3. FITOCHIMICA DEL GENERE Pulsatilla

3. FITOCHIMICA DEL GENERE Pulsatilla

Evidenti ricerche e studi condotti (Shimizu, M.,1978) e (Ye, W. C., 1995) suggeriscono che le funzioni farmacologiche delle specie di Pulsatilla sono dovute principalmente al loro contenuto di composti bioattivi:

-SAPONINE TRITERPENOIDICHE -FLAVONOIDI

Le saponine triterpenoidiche sono abbondanti in molte famiglie delle Dicotiledoni, tra cui le Ranunculaceae (Trease and Evans 1989).

La capacità di idrolisi delle membrane biologiche le rende biologicamente molto interessanti come potenziali agenti anticancro e come bloccanti dei canali ionici (Waller and yamasaki, 1996), ma anche come antiinfiammatori, immunostimolanti e vaso protettori.

In ordine di importanza, i primi tra questi sono proprio le saponine triterpenoidiche.

3.1.1. SAPONINE TRITERPENOIDICHE NEL GENERE Pulsatilla

Questi composti bioattivi sono dei glicosidi costituiti da una parte zuccherina ( glicone ) che è solubile in acqua e una parte non zuccherina, detta aglicone che può essere uno steroide lipofilo ( C₂₇) o un triterpenoide ( C₃₀). Questa asimmetria di idrofobicità/idrofilicità significa che esse hanno la capacità di rendere più bassa la tensione superficiale, esse sono dei veri e propri saponi. Formano soluzioni acquose molto schiumose e causano emolisi del sangue degli eritrociti. (Harborne J. B., 1999).

Proprio per questa attività e per la loro particolare struttura, sono reputate essere responsabili nel trattamento dell’amebiasi intestinale, malaria, trichomonias

vaginale e altre infezioni batteriche a livello intestinale.

Sono distribuite ampiamente in questo genere di piante soprattutto nei rizomi e nelle parti aeree

3.1.2. BIOSINTESI DELLE SAPONINE TRITERPENOIDICHE

La biosintesi origina da 2 molecole di farnesyl PP, dimerizzano, per opera dell’ enzima squalene sintetasi.

La reazione avviene “testa-testa”, formando il precursore più importante nella biosintesi dei triterpeni: lo squalene.

Durante questo processo si ha la perdita di un protone dal C-1 di una molecola di FPP e l’aggiunta di un altro protone dall’ NADPH, portando così alla formazione di un intermedio ( il presqualene difosfato ) caratterizzato dalla presenza di un ciclopropano. Perdendo poi il difosfato dal presqualene, si forma un catione primario che subisce un riarrangiamento Wagner-Meerwein 1,2-alchil shift generando un carbocatione secondario più stabile:

Dalla rottura del legame originale C1-C3’, si forma un catione allilico; la

biosintesi dello squalene è completata dall’aggiunta di un idrogeno dall’NADPH. La biosintesi dei triterpeni prende il via dalla ciclizzazione dello squalene con la presenza di un enzima catalizzatore (una flavoproteina) e di un cofattore

(NADPH), generando lo squalene-2,3-ossido.

Quest’ultimo, ripiegato e posizionato da una ciclasi di superficie, comincia ad assumere la struttura di un triterpene policiclico: protosteryl catione.

La biogenesi dei triterpeni pentaciclici consiste in un riarrangiamento di Wegner-Meerwein a carico del dammarano e conduce agli scheletri più importanti quali quelli del lupano, dell'oleanano e dell' ursano, che sono gli scheletri maggiormante rappresentati nelle saponine triterpenoidiche, quali la -amirina e

β-amirina:

3.1.3. CARATTERISTICHE DELLE SAPONINE NEL GENERE Pulsatilla

La maggior parte dei composti triterpenici nel genere Pulsatilla sono riconducibili al nucleo del lupano e oleanano come scheletri dell’aglicone. Questi si formano espandendo il protosteryl catione,determinando l’anello D e ciclizzando con il sostituente R attraverso riarrangiamenti Wagner-Meerwein 1,2-shift.

Si ottiene così un carbocatione secondario ( lupenyl catione ) che, liberando un protone, determina la formazione del lupeolo.

Dal lupenyl catione con riarrangiamenti Wagner-Meerwein 1,2 alchil-metil shift e grazie all’attività enzimatica e alle interazioni 1,3 diassiali, si forma un

carbocatione terziario: l’oleanyl catione.

