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I gliomi sono i tumori cerebrali primari più diffusi, e tra questi il glioblastoma multiforme (astrocitoma di grado IV secondo l’Organizzazione Mondiale della Sanità) è il più comune ed aggressivo. Il glioblastoma multiforme colpisce soprattutto gli adulti e la vita media dei soggetti è stata stimata essere attorno ai dodici mesi. Il problema principale dei gliomi consiste nel fatto che, dopo un iniziale miglioramento dovuto alle cure, presentano recidive. Infatti, la caratteristica principale dei gliomi è il loro comportamento altamente invasivo, con il conseguente fallimento sia degli interventi chirurgici, sia del trattamento con radiazioni e/o della chemioterapia. Di conseguenza, l’inibizione dell’invasività risulta essere una strategia terapeutica essenziale per il debellamento di questa forma tumorale. Nel processo di invasività hanno un ruolo critico vari enzimi, tra cui le metalloproteasi di matrice. In particolare, è stato osservato che in questi tipi di cancro le MMP-2 e MMP-9 sono sovraespresse. Queste gelatinasi, benché con implicazioni differenti, possono essere considerate le prime responsabili della diffusione del tumore, e la loro espressione è correlata con la progressione e con il grado di malignità dei gliomi, suggerendo che questi enzimi potrebbero rappresentare un target molecolare per il trattamento dei tumori cerebrali. Recenti studi hanno evidenziato la presenza, nel glioblastoma multiforme, di elevati livelli di espressione anche della MMP-12.
In trials clinici la terapia combinata di Temozolomide (un agente alchilante utilizzato nel trattamento dei gliomi) con Marimastat (un inibitore delle MMPs ad ampio spettro) ha mostrato un aumento della sopravvivenza dei pazienti rispetto alla terapia convenzionale con Temozolomide. Tuttavia, inibitori a largo spettro delle MMPs hanno mostrato, già a basse dosi, tossicità muscolo-scheletrica. Inoltre considerando che alcune MMPs
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hanno un ruolo nell’immunità innata e nel contrastare la formazione tumorale, la ricerca si è focalizzata sull’indagine di composti che mostrino una selettività verso le MMPs implicate nello sviluppo e nell’invasività dei gliomi, quali MMP-2, MMP-9 e MMP-12. Essendo la MMP-2 quella maggiormente responsabile del processo invasivo è stato scelto di utilizzare, negli studi effettuati, una concentrazione dei composti pari al loro valore di IC50 sulla MMP-2.
In questo lavoro di tesi è stato approfondito lo studio di due composti appartenenti alla famiglia degli N-O-isopropil sulfonammide idrossammati (composti 1 e 2), sintetizzati nel laboratorio diretto dal Professor Rossello, presso il Dipartimento di Scienze Farmaceutiche dell’Università di Pisa. In analisi effettuate presso tale laboratorio mediante test in tube su MMPs ricombinanti umane i composti 1 e 2 avevano mostrato una buona attività inibitoria sulle MMP-2, MMP-9 e MMP-12 (Tabella 1).
Tabella 1. Valori di IC50 (alla concentrazione nM) per i composti 1, 2 e CGS_27023A calcolati su MMPs ricombinanti umane attraverso il saggio fluorimetrico del test tube.
IC50 (nM) 1 2 CGS_27023A MMP-1 12000±1000 490±76 56±6 MMP-2 12±2 1.0±0.2 25±4 MMP-3 5900±340 50±2 16±1.8 MMP-9 200±40 6.7±1.6 4.8±1.3 MMP-12 18±0.7 0.20±0.05 - MMP-14 2300±170 9.8±0.2 23±1.6
Un lavoro effettuato precedentemente nel nostro laboratorio ha dimostrato che concentrazioni nanomolari, corrispondenti al valore di IC50 sulla
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la vitalità e la proliferazione. In particolare, la riduzione dell’invasività su cellule di glioblastoma umano U87MG è stata valutata mediante analisi su Matrigel in seguito a trattamento con i composti 1, 2 e con lo standard di riferimento CGS_27023A. L’inibizione dell’invasività cellulare è risultata essere rispettivamente del 50%, del 48% e del 31%. Anche se l’inibizione dell’invasività è stata ottenuta utilizzando concentrazioni corrispondenti all’IC50 sulla MMP-2 dei campioni 1 e 2, non possiamo escludere che
l’effetto inibitorio osservato sia in parte mediato dall’inibizione delle MMP-9 e MMP-12, MMPs che cooperano con la MMP-2 per la progressione del glioblastoma.
