CAPITOLO 3: Risultati e discussione

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3.1 Isolamento ed identificazione dei composti

Le parti aeree di Arcytophyllum thymifolium (Ruiz & Pav.) Standl. sono state essiccate e successivamente estratte, tramite una macerazione statica a temperatura ambiente, con solventi a polarità crescente: n-esano, cloroformio, cloroformio-metanolo (9:1) e metanolo.

Dopo evaporazione del solvente, con l’ausilio del rotavapor, si sono ottenuti i seguenti residui:

 estratto n-esanico (RE) : 9.01 g

 estratto cloroformico (RC): 18.16 g

 estratto cloroformio-metanolico (RCM): 27.53 g

 estratto metanolico (RM): 52.95 g

Dopo un’analisi preliminare degli estratti, mediante cromatografia su strato sottile (TLC), sono stati scelti come oggetti di studio e analisi quelli cloroformico (RC) e metanolico (RM).

Gli estratti sono stati cromatografati e successivamente frazionati ed analizzati. Il processo di separazione ha portato all’isolamento e alla completa caratterizzazione di 26 composti. Tra i metaboliti secondari identificati troviamo:

 10 iridoidi (composti 11-20)

 1 triterpene (composto C)

 8 cumarine (composti 1, 2, 5, 6, 8, 9, 10, 22)

 7 flavonoidi (composti 3, 7, 23, 25, 26, 27, 28)

 2 derivati dell’acido caffeico (composti 21, 24)

 1 acetofenone (composto 4)

I metaboliti secondari isolati si suddividono in due classi principali: composti appartenenti agli isopreni (iridoidi e triterpeni) e composti fenolici (cumarine, flavonoidi, derivati dell’acido caffeico e acetofenoni). Tre composti C, 16 e 20 sono ancora in corso di caratterizzazione.

La determinazione strutturale di tutti i composti è stata effettuata mediante spettri NMR

mono e bidimensionali (1_H-NMR,13_C-NMR,13_{C-DEPT, HSQC, HMBC, DQF-COSY, 1D-TOCSY)}

e confermata tramite spettrometria di massa ESI-MS.

L’analisi NMR è stata eseguita con due tipologie di strumenti operanti a campi diversi: 250 e 600 MHz, quest’ultimo è stato utilizzato soprattutto per piccole quantità di campione al

fine di ottenere segnali ben risolti e separati. Gli esperimenti monodimensionali 1_{H e}13

C-NMR hanno fornito informazioni circa il numero di protoni presenti, il loro accoppiamento ed il valore delle costanti nonché sul numero di atomi di carbonio. In particolare la tecnica multi-impulso DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) ha permesso la determinazione del numero di protoni legati a ciascun atomo di carbonio.

L’esperimento 1D-TOCSY (TOtal Correlation SpettroscopY) si è rivelato utile nell’analisi spettroscopica degli zuccheri ed in generale in tutti i casi in cui il segnale di un singolo

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permette di costruire un sistema di spin eccitando selettivamente un protone che, grazie al trasferimento di magnetizzazione, consente di evidenziare tutti gli altri protoni appartenenti allo stesso sistema.

Di fondamentale importanza nella determinazione strutturale dei composti sono sicuramente gli esperimenti di spettroscopia bidimensionale. Questi hanno consentito di ottenere un notevole incremento della risoluzione spettrale in quanto i segnali risultano dispersi in due dimensioni fornendo ulteriori informazioni sulle correlazioni degli stessi.

Tutti gli esperimenti NMR bidimensionali sono stati acquisiti in CD3OD o in DMSO-d6 in fase

positiva con il trasmettitore regolato sulla risonanza del solvente e sul TPPI (Incremento di Fase Proporzionale al Tempo) al fine di raggiungere una distinzione delle frequenze nella

dimensione ω1.

Gli esperimenti bidimensionali più utilizzati per la determinazione strutturale dei composti isolati sono stati:

● HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence), esperimento di correlazione eteronucleare che, impiegando il protone per la rivelazione del segnale, permette

di ottenere l’assegnazione di uno spettro 13_{C a partire dal corrispondente spettro}

protonico e viceversa. Tutto ciò mediante la correlazione diretta 1_H-13_C.

● HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Coherence), esperimento di correlazione eteronucleare long range che consente di rivelare le correlazioni a più di un legame (2_{J e}3_{J) tra un protone ed il carbonio non adiacente, consentendo in particolare di}

evidenziare correlazioni con i carboni quaternari.

● DQF-COSY (Double Quantum Filtered COrrelated SpettroscopY), esperimento che consente di ottenere informazioni su protoni accoppiati attraverso due o tre legami e di correlare i chemical shifts mediante gli accoppiamenti scalari omonucleari. Inoltre tale metodica permette di assegnare i vari sistemi di spin presenti nella molecola anche laddove si abbiano costanti di accoppiamento molto piccole e, di conseguenza, segnali non ben risolti. Infine l’esperimento difiltrato DQF permette di distinguere i segnali in prossimità del solvente, altrimenti coperti.

Ulteriori informazioni sui composti isolati sono state ottenute mediante analisi spettrometriche come ESI-MS che ne hanno confermato la struttura mediante il loro peso molecolare e le frammentazioni, espresse come rapporto massa/carica elettrica (m/z).

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3.2 Frazionamento dell’estratto cloroformico (RC)

Dall’estratto cloroformico (RC) attraverso cromatografia su colonna di gel di silice usando il

sistema di purificazione flash Biotage®_{Isolera™ Spektra, oltre ad un composto puro a}

struttura cumarinica (1), si sono ottenute delle frazioni complesse che a loro volta sono state separate mediante cromatografia ad alta pressione su fase inversa RP-HPLC. Sono stati così isolati e identificati 10 metaboliti secondari. Tra questi 1 triterpene (C), 6 cumarine (2, 5, 6, 8-10), 2 flavonoidi (3, 7) ed un acetofenone (4). I composti 7, 9, e 10 risultano essere nuovi derivati naturali, mai caratterizzati in precedenza in studi fitochimici.

Lo schema di seguito riportato (Fig. 3.1) riassume il procedimento eseguito nell’analisi dell’estratto cloroformico, ed i risultati ottenuti.

Fig. 3.1 Schema di frazionamento dell’estratto cloroformico RC ESTRATTO RC RC/7 Biotage® Isolera™ Spektra RC/7/10-11 RP-HPLC MeOH-H2O (75:25) Composto 2 Composto 3 RC/9 RP-HPLC MeOH-H₂O (55:45) Composto 4 Composto 5 RC/12 RP-HPLC MeOH-H₂O (55:45) Composto 6 RC/13 RP-HPLC MeOH-H₂O (7:3) Composto 7 HPCPC n-esano:AcOEt: MeOH:H2O (8:5:5:2) Composto C RC/14 RP-HPLC MeOH-H₂O (45:55) Composto 8 Composto 9 RC/17 RP-HPLC MeOH-H₂O (4:6) Composto 10 Biotage® Isolera™ Spektra Composto 1

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3.3 Frazionamento dell’estratto metanolico (RM)

L’estratto metanolico (RM) è stato ripartito per mezzo dell’imbuto separatore con una

miscela n-BuOH-H2O (1:1), in una porzione n-butanolica RBu (9.4 g) ed in una porzione

acquosa.

Il residuo n-butanolico ottenuto è stato sottoposto a cromatografia ad esclusione molecolare su colonna Sephadex LH-20, in questo modo è stato possibile isolare 3 metaboliti secondari appartenenti alla classe dei flavonoidi, composti 26, 27, 28. Le altre frazioni molto complesse ottenute sono state a loro volta separate mediante cromatografia ad alta pressione su fase inversa RP-HPLC. Sono stati così isolati e purificati 15 metaboliti secondari. Tra questi, 10 sono iridoidi (11-20), 2 sono flavonoidi (23, 25), 2 sono derivati dell’acido caffeico (21, 24) e uno è una cumarina (22). I composti 18 e 22 sono nuovi derivati naturali, mai isolati fino ad oggi in studi fitochimici. Lo schema di seguito riportato (Fig. 3.2) riassume il procedimento eseguito nell’analisi dell’estratto metanolico, ed i risultati ottenuti.