Il genere Pulsatilla contiene quindi triterpeni (C₃₀) pentaciclici ossia con 5 anelli di cui tutti a 6 C oppure 4 a 6C e 1 a 5C

O H CH₃ C H₃ CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ H CH₃ CH₃ OLEANANO HO CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ C H₃ LUPANO 1 2 3 4 5 ₆ 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 1 2 3 ₄ 5 ₆ 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 30 29 30

Ricerche fitochimiche hanno valutato che i triterpeni glicosidici di tipo oleanano sono presenti nel genere Pulsatilla, come P. ambigua,P. patens var.multifida, P. cernua, P. dahurica, P. koreana, P. turczaninovii.

In posizione 3 compare sempre un gruppo ossidrilico (-OH) mentre in posizione 4,8,10,14,17 e 20 ci sono sempre metili (-CH₃). Sul C₁₂ dello scheletro del lupano, con un riarrangiamento Wagner-Meerwein 1,2-shift dell’ H, si forma un

doppio legame costituendo così la βββ-amyrina. β

CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ C H₃ CH₃ O H 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20₂₁ 22 23 25 27 28 29 30 β-AMYRINA 24 26

Quest’ultima è lo scheletro di un altro aglicone presente in alcune specie del genere Pulsatilla: l’hederagenina

CH₂OH CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ C H₃ CH₃ RO O OR 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20₂₁ 22 23 25 27 29 30 HEDERAGENINA 24 26 28

Gli zuccheri sono più comunemente attaccati alla posizione 3-idrossilica

dell’aglicone;tra le più comuni saponine presenti nel genere Pulsatilla si hanno 2 o 3 monossaccaridi uniti: nella Pulsatilla chinensis sono state ritrovate saponine triterpenoidiche che possiedono come struttura dell’aglicone basata sull’acido betulinico (derivante dall’ossidazione del lupeolo sul C₂₈ )

R1O CH₂OH CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ COOR2 CH₂ C H₃ ACIDO BETULINICO R1 _R2 1 -H -H 2 -ara -H 3 _{-ara(2→1)rha} -H 4 -H _{-glc(6→1)glc(4→1)rha} 5 _{-ara(3→1)glc -glc(6→1) glc(4→1)rha} 6 _{-ara[(2→1)rha][(4→1)glc] -glc(6→1) glc(4→1)rha}

Tab. 1: glicosidi con scheletro del lupano in P. chinensis (ara = arabinosio, rha = ramnosio, glc = glucosio)

1 = acido 23-idrossi-betulinico, 2 = pulsatilloside A, 3 = pulsatilloside B, 4 = pulsatilloside C, 5 = pulsatilloside D, 6 = pulsatilloside E

I composti dal 2 al 4 sono tra le più famose saponine triterpenoidiche presenti in questo genere di pianta : PULSATILLOSIDE A,B, e C rispettivamente.

Queste tre saponine, che secondo la nomenclatura iupac vengono denominate

- pulsatilloside A: acido 3β,23-diidrossi-lup-20(29)-en-28-oico 3-O-α-L-

arabinopyranoside

- pulsatilloside B : acido 3β, 23-diidrossi-lup-20(29)-en-28-oico 28-O-

β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside

- pulsatilloside C : acido 3β, 23-diidrossi-lup-20(29)-en-28-oico 28-O- α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-

(1→6)-β-D-glucopyranoside

è dimostrato dalla medicina tradizionale cinese che hanno effetti benefici contro le infezioni batteriche all’apparato sessuale e a quello intestinale.

Le altre 2 saponine (5 e 6), sono rispettivamente il pulsatilloside D e il pulsatillosi- de E aventi come nomenclatura iupac:

− pulsatilloside D: acido 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)

-α-L-arabinopyranosyl-23-idrossibetulinico 28-O- α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl estere

− pulsatilloside E: acido 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→4)][

α-L-rhamnopyranosyl(1→2)]- α-L- arabinopyranosyl-23-idrossibetulinico 28-O- α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl estere

La Pulsatilla chinensis oltre a possedere saponine del tipo lupano possiede anche

saponine del tipo oleanano o hederagenina:

Tab. 2: glicosidi in P.chinensis ( glcp = glucopiranosil )

- Il composto 1 è l’acido oleanolico 3-O-{O- α-L-rhamnopyranosyl(1→2)- α- L- arabinopyranoside}

- Il composto 2 è l’hederagenina 3-O-{O- α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-

α- L- arabinopyranoside}

- Il composto 3 è l’hederagenina 3-O-{O- β-D-glucopyranosyl-(1→4)-

α- L- arabinopyranoside}, la sua struttura è la seguente:

