MATERIALI E METODI
Tutti gli esperimenti sono stati effettuati su ratti Long Evans, conformemente alla legislazione nazionale vigente (D. Lgs. 116/92) e allo statuto per l’uso degli animali negli studi di oftalmologia dell’ARVO (Associazione per la Ricerca sulla Visione e per l’Oftalmologia). I ratti (ottenuti dalla ditta Charles River) vengono allevati nella colonia del laboratorio. Abbiamo focalizzato gli esperimenti su animali di età compresa tra P0 e P3 (dal giorno della nascita (P0) fino ad un massimo di tre giorni dopo la nascita (P3)).
La procedura sperimentale consiste nel marcare il materiale sinaptico nell’occhio e studiarne il trasporto e la dinamica lungo l’intero percorso delle proiezioni retiniche.
Iniezioni intraoculari
Le iniezioni vengono effettuate su animali anestetizzati con etere. Ci si serve di uno stereomicroscopio chirurgico, di un capillare di vetro tirato al calore, collegato ad un microiniettore a pressione idraulica.
Per le iniezioni intraoculari le palpebre degli occhi vengono delicatamente aperte lungo la presuntiva linea di apertura, il capillare inserito nella porzione temporale dell’ora serrata e il volume di iniezione lentamente rilasciato nel vitreo. Iniezioni di Sytlum-Ab coniugato a Oyster® 550:
Per gli esperimenti nella retina le iniezioni vengono effettuate in entrambi gli occhi e vengono iniettati 400 nl della soluzione di (Synaptic System) 1 mg/ml. Considerando che la camera ottica dell’occhio di ratti neonati ha un volume di circa
10 µl la concentrazione finale dell’anticorpo iniettato è di 0.4 µg/µl. Il prelievo delle retine avviene 4 h dopo l’iniezione.
Iniezioni della tetrodotossina (TTX):
Vengono iniettati unilateralmante 200 nl di soluzione di TTX (Sigma-Aldrich®) 0.75 mM in tampone citrato (0.1 M, pH 4.8), e solo sodio citrato 0.1 M pH 4.8 negli animali di controllo. Dopo 15 min dall’iniezione di TTX o del veicolo, segue l’iniezione di Sytlum-Ab coniugato con Oyster® 550 come descritto sopra. Le retine vengono
prelevate a 2 h da quest’ultima iniezione. Iniezioni della tossina colerica:
Per lo studio del trasporto lungo le proiezioni retiniche nel cervello viene iniettato il solo occhio destro con 0.4 µg/µl di Sytlum-Ab coniugato con Oyster® 550.
Quando si rende necessario un aiuto alla visualizzazione delle proiezioni di entrambi gli occhi, nell’occhio sinistro vengono iniettato 400 nl della subunità B della Tossina Colerica Alexa Fluor® 488 (Molecular Probes) 1 mg/ml. Il prelievo dei cervelli avviene a diversi tempi dall’iniezione, come indicato nel testo.
Per gli esperimenti di specificità della marcatura del materiale sinaptico sono stati iniettati 5 diversi anticorpi rivolti contro il dominio luminale di Synaptotagmin, provenienti dalla ditta Synaptic System: Sytlum-Ab, monoclonale coniugato Oyster®
550, derivante dal clone 604.2; Sytlum-Ab, monoclonale, derivante dal clone 604.2;
Sytlum-Ab, monoclonale , derivante dal clone 604.4; Sytlum-Ab, policlonale in siero di
coniglio coniugato Oyster® 550; P65, monoclonale gentilmente concesso da Pietro De Camilli (Yale University).
Inoltre sono stai iniettati 3 diversi anticorpi rivolti contro il dominio citoplasmatico di Synaptotagmin, provenienti dalla ditta Synaptic System: Sytcyt-Ab,
monoclonale, derivante dal clone 41.1; Sytcyt-Ab, policolnale in siero di coniglio; SS,
monoclonale gentilmente concesso da Pietro De Camilli (Yale University).