Per quanto riguarda la vitalità, dai risultati ottenuti tramite l’analisi con MTS e Trypan blue è emerso che i composti in esame, testati alle concentrazioni corrispondenti al valore delle loro IC50, non inducono morte
cellulare. Infatti le percentuali delle cellule vive a seguito del trattamento con i composti 1, 2 e CGS_27023A, rispetto al controllo trattato con il DMSO (solvente in cui sono stati sciolti i composti), risultano essere, rispettivamente, pari a 97,4%, 98,6% e 99,2%.
Alla luce dei dati ottenuti, risulta evidente che questi composti, a concentrazioni nanomolari, riducono in maniera significativa l’invasività cellulare, rendendoli molto interessanti per un possibile impiego terapeutico nel trattamento del GBM. Inoltre, l’utilizzo di composti a basso dosaggio può mirare il target verso alcune metalloproteasi, risparmiandone altre, e questo potrebbe riflettersi in una riduzione della tossicità muscolo-scheletrica evidenziata con gli inibitori a largo spettro, tra cui anche il CGS_27023A.
Nel presente studio di tesi sono stati investigati altri aspetti relativi al trattamento dei due composti su cellule di glioma umano U87MG. In particolare, è stata indagata, dopo trattamento, l’espressione della MMP-2 e l’attività inibitoria sull’enzima rilasciato dalle cellule nel sovranatante.
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Come primo step si è valutata la capacità dei due composti di inibire l’attività enzimatica della MMP-2 testandola su substrato naturale (gelatina) mediante la tecnica della zimografia. Il mezzo privo di siero ottenuto dalla coltura delle cellule U87MG è stato raccolto, centrifugato, aliquotato ed incubato per 3 ore in assenza o in presenza dei composti 1, 2 o CGS_27023A. Le aliquote sono state caricate su gel ed è stata eseguita l’analisi zimografica come descritto nella sezione Materiali e metodi. I risultati ottenuti dall’analisi densitometrica effettuata tramite il software ImageJ hanno evidenziato una diminuzione dell’attività gelatinolitica della MMP-2 rispetto al controllo (Fig.11).
Fig.11 Visualizzazione delle bande ottenute, tramite analisi zimografica, ad opera
dell’attività gelatinolitica della MMP-2 dopo trattamento con i composti 1, 2 e CGS_27023A.
I dati sono stati espressi come percentuale dell’attività di MMP-2 dei campioni trattati con il composto 1, 2 e CGS_27023A rispetto ai campioni non trattati (100%) e sono risultati essere rispettivamente circa pari a 33%, 23% e 80%. Tali risultati hanno evidenziato, tramite test ANOVA, una differenza statisticamente significativa tra l’attività della MMP-2 misurata nei composti rispetto al controllo (p<0.0001) (Fig.12).
DMSO CGS_27023A 1 2
MMP-2 62 kDa
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Fig.12 Grafico delle percentuali di attività di MMP-2 in seguito a trattamento con
composto 1, 2 o CGS_27023A rispetto al controllo. Ciascuna barra rappresenta la media ± SEM di tre diversi esperimenti. ⃰⃰⃰ ⃰⃰ ⃰ p<0.0001.
Come secondo step, si è indagato se questi composti provocano un’alterazione dell’espressione della MMP-2, sia per quanto riguarda l’mRNA, mediante Real-time PCR, che la proteina, attraverso saggio ELISA.