Fig. 3.2 Schema di frazionamento dell’estratto metanolico RM ESTRATTO RM RM/4 RP-HPLC MeOH-H2O (3:7) Composto 11 Composto 12 Composto 13 RM/5 RP-HPLC MeOH-H2O (35:65) Composto 14 Composto 15 RM/7 RP-HPLC MeOH-H2O (4:6) Composto 16 Composto 17 Composto 18 Composto 19 RM/9 RP-HPLC MeOH-H2O (4:6) Composto 20 RM/10 RP-HPLC MeOH-H2O (4:6) Composto 21 Composto 22 Composto 23 RM/11 RP-HPLC MeOH-H2O (45:55) Composto 24 RM/12 RP-HPLC MeOH-H2O (45:55) Composto 25 Sephadex LH-20 MeOH _{Composto 26} Composto 27 Composto 28

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3.4 Iridoidi

Gli iridoidi sono una classe di isoprenoidi monoterpenoidici a 10 atomi di carbonio. Come già menzionato (Cap. 2.1.1.1), nella specie A. nitidum (Kunth) Schltdl. è stato isolato l’iridoide asperuloside e la sua presenza, oltre che a quella di molti altri iridoidi con struttura simile, è stata confermata anche in A. thymifolium (Ruiz & Pav.) Standl.

Gli iridoidi glicosidi isolati sono diffusi all’interno della famiglia delle Rubiaceae ed in particolare nel genere Hedyotis, filogeneticamente molto vicino al genere Arcytophyllum.

3.4.1 Composto 11

Il composto è stato isolato dall’estratto metanolico (RM). La frazione RM/4/3 è stata

ottenuta in seguito a cromatografia su colonna Sephadex LH-20 dell’estratto RM (9.4 g)

eluendo con MeOH. Successivamente è stata analizzata mediante RP-HPLC, utilizzando

come fase mobile una miscela eluente MeOH-H2O (3:7) (tR= 4 min), ottenendo l’isolamento

del composto 11 (Fig. 3.3), che si presenta come una polvere amorfa. Tale metabolita è stato isolato anche dalla frazione RM/5/4, ottenuta in seguito a cromatografia RP-HPLC,

utilizzando come fase mobile una miscela eluente MeOH-H2O (35:65) (tR= 7 min).

Fig. 3.3 Struttura composto 11: acido asperulosidico

La formula molecolare C18H24O12 è stata determinata attraverso esperimenti ESI-MS che

mostrano in modalità negativa il picco quasi molecolare a m/z 431 [M-H]- _{e lo ione di}

frammentazione a m/z 251 [M-H-180]-_{dovuto alla perdita di uno zucchero esoso, mentre}

in modalità positiva il picco quasi molecolare relativo al composto sodiato a m/z 455

[M+Na]+_{e un frammento principale a m/z 275 [M+Na-180]}+_{corrispondente alla perdita di}

uno zucchero esoso. Gli spettri 1_{H-NMR ed HSQC evidenziano segnali tipici di un iridoide}

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composto 11 come acido asperulosidico (Demirezer et al., 2005). I dati NMR sono riportati in Tab. 3.1.