Prelievo delle retine e immunoistochimica
I ratti neonati vengono uccisi per decapitazione, l’occhio viene rapidamente enucleato e le retine dissezionate in Fluido Cerebro-Spinale Artificiale (ACSF: 6.954 g/l NaCl, 0.186 g/l KCl, 264 µl/l MgCl2, 0.368 g/l CaCl2, 0.12 g/l NaH2PO4, 1.982 g/l
Glucosio, 4.76 g/l HEPES, pH 7.4), ossigenato e tenuto in ghiaccio. Le retine vengono distese e poste su di un filtro di nitrocellulosa Millipore con lo strato delle RGCs rivolto verso l’alto. Abbiamo usato un protocollo standard per le reazioni di immunoistochimica che prevede una fissazione di 45 min a temperatura ambiente con paraformaldeide al 4% in tampone PhEM 4x; lavaggi (5 x 10 min) in PBS; 2 h di bloccaggio a temperatura ambiente in una soluzione costituita da: 5% di siero di cavallo, 0.3% di Triton-X il tutto in PBS; seguono 3 giorni di incubazione a 4° C con l’anticorpo primario. Dopo aver accuratamente sciacquato l’anticorpo primario in eccesso (10 x 10 min di lavaggi in PBS), seguono 2 giorni di incubazione a 4° C con l’anticorpo secondario appropriato. Nel caso degli studi di doppia marcatura del segnale di uptake di Sytlum-Ab iniettato, viene semplicemente fatta una razione di
rivelazione in una soluzione che contiene il secondario per Sytlum-Ab e il secondario
per l’anticorpo primario con cui si vuole studiare la colocalizzazione del segnale. Gli anticorpi usati per l’immunoistochimica sono: Sytcyt-Ab (policlonale in coniglio,
concentrazione d’uso 1:100, Synaptic System); Vglut2-Ab (policlonale in coniglio, concentrazione d’uso 1:500, Synaptic System); Bassoon-Ab (policlonale in coniglio, concentrazione d’uso 1:200, Synaptic System); NF150kDa-Ab (policlonale, concentrazione d’uso 1:500, Chemicon); Neuroligin 1-Ab (monoclonale,
concentrazione d’uso 1:500). Gli anticorpi secondari utilizzati a seconda dei casi sono: anti-mouse coniugato Rhodamine Red™ (1:200, Jackson ImmunoResearch); anti-rabbit Alexa Fluor® 488 (1:500, Molecular Probes).
Analisi della colocalizzazione
Gli esperimenti di colocalizzazione sono attenuti da immunoistochimica del tessuto per due antigeni di interesse, uno dei quali nel nostro caso è sempre il segnale di uptake di Sytlum-Ab. Si usano anticorpi secondari di spettri separati. Le
immagini in singole sezioni ottiche vengono acquisite al microscopio confocale Leica DM6000 con un obiettivo 40x ad olio con un ingrandimento a zoom 12x ed un formato immagine di 1024 x 1024 pixel (circa 31 x 31 µm). Il pinhole viene fissato sempre uguale ad 1. Abbiamo usato una procedura con scansione sequenziale che permette di acquisire ciascuna immagine linea dopo linea separatamente in ciascun canale di interesse. Si ottengono così dallo stesso campo due immagini, una verde ed una rossa rispettivamente dei due antigeni studiati. L’analisi delle immagini viene fatta con Metamorph Offline 5.0 versione 5.0r1. Di ciascuna immagine viene selezionato il segnale che supera una soglia pari a 2 volte il valore dell’intensità del segnale di fondo (background) e da questo viene creata una maschera binaria. La colocalizzazione viene calcolata come il prodotto delle due maschere binarie (quella proveniente dal canale rosso con quella proveniente dal canale verde dello stesso campo) ed espressa come frazione del segnale di una delle due.
Il valore di colocalizzazione ottenuto ruotando una delle due immagini (flip) viene preso come misura della colocalizzazione casuale. Una colocalizzazione viene considerata effettiva solo quando i valori ottenuti siano significativamente differenti da quelli ottenuti con il flip sulla base di un t-test appaiato. Per ciascun esperimento
sono stati considerati da 5 a 8 campi per retina, e almeno 3 retine per ciascun antigene. Quando statisticamente differenti dalle misure “flip” il valore della colocalizzazione viene determinato mediando i valori ottenuti in diverse retine. I dati vengono infine espressi come media ± SE (Standard Error).