In letteratura è stato visto che inibitori delle metalloproteasi determinano una variazione dell’espressione delle stesse (Lee et al, 2007), quindi è stato valutato se il trattamento per 24 ore delle cellule U87MG con il composto 1, 2 o CGS_27023A fosse responsabile di una modificazione nell’espressione della MMP-2.
I livelli di mRNA della MMP-2 sono stati determinati mediante Real-time PCR, e tale analisi ha messo in evidenza che dopo trattamento con i composti 1, 2 o CGS_27023A i livelli di mRNA mostravano una riduzione rispettivamente del 52%, 71% e 25% rispetto al controllo. Tali dati analizzati con il test ANOVA hanno evidenziato una differenza
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statisticamente significativa tra i livelli di mRNA della MMP-2 delle cellule trattate con i composti rispetto al controllo (p < 0.0001)(Fig.13).
Fig.13 Percentuale di riduzione dei livelli di mRNA della MMP-2 rispetto al controllo
in seguito al trattamento con il composto 1, 2 o CGS_27023A. Il saggio è stato effettuato due volte in triplicato. ⃰ p<0.05; ⃰ ⃰ ⃰ p<0.0001.
Una possibile spiegazione a questi dati potrebbe essere trovata nella correlazione esistente tra MMP-2 e il fattore di crescita dell’endotelio vascolare (VEGF), anch’esso sovraespresso nei gliomi. E’ stato visto che il blocco della sintesi delle MMP-2 mediante siRNA provocava una riduzione dell’espressione di VEGF (Chetty et al., 2009); d’altro canto il blocco dell’espressione di VEGF mediante anticorpi specifici si rifletteva in una drastica riduzione dell’espressione di MMP-2 (Zhang et al, 2006). Studi precedenti hanno dimostrato che il composto 1 riduceva l’espressione di VEGF nel tumore al polmone (Chetty et al., 2009). La stessa cosa potrebbe
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verificarsi nel glioma e essere quindi alla base della riduzione dei livelli di mRNA della MMP-2.
Studi futuri saranno necessari per chiarire il meccanismo molecolare attraverso il quale inibitori delle MMPs agiscono per influenzare l’espressione.
Vista la significativa riduzione dei livelli di mRNA della MMP-2 è stato indagato se tale riduzione era riscontrata anche a livello della proteina. Mediante il saggio ELISA si è valutata la variazione della concentrazione della MMP-2 nel mezzo privo di siero di cellule U87MG trattate con il composto 1, 2 e CGS_27023A rispetto alla concentrazione nel mezzo privo di siero di cellule non trattate.
Il livello di proteine MMP-2 nel mezzo privo di siero di cellule U87MG non trattate è 10,4 ng/ml (valore al quale è stato attribuito il 100%). Il trattamento per 24 ore con il composto 1 o con CGS_27023A ha determinato una riduzione del 47% e del 16% rispettivamente (Fig. 14) . I livelli di proteina dopo il trattamento con il composto 2 non sono stati rilevati in quanto inferiori ai 3,5 ng/ml.
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Fig.14 Livelli di MMP-2 nel sovranatante di cellule U87MG trattate con il composto 1,
con CGS_27023A o con DMSO (CTRL). I valori indicati rappresentano la media ± SEM di due saggi ELISA effettuati in doppio.
In conclusione, gli studi effettuati in questo lavoro di tesi hanno evidenziato che i composti analizzati provocano una riduzione dell’attività delle MMP-2 agendo a più livelli: oltre a inibire direttamente l’enzima diminuendone la capacità di degradare il substrato, riducono l’espressione della MMP-2. Lo studio di questi potenti inibitori della MMP-2 potrebbe aprire la strada ad un successivo sviluppo di molecole per l’impiego clinico, utilizzabili a dosi molto basse, così da ridurre la tossicità muscolo-scheletrica, associata a inibitori a largo spettro delle MMPs.