26 CH3 C H3 H COOR2 R1 C H3 CH3 H CH₃ CH3 O O O O OH O H O H R3O R4O C H3 R1 _R2 _R3 _R4 1 H H H H 2 OH H H H 4 H H H β -D-Glcp 5 OH H H β -D-Glcp 5a OH Me H β -D-Glcp 6 H H β-D-Glcp H 7 OH H β -D-Glcp H R1 _R2 _R3 _R4 1 H H H H 2 OH H H H 4 H H H β -D-Glcp 5 OH H H β -D-Glcp 5a OH Me H β -D-Glcp 6 H H β-D-Glcp H 7 OH H β -D-Glcp H R1 R1 _RR22 _RR33 _RR44 1 1 HH HH HH HH 2 2 OHOH HH HH HH 4 4 HH HH HH β -D-Glcpβ -D-Glcp 5 5 OHOH HH HH β -D-Glcpβ -D-Glcp 5a 5a OHOH MeMe HH β -D-Glcpβ -D-Glcp 6 6 HH HH β-D-Glcpβ-D-Glcp HH 7 7 OHOH HH β -D-Glcpβ -D-Glcp HH CH3 C H3 COOR1 H H _CH 3 CH3 CH3 H CH3 C H3 O O O O O O O O H O H O H OH O H O H OH OH O HH3C R2O O H 1"'' 1"' 1" 1' 3 R1 _R2 8 H H 8a Me H 9 H β -D-Glcp R1 _R2 8 H H 8a Me H 9 H β -D-Glcp R1 R1 _RR22 8 8 HH HH 8a 8a MeMe HH 9 9 HH β -D-Glcp β -D-Glcp

CH₃ C H₃ COOH H CH₃ CH₃ CH₃ H C H₃ OH O O O O O H OH OH O H O H O H H

- Il composto 4 è l’acido oleanolico 3-O-{O- β-D-glucopyranosyl-(1→3)- O-

α-L-rhamnopyranosyl(1→2)- α- L- arabinopyranoside}

- Il composto 5 è l’hederagenina 3-O-{O- β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-

α-L-rhamnopyranosyl(1→2)- α- L- arabinopyranoside}

- Il composto 6 è l’acido oleanolico 3-O-{O- α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-

-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→4)]- α- L- arabinopyranoside}

- Il composto 7 è l’hederagenina 3-O-{ O- α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-

-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→4)]- α- L- arabinopyranoside}

- Il composto 8 è l’acido oleanolico 3-O-{ O- β-D-glucopyranosyl-(1→4)-O

-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-α-L-rhamnopyranosyl-

(1→2)- α- L- arabinopyranoside}

- Il composto 9 è l’acido oleanolico 3-O-{ O- β-D-glucopyranosyl-(1→4)-O-

-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-α-L-rhamnopyranosyl- (1→2)-O-

-[β-D-glucopyranosyl-(1→4)]- α- L- arabinopyranoside}.

Mimaki et al. (2001) hanno effettuato studi riguardanti l’attività citotossica di questi composti, compreso il 5a e 8a ottenuti trattando i composti 5 e 8 con CH₂N₂ , contro le cellule leucemiche HL-60; inoltre hanno dimostrato che:

• il gruppo -OH presente sul C

23 nelle saponine con scheletro dell'

hederagenina, mostrano una elevata attività citotossica perchè gli elettroni spaiati presenti sull'ossigeno del gruppo ossidrilico provoca effetto elettron-donatore sugli elettroni del gruppo ossidrilico posizionati sul C₃ dell'aglicone;

• le saponine contenenti gruppi trisaccaridi legati al C

3, mostrano avere una

migliore attività citotossica rispetto a quelle saponine contenenti gruppi disaccaridi legati al C_3, perchè la presenza del rhamnopiranosio legato al C-2' del gruppo arabinopiranosil esalta l'attività citotossica;

• quelle saponine aventi il gruppo carbosilico libero al C

28, manifestano una

elevata attività citotossica;

Sulla base di ciò, Mimaki et al. Hanno stabilito che non ci sono differenze significative riguardo all'attività citotossica tra le saponine aventi come aglicone l'acido oleanolico o l'hederagenina, invece differente è il grado di citotossicità tra le saponine aventi lo scheletro del lupano a quelle aventi lo scheletro dell'oleanano: le prime hanno minor attività citotossica rispetto alle seconde proprio per i motivi descritti precedentemente.

La formazione del metil-estere al C-28 non influenza l’attività delle saponine. Inoltre il glicoside maggiormente attaccato al C-3 dell’aglicone è essenziale per capire e valutare l’attività citotossica delle saponine.