Microscopia Elettronica
Gli occhi prelevati da ratti decapitati, vengono posti in ACSF ossigenato e privati di cornea, cristallino e vitreo. La coppa ottica risultante viene poi fissata con paraformaldeide al 4% in tampone PhEM 4x per 45 min a temperatura ambiente. La dissezione dell’occhio prima della fissazione, viene effettuata per evitare che l’anticorpo iniettato e eventualmente rimasto nel vitreo, si fissi sul tessuto nell’occhio chiuso dando un falso positivo.
Le coppe ottiche fissate vengono sciacquate a lungo in PBS e le retine dissezionate rimuovendo la sclera e la coroide. Infine si procede con il taglio in piccoli spicchi (5 o 6 per ciascuna retina) a partire dal centro della retina verso la periferia, con una lama molto tagliente. A questo punto seguono 4 h di bloccaggio (sulla bascula con movimento molto leggero per favorire la permeabilizzazione del tessuto) in una soluzione in PBS con 5% di siero di cavallo e 0.05% di Triton-X. Le retine a questo punto vengono incubate tutta la notte a 4° C con l’anticorpo secondario, rivolto contro il primario iniettato. L’anticorpo usato è il frammento Fab di un anti-mouse coniugato a particelle di oro colloidale di 10 nm di diametro, specifico per la microscopia elettronica (EM Goat F(ab)2 anti-mouse IgG-10 nm Gold,
concentrazione d’ uso 1:15, BBInternational). I controlli di questi esperimenti sono retine normali incubate con il solo secondario coniugato ad oro. Le retine vengono poi post-fissate in una mistura composta da 2.5% di gluteraldeide e 2% di
paraformaldeide in tampone cacodilato 0.2 M 2 h a 4° C e 2 h a temperatura ambiente (totale 4 h). A questo punto si procede con l’inclusione. In breve, le retine vengono post-fissate in tetrossido di osmio al 2%, infiltrate in acetato di uranile all’1%; disidratate in concentrazioni crescenti di etanolo e infine incluse in una resina per la microscopia elettronica a base di Epon e Araldite. Le immagini sono acquisite con un microscopio elettronico Jeol 1200 EXII ad un ingrandimento variabile tra i 25.000x e i 60.000x.
Dissezione del cervello: preparato in “flat mount” e sezioni coronali
di collicolo superiore
Gli animali vengono uccisi per decapitazione, l’osso cranico (ancora sottile nei neonati) viene velocemente rimosso con le pinzette da dissezione, e il cervello posto in una piastra petri in ACSF ossigenato. Si procede alla rimozione delle cortecce con un bisturi chirurgico esponendo il collicolo superiore ed il talamo. Si opera un taglio longitudinale lungo la linea mediana raggiungendo i 2/3 di profondità dalla superficie. Penetrando nell’apertura provocata dal taglio tra le due metà del cervello, si effettuano altri due tagli profondi 1-2mm che corrono circa 60-90° rispetto al taglio centrale, procedendo dal centro verso la periferia. In questo modo le due metà del mesencefalo possono essere aperte e distese in un unico piano che avrà al centro il chiasma ottico e su ciascun lato le regioni di proiezione retinica: tratto ottico, nucleo genicolato laterale e collicolo superiore. Questo preparato viene poi trasferito in una piastra petri con base di vetro contenente ACSF ossigenato, in maniera che il chiasma ottico sia rivolto verso il basso. La acquisizioni vengono fatte con un microscopio confocale invertito Leica DM IRE2 fornito di una camera di incubazione di cui si possono controllare i parametri di temperatura e ossigenazione. Viene
fotografato l’intero preparato con un obiettivo 10x di apertura numerica (NA) 0.4. Si costruisce poi il montaggio utilizzando il programma Adobe Photoshop CS3.
Per l’analisi di fette coronali di collicolo superiore si procede alla dissezione come descritto precedentemente fino alla rimozione delle cortecce. Il cervello viene allora ritagliato con il bisturi chirurgico fino ad ottenere un blocchetto di tessuto che contiene il collicolo. Fette di 250 µm sono ottenute tagliando il blocchetto (asciugato dall’ACSF in eccesso) con un chopper (McIlwain Tissue Chopper). Le fette ottenute vengono mantenute per pochi minuti in uno stato ex-vivo in petri in una cameretta ossigenata in ACSF e guardate entro pochi minuti (2-5 min) al microscopio confocale Leica DM6000. L’esigenza di acquisire immagini su fette di collicolo in uno stato
ex-vivo e non fissate deriva dal problema dell’indebolimento della fluorescenza del segnale di Sytlum-Ab coniugato a Oyster® 550 iniettato, a seguito della fissazione.