Tab. 3.1 Dati 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (250 MHz in CD3OD) del composto 11} acido asperulosidico Posizione δH δC Posizione δH δC Aglicone 11 - 172.5 1 5.05 d (9.0) 101.1 12 - 172.5 3 7.60 d (1.0) 154.9 10-OCOCH3 2.10 s 20.8 4 - 109.0 Glucosio 5 3.04 t (6.5) 42.6 1' 4.73 d (8.0) 100.5 6 4.90 s 75.4 2' 3.22 dd (9.0, 8.0) 74.9 7 6.03 d (1.0) 131.8 3' 3.27 t (9.0) 78.5 8 - 145.9 4' 3.28 t (9.0) 71.5 9 2.62 t (8.5) 46.3 5' 3.37 m 77 .8 10a 4.96 d (15.0) 63.8 6'a 3.86 dd (12.0, 2.0) 63.0 10b 4.77 d (15.0) 6'b 3.63 dd (12.0, 6.0)

I valori di chemical shift sono indicati in ppm e le costanti di accoppiamento J, in Hz, sono riportate tra parentesi

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3.4.2 Composto 12

Il composto è stato isolato dall’estratto metanolico (RM). La frazione RM/4/6 deriva da

cromatografia su colonna Sephadex LH-20 dell’estratto RM (9.4 g) eluendo con MeOH. Tale

frazione è stata successivamente analizzata mediante RP-HPLC, utilizzando come fase

mobile una miscela eluente MeOH-H2O (3:7) (tR= 9 min). Ciò ha condotto all’isolamento del

composto 12 (Fig. 3.4), che si presenta come una polvere gialla.

Fig. 3.4 Struttura composto 12: estere metilico dell’acido deacetil asperulosidico o deacetil daphylloside

La formula molecolare C17H24O11 è stata determinata attraverso esperimenti ESI-MS, in

particolare in modalità positiva è stato registrato il picco quasi molecolare relativo al

composto sodiato a m/z 427 [M+Na]+_{, il picco di frammentazione a m/z 265 [M+Na-162]}+

indicativo della presenza di un’unità di esoso; in modalità negativa è stato invece registrato il picco relativo alla forma dimerica a m/z 807 [2M-H]-_{. L’analisi dello spettro}

monodimensionale 1_{H-NMR e dello spettro bidimensionale HSQC, mette in evidenza una}

grossa somiglianza con il composto 11, dal quale 12 differisce solo per l’assenza del gruppo

acetilico in posizione C-10 e per la presenza di un estere metilico in posizione C-11 (δC =

169.3 C-11; δH= 3.75, δC= 51.5 11-OCH3). I dati presenti in letteratura hanno quindi

consentito d’identificare il composto 12 come estere metilico dell’acido deacetil asperulosidico o deacetil daphylloside (Otsuka et al., 1991, Demirezer et al., 2005). I dati NMR sono riportati in Tab. 3.2.

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Tab. 3.2 Dati 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (250 MHz in CD}

3OD) del composto 12 deacetil daphylloside Posizione δH δC Posizione δH δC Aglicone 11 - 169.5 1 5.07 d (9.0) 101.6 11-OCH3 3.75 s 51.9 3 7.67 d (1.0) 155.4 Glucosio 4 - 108.3 1' 4.72 d (8.0) 100.5 5 3.02 t (6.5) 42.7 2' 3.24 dd (8.5, 8.0) 75.0 6 4.81 m 75.4 3' 3.28 t (8.5) 8.5 7 6.03 d (1.0) 129.9 4' 3.25 t (8.5) 71.6 8 - 151.5 5' 3.38 m 77 .8 9 2.57 t (8.0) 45.9 6'a 3.86 dd (12.0, 2.0) 62.8 10a 4.48 d (15.0) 61.7 6'b 3.62 dd (12.0, 6.0) - 10b 4.21 d (15.0)

3.4.3 Composto 13

come fase mobile una miscela eluente MeOH-H2O (3:7) (tR= 32 min), giungendo

all’isolamento del composto 13 (Fig. 3.5), che si presenta come un solido amorfo

giallo-bruno. Tale metabolita è stato isolato anche dalla frazione RM/5/11, ottenuta in seguito a

cromatografia RP-HPLC, utilizzando come fase mobile una miscela eluente MeOH-H2O

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Fig. 3.5 Struttura composto 13: estere metilico dell’acido asperulosidico o daphylloside

particolare in modalità positiva è stato registrato il picco quasi molecolare equivalente al

composto sodiato a m/z 469 [M+ Na]+_{e un frammento principale a m/z 307 [M+ Na- 162]}+_,

dovuto alla perdita di uno zucchero esoso quale il glucosio, mentre in modalità negativa è

stato registrato il picco quasi molecolare della forma dimerica a m/z _{891 [2M-H]}- _.

