2. MATERIALI E METODI
2.1 CRITERI DI INCLUSIONE E METODOLOGIA
Il nostro lavoro si è svolto in tre fasi:1) Il prelievo di sangue da animali sani al fine di ottenere dei dati di confronto
2) Il reperimento di soggetti cardiopatici
3) Questionario da far compilare ai proprietari per valutare la qualità di vita dei soggetti cardiopatici
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CAMPIONAMENTO CANI SANI
Sono stati presi in esame 13 cani clinicamente sani, di proprietà, condotti all’ambulatorio “Croce Blu” a Livorno per il richiamo vaccinale o per controlli. A tali soggetti è stato effettuato un prelievo di sangue, previo consenso informato del proprietario, al fine di valutare il valore basale della tiamina con la metodica HPLC
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da noi adottata.
Come confronto, inoltre, abbiamo utilizzato anche i dati riportati nel lavoro di Tran et al(36) dove è stata utilizzata la stessa metodica di misurazione della
tiamina, tramite l’HPLC, su 64 cani di cui 31 maschi e 33 femmine, di età compresa tra 1 e 8 anni (media 4.5 anni), di peso tra 9,2 kg – 40.4 kg (media 24,8 kg). Gli autori non hanno riportato le razze dei cani esaminati. Ai 13 soggetti sani sono stati prelevati campioni di sangue intero in IDEXX VetCollect® EDTA tube Laboratories Ltd (Buckinghamshire,United Kingdom) dopo un digiuno di 12 ore. La difficoltà di reperire la casistica, anche degli animali sani, era infatti legata alla necessità di questo periodo di digiuno che ha fatto si che molti soggetti sani e cardiopatici dovessero essere scartati dal campionamento.
2.1.2 CAMPIONAMENTO CANI CARDIOPATIC
Per que ni cardiopatici.I
sto lavoro sono stati scelti 27 ca ¾ Sesso: 15 maschi e 12 femmine ¾ Fascia di età: tra 3 anni‐ 17 anni, con la media di 10,22 anni ¾ Peso: tra 3,2 kg – 72 kg , con la media di 16,26 kg, la mediana è 10.6 kg ¾ Razze: 12 Meticci, 5 Barbone nano, 3 Yorkshire Terrier, 2 Dobermann, 1 Dogue de Bordeaux , 1 Setter Inglese, 1 Epagneul Breton e 1 BassottoTutti i soggetti sono stati sottoposti a visita clinica specialistica al fine di classificare la cardiopatia: tale visita comprendeva, oltre all’esame obiettivo generale e particolare degli apparati con particolare riferimento al cardiocircolatorio, l’esecuzione dell’ecocardiografia per la classificazione iniziale della classe cardiaca.
I cani cardiopatici appartengono tutti a classe C: ¾ 5 appartengono a classe C1
¾ 14 appartengono a classe C2 ¾ 8 appartengono a classe C3
Si ricorda che la classe C, secondo la classificazione di CHIEF “Canine Heart International Expert Forum” (che non è ancora adottata ufficialmente), sono compatibili con le classi ISACHC
C1: IB C2: II C3: IIIA
Tutti i soggetti erano in trattamento farmacologico da oltre un mese (come si può vedere nella tabella qui sotto riportata), compresa sempre la furosemide a dose variabile da 0.69 mg/kg fino a 4.16 mg/kg con la mediana a 1.76 mg/kg a seconda della gravità della sintomatologia. Tab.2.1. – Trattamento a cui erano sottoposti i soggetti cardiopatici esaminati 2a Lucky
Benazepril 2,5 mg‐ ½bid, Furosemide 10 mg‐ 1 ¼ bid, Pimobendan 1,25 mg sid, Spironolattone 6 mg sid. Lucky Amiodarone 200 mg bid, Enalapril 20 mg‐ ½ bid, Furosemide 10 mg bid, Digossina bid. Lulù Benazepril 2,5 mg‐ ½ bid, Pimobendan 1,25 mg sid, Spironolattone 8 mg bid, Furosemide 20 mg ‐ ¾ bid. Ciranò Furosemide/Spironolattone bid, Enalapril 20 mg bid. Tyson
Benazepril 20 mg bid, Furosemide 80 mg, Prilattone 80 mg sid, Cerotto nitroglicerina 10 mg per 3 gg, Digossina 0,25 mg bid. Olivia Ramipril 2,5 mg bid, Furosemide 20 bid, spironolattone 25 mg /idroclorotiazide 25 mg bid, Pimobendan 1,25 mg bid. Snoopy Furosemide 20 mg bid, Enalapril 5 mg sid. Bobi Enalapril 5 mg bid, Furosemide 10 mg bid, Spironolactone 5 mg bid, Vetemedin 5 mg sid. Cerotto nitroglicerina 10 mg, bid per 3 gg. Peppi Ramipril 1,25 ½ sid, Pimobendan cps 1,2 bid, Furosemide 10 mg bid, Spironolattone 15 mg bid. Peggy Ramipril 2,5 ¾ bid, Furosemide 20 bid, spironolattone 25 mg bid, Pimobendan 2,5 mg bid. Stella Pimobendan 2,5 mg bid, Enalapril 5 mg bid, Furosemide 20 bid. Chicco Ramipril 1,25 bid, Furosemide 20 mg bid, Spironolactone 40 mg ½ sid. Zizou
Ramipril 5 mg bid, Pimobendan 5 mg sid, Furosemide 80 mg bid, Spironolactone 100 mg tid.