Invece, le fette di collicolo processate per immunoistochimica seguono il protocollo di immuno descritto per le retine.
Live Imaging
Le retine in ACSF possono essere mantenute in uno stato metabolico attivo tenendo sotto controllo i parametri chimico fisici e quindi possono essere osservate in una condizione ex-vivo per tempi ragionevolmente lunghi da permettere gli esperimenti di live imaging.
Le retine, 4 h dopo l’iniezione di Sytlum-Ab coniugato a Oyster® 550 vengono
dissezionate in ACSF fresco e ossigenato, distese con lo strato delle RGCs rivolto verso il basso ed adagiate sul fondo di una piastra petri con la base di vetro, riempita con ACSF ossigenato. Per far sì che le retine non fluttuino e restino ben distese e appiattite sulla base della petri, vi si adagia un filtro ISOPORE™ (Millipore) di 3.0 µm
permeabile ai gas tenuto fermo a sua volta da un anello di argento di circa 1 cm di diametro. Gli assoni delle retine vengono osservati con un microscopio confocale Leica rovesciato DMIRE2 fornito di una camera di incubazione di cui si possono controllare i parametri di temperatura e ossigenazione; l’obiettivo usato è un 40x a olio con apertura numerica 0.75 (NA 0.75).
Questa procedura è identica per gli esperimenti di FRAP e per l’imaging di singoli pacchetti di materiale sinaptico marcato.
FRAP
In ciascun esperimento di FRAP, prima dello spegnimento della fluorescenza in una regione del campo, le immagini vengono acquisite ogni 6 sec per 1 min usando una potenza laser del 30%, una velocità di scansione di 400 Hz e uno zoom 2x. Subito dopo una regione centrale del campo (18 x 9 µm2 circa) viene spenta (bleaching) concentrandovi per 2 min un raggio laser al massimo della potenza e con una frequenza di scansione di 1400 Hz. Al termine dei 2 min di bleaching, il microscopio viene immediatamente riportato ai parametri di settaggio del pre-bleaching e vengono acquisite immagini ogni 6 sec per i successivi 300-500 sec (periodo di recupero della fluorescenza).
Generalmente per gli esperimenti di FRAP si raccomanda l’uso di obiettivi di bassa apertura numerica con lo scopo di poter lavorare con un profilo cilindrico del raggio laser, a meno che non venga analizzato un campione in 2D (Braeckmans et
al., 2007). Nel nostro caso poiché lo spessore del fascio di assoni è generalmente minore di 3-4 µm, noi abbiamo potuto usare un obiettivo con una NA relativamente alta (40x, NA 0.75).
L’analisi dati delle sequenze ottenute da un esperimento FRAP viene effettuata usando il programma MetaMorph Offline 5.0r1. Di ciascun fotogramma della serie si calcola l’intensità media di fluorescenza della regione di bleaching, di una regione di controllo e del fondo (background). Per quest’ultimo si sceglie una zona priva di assoni, mentre si prende la regione di controllo su di un fascio di assoni diverso da quello su cui si opera il bleaching. Tutte le misure ottenute sono state caricate in fogli di lavoro in Origin Pro 8.0. Con questo programma di analisi statistica si può ricavare una curva che mostra l’andamento dell’intensità di fluorescenza durante il periodo di recupero. Dai nostri dati abbiamo ottenuto curve esponenziali del tipo: F(t)=A(1-αe-t/τ)
In tutti i casi tranne che per il tessuto fissato, la curva di recupero della fluorescenza della regione di bleaching si adatta con un coefficiente di correlazione di 0.9 e con un tempo di recupero intorno ai 100 sec. Inoltre, in molti casi il tempo di recupero calcolato usando i valori grezzi di fluorescenza, o i valori di fluorescenza dopo sottrazione del background o infine il rapporto tra l’intensità di fluorescenza nell’area spenta e nell’area di controllo porta a tempi di recupero variabili 10-15% tra loro. L’intensità di fluorescenza è mediata sulla regione spenta ed è espressa come percentuale del valore di pre-bleaching.