Il confronto fra i dati spettroscopici relativi ai composti 12 e 13 ottenuti tramite esperimenti

monodimensionali 1_{H NMR, e bidimensionali HSQC, evidenzia la quasi totale similarità fra}

le due strutture fatta eccezione per la presenza di un gruppo acetilico sul C-10 nel composto 13, assente nel composto 12, evidenziato dai seguenti segnali: δ= 2.09 (s, 3H, 10-OCOCH3),

δ= 20.4 (10-OCOCH3) e δ= 172.5 (C-12). Il confronto di questi dati con quelli presenti in

letteratura ha consentito di caratterizzare il composto 13 come estere metilico dell’acido asperulosidico o daphylloside (Demirezer et al., 2005). I dati NMR sono riportati in Tab. 3.3.

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Tab. 3.3 Dati 1H-NMR e 13C-NMR (250 MHz in CD3OD) del composto 13 daphylloside Posizione δH δC Posizione δH δC Aglicone 12 - 172.5 1 5.06 d (8.5) 101.2 11-OCH3 3.75 s 52.8 3 7.66 d (1.0) 155.4 10-OCOCH3 2.09 s 20.08 4 - 108.1 Glucosio 5 3.03 t (6.5) 42.4 1' 4.72 d (8.0) 100.6 6 4.80 m 75.4 2' 3.24 dd (8.5, 8.0) 74.9 7 6.09 d (2.0) 131.8 3' 3.28 t (8.5) 78.6 8 - 146 4' 3.27 t (8.5) 71.6 9 2.65 t (8.5) 46.2 5' 3.42 m 77 .9 10a 4.98 d (15.0) 63.8 6'a 3.85 dd (12.0, 2.0) 63.0 10b 4.79 m (15.0) 6'b 3.62 dd (12.0, 6.0) 11 - 169.3

3.4.4 Composto 14

cromatografia su colonna Sephadex LH-20 dell’estratto RM (9.4 g) eluendo con MeOH.

Successivamente è stata analizzata mediante RP-HPLC, utilizzando come fase mobile una

miscela eluente MeOH-H2O (35:65) (tR= 5 min), ottenendo l’isolamento del composto 14

(Fig. 3.6), che si presenta come solido amorfo color arancio. Tale metabolita è stato isolato

anche dalla frazione RM/6/2, ottenuta in seguito a cromatografia RP-HPLC, utilizzando come

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Fig. 3.6 Struttura composto 14: scandoside

mostrano in modalità negativa il picco quasi molecolare a m/z 389 [M-H]- _{e un frammento}

principale a m/z 227 [M-H-162]- _{dovuto alla perdita di uno zucchero esoso, mentre in}

modalità positiva è stato registrato il picco quasi molecolare equivalente dovuto al

composto sodiato a m/z 413 [M+Na]+_{. L’analisi degli spettri monodimensionale}1_{H-NMR e}

bidimensionale HSQC e il confronto con i dati spettroscopici relativi ai composti 11, 12 e 13 e con quelli presenti in letteratura hanno consentito di caratterizzare il composto 14 come scandoside (Tzakou et al., 2007). I dati NMR sono riportati in Tab. 3.4.