Duccio Ramipril 1,25 mg bid, Spironolactone 40 mg ½ bid, Furosemide fiale tid da 2 gg, bid. Cerotto nitroglicerina da 2 gg, Furosemide 20 mg Criss Ramipril 2,5 mg ½ sid, Furosemide cpr 3/4 bid. Thomas Enalapril 2,5 mg bid, Furosemide 20 mg ¼ bid, Pimobendan 1,25 mg sid. Leo Furosemide 20 mg bid, Digossina 0,25 mg ½ bid, Spironolactone 40 mg bid. Ken Amlodipina 1 mg sid , Benazepril 2,5 mg ½ sid, Furosemide 20 mg ¼ bid. Diana Benazepril 5 mg ½ bid, Furosemide 20 mg ¼ bid. Lucky Benazepril 5 mg ½ sid, Furosemide 20 mg ½ bid. Birba Furosemide 80 mg ¼ bid. Mito Benazepril 2,5 mg ½ sid, Furosemide 25 mg ¾ bid, Pimobendan 1,25 mg ½ bid. Ares Benazepril 20 mg 1 ½ sid, Furosemide 80 mg ¾ bid.
Molly Enalapril 20 mg sid, Furosemide 20 mg bid, spironolattone 25 mg bid. Luna Pimobendan 5 ½ sid, Ramipril 2,5 mg sid, Furosemide 80 mg ½ sid. Margot Benazepril 5 mg bid, Furosemide 20 mg ½ bid. Chicca Benazepril 5 mg ½ sid, Furosemide 20 mg ¼ bid.
2.1.3 VISITA ARDIOLOGICA
Come riportato nel capitolo 1.3 ogni visita clinica cardiologica comprende la di:
C
valutazione ¾ Anamnesi ¾ Respiro ¾ Mucose apparenti ¾ Palpazione della regione cardiaca ¾ Polso femorale ¾ Estremità degli arti ¾ Palpazione dell’addome ¾ Auscultazione cardiaca2.1.4 VALUTAZIONE ECOCARDIOGRAFICA
Per completare la diagnosi di Endocardiosi Mitralica, l’uso di ecocardiografia è un ausilio indispensabile.Le varie informazioni utili si possono ottenere utilizzando diverse tecniche ecocardiografiche: monodimensionale (M‐MODE), bidimensionale (B‐MODE), e doppler (spectral e color).
Le immagini ottenute derivano da proiezioni in asse lungo (sezione parallela all’asse lungo del cuore), in asse corto (sezione perpendicolare all’asse lungo del cuore), e quattro camere (sezione parallela alla superfici dorsale e ventrale del corpo).
Le scansioni ecotomografiche migliori per la valutazione bidimensionale della valvola mitralica sono costituite dall’asse lungo 4 camere parasternale da destra, dall’asse corto da destra all’altezza della mitrale e dalle proiezioni in asse lungo apicale da sinistra (39).
I VALORI PRESI IN CONSIDERAZIONE CON L’ECOCARDIOGRAFIA SONO:
ESVI: END SYSTOLIC VOLUME INDEX, rappresenta il volume del ventricolo sinistro in telesistole indicizzato per la superficie corporea, fornisce indicazioni sulla capacità contrattile ed espulsiva della camera ventricolare sinistra.
EDVI: END DIASTOLIC VOLUME INDEX, rappresenta il volume del ventricolo sinistro in telediastole indicizzato per la superficie corporea, fornisce informazioni circa le variazioni di precarico ventricolare sinistro.
Ao/AS: rappresenta il rappo to t a diametro dell’ aorta e dell’ atrio si ist o r r n r .
FE%: frazione di eiezione, che esprime la differenza percentuale tra il volume diastolico e quello sistolico. Si calcola sottraendo dal volume diastolico quello sistolico, si divide poi il risultato p r il volume diastolico e si moltiplica per 100. e FA%: frazione di accorciamento del ventricolo sinistro per stimare la funzione sistolica globale del medesimo. I valori percentuali, normalmente compresi tra il 30% e il 40% con variazioni dovute all’età ed alla morfologia ventricolare sinistra, possono essere usati come indice della funzione del ventricolo sinistro.
