelli et al., 2009). O N O O NHAc
Fig.23 L’enantiomero levogiro
(S)-(-)-2,2-Dimetil-N-(4’-acetamido-benzil)-4-spiromorfolone-cromano.
L’approfondimento farmacologico su questo derivato spirociclico (in miscela racemica) è stato eseguito, in questo lavoro di ricerca, attraverso lo studio cellulare su cardiomioblasti di ratto (H9c2).
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Il modello messo a punto è servito anche per proseguire lo screening di altri composti benzopiranici, nei quali l’anello morfolonico viene rimpiazzato con l’anello ossazolidinico, composti dotati di una maggiore rigidità conformazionale e potenzialmente in grado di mostrare una maggiore specificità per il sottotipo mitocondriale (Rapposelli et al., 2009) (vedi Figura 24).
O N O O NHSO2Me F 276 O N O O NHSO2Me NH Br F 245 O N O O NHCOMe F 278 O N O O NHCOMe F 246 NH
91 O N O O NHCOMe F 279 Br O N O O NHCOMe NH Br F 247 O N O O NH2 MM 107
Fig.24 Strutture della nuova serie di spirocicli morfolinici e ossazolidinici
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Il solfuro d’idrogeno (H2S), una molecola gassosa che fin’ora era nota
solo come agente tossico, sta emergendo quale modulatore endogeno che condivide con l’ossido d’azoto (NO) quasi tutti i suoi effetti benefici sul sistema cardiovascolare, senza però costituire una fonte di metaboliti tossici. Al contrario, H2S mostra un profilo di antiossidante
tipico dei solfuri organici ed inorganici, rivestendo così, realmente un ruolo di scavenger delle specie reattive dell’ossigeno. Attualmente non disponiamo di una conoscenza esauriente di tutti i ruoli biologici esercitati da questo gas. Ci sono però evidenze inconfutabili circa l’attivazione dei canali del potassio KATP da parte di H2S. Questo
meccanismo specifico sta alla base degli effetti cardioprotettivi esercitati da H2S contro il danno miocardico da ischemia/riperfusione.
Sono stati ipotizzati altri meccanismi rilevanti, sia endotelio-dipendenti che endotelio-inendotelio-dipendenti ma la loro natura è ancora poco chiara. Dati recenti indicano una possibile correlazione fra l’alterazione del sistema dell’H2S e il progredire della condizione di
disfunzione endoteliale, suggerendo l’esistenza di un cross-talk fra H2S e NO. Le proprietà biologiche di H2S sono dunque un’ importante
crocevia tra le caratteristiche di NO e il ruolo fisio-farmacologico dei canali del potassio.
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Quindi, sempre utilizzando la stessa metodica di ischemia/riperfusione su cellule H9c2, per individuare meglio il meccanismo d’azione dell’H2S, la ricerca è stata improntata sull’analisi di composti in grado
di donarlo, ed in particolare è stata valutata l’attività di NaHS, comunemente usato in ricerca come donatore di H2S.
NaHS è infatti una fonte esogena e un donatore rapido dell’H2S. E’
stato stimato che da questo sale, tramite una reazione acido-base, si liberi in condizioni fisiologiche di pH e temperatura circa un 20% di H2S. Pertanto il meccanismo di rilascio è legato a fattori che
influenzano il pH e risulta indipendente dal substrato.
Per analizzare in modo dettagliato la componente mediata dai canali del potassio nel rilascio di H2S da parte di suddetti donatori e quindi
anche l’attività dei nuovi modulatori esogeni dei canali mito-KATP,
sono stati utilizzati dei bloccanti di tali canali, in particolare il 5-HD, molecola più rappresentata tra gli antagonisti, descritta in precedenza (Ashcroft and Ashcroft, 1990).
Il ruolo e l’importanza relativa dei mediatori e degli effettori endogeni coinvolti nell’IPC, possono essere inoltre modulati dal quadro endocrino ed in particolare dagli ormoni gonadici (Mendelsohn and Karas, 1999).
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Recenti evidenze sperimentali suggeriscono infatti che un ruolo di effettore/mediatore diretto dell’IPC possa essere attribuito agli estrogeni (Wang et al., 2008), accanto alla loro capacità di modulare positivamente per via indiretta altri effettori/mediatori (Mendelsohn and Karas, 1999).
Gli estrogeni esplicano la loro azione biologica interagendo con i sottotitpi recettoriali alfa (ER-α) e beta (ER-β), entrambi presenti nei miociti (Mendelsohn and Karas, 1999; Babiker et al., 2002).
Recentemente, ER-β è diventato un interessante bersaglio farmacologico, capace di esercitare i classici effetti benefici degli estrogeni sul sistema cardiovascolare. Inoltre, le attività positive mediate dal sottotipo ER-β sono prive degli effetti indesiderati proliferativi mediati dall’ER-α sulla mammella e sull’utero (Dahlman-Wright et al., 2006).
Sulla base di queste considerazioni, sono stati sintetizzati interessanti esempi di ligandi non steroidei per ER-β, che possiedono analogie strutturali con quelli naturali (genistein) o composti sintetici (DNP, ERB-041, indazoli) e dotati di specifica attività agonista ER-β. Tra le nuove classi chimiche sintetizzate, sempre sullo stesso modello sperimentale simulando l’insulto anossico, sono state valutate alcune monoaril-salicilaldossime sostituite (vedi Figura 25) che mostrano
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promettenti proprietà di agonisti selettivi di ER-β e quindi una potenziale attività cardioprotettiva (Minutolo et al., 2008; Minutolo et al., 2009).
Fig.25 Struttura delle monoaril-salicilaldossime sostituite valutate. TM-33 F OH Cl O H N HO TM-34 F OCH3 Cl O H N HO TM-18 OH H O N HO TM-20 OCH3 H O N HO FS-95 OH Cl O H N HO