3OD) del composto 14 scandoside Posizione δH δC Posizione δH δC Aglicone 10b 4.17 d (15.7) 1 4.90 d (8.5) 99.09 11 - 169.98 3 7.39 s 151.98 Glucosio 4 - 113.85 1' 4.72 d (7.9) 100.26 5 2.80 dd (7.5, 7.5) 47.19 2' 3.24 dd (9.5, 7.9) 74.87 6 4.57 br d (5.8) 82.84 3' 3.28 t (9.5) 78.36 7 5.85 s 129.89 4' 3.25 t (9.5) 71.49 8 - 147.42 5' 3.38 m 77 .81 9 2.90 dd (8.20, 8.20) 47.38 6'a 3.86 dd (12.0, 2.0) 62.59 10a 4.39 d (15.70) 61.42 6'b 3.62 dd (12.0, 5.1)

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3.4.5 Composto 15

come fase mobile una miscela eluente MeOH-H2O (35:65) (tR= 8 min), ottenendo

l’isolamento del composto 15 (Fig. 3.7), che si presenta come un solido aghiforme incolore. Tale metabolita è stato isolato anche dalle frazioni RM/5/9, RM/6/8, RM/7/2 ottenute in

seguito a cromatografia RP-HPLC, rispettivamente alle seguenti condizioni: MeOH-H2O

(35:65) (tR= 13 min), MeOH-H2O (25:75) (tR= 6 min) e MeOH-H2O (4:6) (tR= 7 min).

Fig. 3.7 Struttura composto 15: asperuloside

particolare in modalità negativa è stato registrato il picco quasi molecolare a m/z 413

[M-H]- _{, mentre in modalità positiva il picco quasi molecolare equivalente dovuto al composto}

sodiato a m/z 437 [M+Na]+_{e un frammento principale a m/z 275 [M+ Na-162]}+ _{dovuto alla}

perdita di un residuo zuccherino, corrispondente ad un esoso.

L’analisi degli spettri monodimensionali 1_{H-NMR e}13_{C-NMR ed il confronto con lo spettro}

HSQC e con i dati presenti in letteratura hanno consentito di caratterizzare il composto 15 come asperuloside (Demirezer et al., 2005). I dati NMR sono riportati in Tab. 3.5.

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3OD) del composto 15 asperuloside Posizione δH δC Posizione δH δC Aglicone 10-OCOCH3 2.08 s 20.06 1 5.96 d (9.0) 93.3 11 - 172.2 3 7.31 d (2.0) 150.3 12 - 172.6 4 - 106.2 Glucosio 5 3.70 t (6.5) 37.5 1' 4.70 d (8.0) 100.0 6 5.56 dd (6.5, 1.5) 86.3 2' 3.22 dd (9.0, 8.0) 74.7 7 5.75 d (1.5) 128.9 3' 3.40 t (9.0) 78.4 8 - 144.3 4' 3.30 t (9.0) 71.6 9 3.33 t (8.0) 45.3 5' 3.30 m 77 .9 10a 4.81 dd (14.0, 1.0) 61.9 6'a 3.95 dd (12.0, 2.0) 62.8 10b 4.69 dd (14.0, 1.0) 6'b 3.70 dd (12.0, 6.5)

3.4.6 Composto 17

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Fig. 3.8 Struttura composto 17: estere metilico del 10-O-p-idrossibenzoil scandoside

La formula molecolare è stata determinata come C24H28O13 grazie ad esperimenti ESI-MS

che mostrano in modalità negativa il picco quasi molecolare a m/z 523 [M-H]-_{, mentre in}

modalità positiva il picco quasi molecolare equivalente dovuto al composto sodiato a m/z

547 [M+Na]+ _{e un frammento principale a m/z 385 [M+ Na-162]}- _{dovuto alla perdita della}

porzione zuccherina.

L’analisi dello spettro monodimensionale 1_{H-NMR ed il confronto con lo spettro HSQC e}

con i dati presenti in letteratura hanno consentito di caratterizzare il composto 17 come estere metilico del 10-O-p-idrossibenzoil scandoside (Otsuka et al., 1991). I dati NMR sono riportati in Tab. 3.6.