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CAMPIONI DI SANGUE PER L’ANALISI DELLA TIAMINA Ogni campione di sangue intero, sia nei 13 cani sani che nei 27 cardiopatici, è stato preso con l’animale a digiuno da 12 ore e raccolto in IDEXX VetCollect®
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EDTA tube Laboratories Ltd (Buckinghamshire,United Kingdom). I campioni sono stati congelati a ‐20°C dopo una veloce centrifugazione di 30 secondi e numerati con il nome del cane e numero di cartella clinica.Le analisi in laboratorio venivano effettuate in tre sedute diverse. Come descritto per il kit, i campioni possono essere mantenuti in congelatore per oltre un anno.
I nostri campioni sono stati mantenuti in freezer per la massima durata di 3 mesi. Dopodiché i campioni sono stati analizzati come descritto in seguito nel
aragrafo 2.7. p
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QUESTIONARIO I PROPRIETARI
Ai proprietari dei cani cardiopatici veniva chiesto di compilare un questionario al fine di valutare la qualità della vita dei soggetti; in tale questionario erano presenti le 5 domande riportate sotto. Premesso che tali domande fanno parte del completamento della parte anamnestica della visita, in tal modo, è stato dato particolare risalto a questo aspetto per focalizzare l’ attenzione sullo stato di salute del cane. A nostro arbitrio, facendoci guidare dall’esperienza clinica,
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A
abbiamo poi dato un punteggio da 1 a 5 alle risposte. 1 – molto negativo, 3 – normale/buono, 5 ‐ molto positivo.
Da quando si è presentato il problema cardiaco, come valuta il comportamento e lo stato generale del cane 1 Negativo 2 3 Norma Buono le/ 4 5 Positivo Valutazione globale del cane 1 2 3 4 5 Vitalità / vivacità 1 2 3 4 5 Appetito 1 2 3 4 5 Tolleranza allo sforzo 1 2 3 4 5 Tosse / affanno 1 Tossisce tutto il giorno 2 Tossisce abbastanza 3 Tossisce solo di mattina/ sera 4 ce Tossis poco 5 Non tossisce
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FUNZIONALITA’ RENALE
In 18 cani cardiopatici sul totale di 27 sono stati effettuati anche ulteriori analisi per valutare la funzionalità renale con la valutazione di urea e creatinina plasmatiche e gli elettroliti (sodio, potassio, calcio ionizzato).
2.1.8 VALUTAZIONE DEI LIVELLI DELLA TIAMINA DIFOSFATO
ON L’HPLC
C
Per la valutazione quantitativa è stato utilizzato un kit della CHROMSYSTEMS –DIAGNOSTICS BY HPLC & LC‐ MS/MS® (München, Germany) composto da: ¾ Fase mobile , 1000 ml ¾ Tampone di estrazione, 10 ml ¾ Reagente di precipitazione, 30 ml ¾ Reagente derivatizzante 1 (liofilizzato), 5 x 0,3 ml ¾ Reagente derivatizzante, 2, 20 ml ¾ Reagente neutralizzante, 10 ml ¾ Reagente stabilizzante, 10 ml ¾ Standard di calibrazione sangue intero vitamina B1/B2 (liofilizzato), 5 x 1 ml ¾ Provette di reazione protette dall’esplorazione alla luce, 100 pz. STRUMENTAZIONE
Le analisi dei campioni di plasma sono state condotte utilizzando un sistema HPLC costituito da una pompa JASCO 880 PU (JASCO, Tokio, Japan) e da un rivelatore fluorimetrico JASCO 821‐FP (JASCO, Tokio, Japan) settato ad una lunghezza d’onda di eccitazione di 367 nm e una lunghezza d’onda di emissione di 435 nm, utilizzando un’ attenuazione di 16 e un gain di 1000.
Lo strumento è stato interfacciato ad un personal computer tramite interfaccia Hercule 2000 (JMBS, Inc., Bear, USA) e l’integrazione dei picchi è stata effettuata tramite software Jasco Borwin (JASCO, Tokio, Japan).
ALTRE SPECIFICHE Linearità: 10‐200 µg/l Limite di rivelabilità: 15 µg/l Riproducibilità intradosaggio: ~ 4 % ntrerdosaggio: ~ 6 % Riproducibilità i Recupero: 93% Separazione cromatografica: ‹ 5 min. CAMPIONI ono stati analizzati 27 campioni di cani cardiopatici e 13 campioni di cani sani. S
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Ogni campione di sangue intero in EDTA è stato analizzato in tal modo: ¾ Aggiunta al 200 µl di sangue intero EDTA 100 µl di tampone di estrazione ¾ Mescolato per 2 secondi con vortex ¾ Aggiunto di 300 µl di reagente di precipitazione ¾ Vortex per 30 secondi ¾ Centrifugazione a 9000 x g per 5 minuti¾ Preparazione di 200 µl di soluzione derivatizzante in una provetta di reazione ¾ Aggiunto di 100 µl del supernatante ottenuto nella fase precedente ¾ Aggiunto di 100 µl di reagente neutralizzante ¾ Aggiunto di 100 µl di reagente stabilizzante ed agitazione ¾ Incubazione per 30 minuti ¾ Iniettazione di 50 µl nel sistema HPLC