Per dimostrare che c’è recupero di fluorescenza nella zona spenta solo se le retine sono metabolicamente attive abbiamo ripetuto gli esperimenti FRAP su retine dissezionate come detto sopra, ma fissate 45 min in paraformaldeide al 4% subito dopo la dissezione. Il trattamento successivo è identico alle retine ex-vivo.
Per dimostrare la dipendenza dai microtubuli del movimento del materiale sinaptico marcato da Sytlum-Ab abbiamo ripetuto gli esperimenti FRAP aggiungendo
Per quanto riguarda l’esperimento e l’analisi dati le retine sono state trattate come precedentemente descritto.
Imaging di singoli pacchetti di materiale sinaptico marcato
Questi esperimenti sono effettuati utilizzando il laser del confocale al 60% di potenza, e acquisendo immagini con scansione bidirezionale a 400Hz di frequenza. Lo studio è concentrato su di una regione di 23 x 11 µm2 acquisita ad una risoluzione
di 1024 x 512 pixel con un obiettivo 40x ad olio con un fattore zoom di 16x. Vengono acquisite immagini sequenziali al massimo rapporto di scansione ottenibile (1 fotogramma ogni 1.629 sec). Questi parametri di settaggio fanno sì che la fluorescenza nella regione osservata venga rapidamente (10 sec circa) spenta così che il campo appaia scuro rendendo facilmente visibile la repentina comparsa dai bordi del campo di pacchetti di materiale fluorescente che possono essere seguiti per diversi fotogrammi prima che vengano spenti a loro volta. Questo ci permette di monitorare lo spostamento dei pacchetti di segnale fotogramma dopo fotogramma e di calcolare la loro velocità istantanea e la direzione di movimento. Queste analisi vengono effettuate usando Metamorph che permette di caricare le immagini impilate l’una sull’altra consentendo all’operatore di tracciare manualmente il percorso di ciascun pacchetto da un fotogramma al successivo. Vengono considerati nell’analisi solo quei pacchetti che sono visibili per almeno 3 frame. Da questo studio si può misurare la distanza in µm percorsa da ciascun pacchetto e quindi anche la velocità istantanea e media di movimento. Per ciascun campo analizzato viene presa un’immagine a più basso ingrandimento (zoom 2x) che permette di tracciare la direzione media del fascio di assoni nell’area di spegnimento; inoltre si prende nota
della posizione del nervo ottico per poter discriminare i pacchetti che viaggiano con movimento anterogrado da quelli che viaggiano con movimento retrogrado.
Simulazioni
Le simulazioni sono state effettuate tramite un programma appositamente creato. In ciascuna simulazione le particelle vengono fatte viaggiare lungo un ideale percorso uni-dimensionale che parte dall’occhio e arriva fino al collicolo superiore, prendendo il chiasma ottico come punto di partenza, x= 0. Le misure su preparazioni in flat mount dell’intero tratto, mostrano che il collicolo superiore si trova tra 8000 e 8500 µm. La posizione dell’occhio è a circa x= -3500 µm (Caleo, 1996) sebbene quest’ultima distanza non influenzi significativamente la simulazione. La particella parte dal chiasma al tempo t=0 e mantiene una direzione costante di moto che viene determinata ogni δ secondi, assumendo che il movimento anterogrado e retrogrado siano ugualmente probabili, come rilevato dalle osservazioni time-lapse. Per ciascuna direzione di movimento, la velocità della particella viene pescata in maniera random dalla distribuzione delle velocità istantanee ottenute dalle acquisizioni ogni 1,629 sec. La frequenza di inversione δ è stata variata tra 20 e 2000 sec. Inoltre la lunghezza del cammino di ciascuna particella in una data direzione (running lenght), cioè il percorso medio che percorre una particella prima di cambiare la sua direzione di moto, è legato alla frequenza di inversione δ dalla relazione 2*δ*ū, dove ū la velocità media per la direzione considerata. Per ciascun δ la simulazione è stata ripetuta numerose volte, ciascuna volta per 105 particelle, e l’accumulo delle