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3OD) del composto 17 estere metilico del 10-O-p-idrossibenzoil scandoside

Posizione δH δC Posizione δH δC Aglicone 1'' - 122.0 1 5.27 d (7.0) 98.5 2'', 6'' 7.92 d (9.0) 133.0 3 7.54 d (2.0) 154.0 3'', 5'' 6.85 d (9.0) 116.3 4 - 110.7 4'' - 163.8 5 3.07 br dd (7.0, 5.0) 45.6 12 - 167.8 6 4.59 dd (5.0, 2.0) 82.5 Glucosio 7 5.90 d (2.0) 132.6 1' 4.69 d (8.0) 100.6 8 - 142.4 2' 3.23 dd (8.0, 9.0) 74.8 9 3.12 br t (8.0) 47.8 3' 3.36 t (9.0) 78.5 10a 5.08 br d (15.0) 63.7 4' 3.29 t (9.0) 71.5 10b 4.93 br d (15.0) 5' 3.30 m 78 .0 11 - 170.3 6'a 3.85 dd (12.0, 2.0) 62.8 11-OCH3 3.76 s 52.1 6'b 3.61 dd (12.0, 6.0)

3.4.7 Composto 18: nuovo iridoide naturale

cromatografia su colonna Sephadex LH-20 dell’estratto RM (9.4 g) eluendo con MeOH.

Successivamente è stata analizzata mediante RP-HPLC, utilizzando come fase mobile una

miscela eluente MeOH-H2O (4:6) (tR= 32 min), ottenendo l’isolamento del nuovo composto

18 (Fig. 3.9), mai isolato fino ad oggi in natura, che si presenta come un solido amorfo giallo-bruno.

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Fig. 3.9 Struttura composto 18: estere metilico dell’acido 10-O-p-idrossibenzoil deacetilasperulosidico

La formula molecolare C24H28O13 è stata determinata attraverso analisi HR-ESI-MS (m/z

523.1158 [M-H]-_{) (Fig. 3.10)}_e13_{C-NMR. Nello spettro ESIMS/MS è presente un picco a m/z}

361 [M- H-162]- _{dovuto alla perdita di uno zucchero esoso. Le bande di assorbimento dello}

spettro UV (MeOH) a lunghezza d’onda λmax (log ε) 252 (4.11), 340 sh (3.94) nm indicano la

presenza di un anello aromatico coniugato con una funzione chetonica.

Fig. 3.10 Spettro HRESIMS in modalità negativa del composto 18

L’osservazione dello spettro 1_{H-NMR ha rivelato segnali protonici tipici di un iridoide}

glucoside con la presenza di un doppio legame a δ 6.09 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-7), un gruppo metinico idrossilato a δ 4.90 (1H, segnale sovrapposto, H-6), un gruppo metilenico evidenziato dai segnali a δ 5.25 e a 5.00 (ciascuno 1H, d, J = 15.0 Hz, H-10), ed infine un gruppo metossilico legato ad un acido carbossilico a δ 3.78 (3H, s, H-11-OCH3) (Fig. 3.11).

(18)

Fig. 3.11 Spettro 1_{H-NMR del composto 18}

L’analisi comparata degli spettri 1D-TOCSY (Fig. 3.13 e 3.14) ha mostrato la presenza di un residuo di glucosio e di un sistema di spin corrispondente all’anello ciclopentanico fuso con un anello eterociclico ossigenato a 6 termini, portante una funzione emiacetalica, tipico del nucleo dell’iridano.

Gli spettri 13_{C e}13_{C DEPT NMR (Tab. 3.7) del composto 18 mostrano 24 segnali, 14 dei quali}

sono stati attribuiti ad uno zucchero esoso, a un gruppo p-idrossibenzoilico e ad uno metossilico. La parte agliconica del composto 18 è stata identificata come estere metilico

dell’acido deacetil asperulosidico (Otsuka et al., 1991). Le correlazioni HMBC tra H2-10 e

C-12, H2-10 e C-9, H-7 e C-8, H-7 e C-10, H-2'' e C-4'', H-5'' e C-2'' motivano la presenza di un

gruppo p-idrossibenzoilico legato al C-10, mentre la correlazione H-1glc—C-1 conferma la

posizione del residuo glucopiranosidico. Sulla base di questi dati e dal confronto con lo spettro HSQC (Fig. 3.12), il composto 18 è stato caratterizzato come estere metilico dell’acido 10-O-p-idrossibenzoil deacetilasperulosidico. I dati NMR sono riportati in Tab. 3.7.

(19)

Fig. 3.12 Spettro HSQC del composto 18

(20)

Fig. 3.14 Spettro 1D-TOCSY del glucoside del composto 18 Tab. 3.7 Dati 1_{H-NMR (600 MHz in CD}

3OD) e 13C-NMR (150 MHz in CD3OD) del composto 18 estere metilico dell’acido 10-O-p-idrossibenzoil deacetilasperulosidico Posizione δH δC Posizione δH δC Aglicone 1'' - 122.0 1 5.15 d (8.5) 101.6 2'', 6'' 7.97 d (8.5) 132.5 3 7.68 s 155.0 3'', 5'' 6.88 d (8.5) 116.0 4 - 108.0 4'' - 164.0 5 3.11 br t (9.0, 2.0) 42.0 12 - 167.5 6 4.90a_75.0 _Glucosio 7 6.09 d (2.0) 131.3 1' 4.77 d (7.5) 100.1 8 - 146.0 2' 3.25 dd (7.5) 74.4 9 2.72 br t (8.0) 46.1 3' 3.38 t (9.0) 77.9 10a 5.25 br d (15.0) 63.0 4' 3.29 t (9.0) 71.2 10b 5.00 br d (15.0) 5' 3.33 m 78 .3 11 - 170.0 6'a 3.90 dd (12.0, 3.0) 62.6 11-OCH3 3.78, s 51.5 6'b 3.68 dd (12.0, 4.5)

I valori di chemical shift sono indicati in ppm e le costanti di accoppiamento J, in Hz, sono riportate tra parentesi; dati confermati da esperimenti COSY, 1D-TOCSY e HMBC; a_{segnali sovrapposti}

(21)

3.4.8 Composto 19

come fase mobile una miscela eluente MeOH-H2O (4:6) (tR= 5 min), ottenendo l’isolamento

del composto 19 (Fig. 3.15), che si presenta come una polvere amorfa.

Fig. 3.15 Struttura composto 19: deacetil asperuloside

particolare in modalità negativa è stato registrato il picco quasi molecolare a m/z 371 [M-H]- _{, mentre in modalità positiva è stato registrato il picco quasi molecolare equivalente}

dovuto al composto sodiato a m/z 395 [M+Na]+_{e due frammenti principali a m/z 351 [M+}

Na-44]+ _{e a m/z 233 [M+ Na-162]}+_{. Il confronto con i dati spettroscopici relativi ai composti}

precedenti ottenuti mediante esperimenti monodimensionali 1_{H-NMR e bidimensionali}

HSQC, e con i dati presenti in letteratura ha permesso di caratterizzare il composto 19 come deacetil asperuloside (Otsuka et al., 1991). I dati NMR sono riportati in Tab. 3.8.

(22)

3OD) del composto 19 deacetil asperuloside Posizione δH δC Posizione δH δC Aglicone 11 - 172.9 1 5.96 d (8.5) 93.4 Glucosio 3 7.29 d (2.0) 150.3 1' 4.67 d (8.0) 99.9 4 - 106.5 2' 3.21 dd (9.0, 8.0) 74.8 5 3.67 37.5 3' 3.43 dd (9.0, 8.0) 78.4 6 5.56 t (6.5) 86.7 4' 3.28 t (9.0) 71.6 7 5.64 br s 125.8 5' 3.29 m 77 .9 8 - 149.8 6'a 3.89 dd (12.0, 2.0) 62.8 9 3.28 t (8.0) 45.0 6'b 3.66 dd (12.0, 6.0) H210 4.19 br s 60.1

3.5 Cumarine

Le cumarine sono composti biciclici aromatici caratterizzati dal nucleo 5,6-benzo-2-pirone, detto anche α-cromone, biosinteticamente derivanti dall’acido cinnamico.

Sono classificate in quattro gruppi, in base alla natura chimica di alcuni loro costituenti o al tipo di molecola con la quale il nucleo fondamentale si lega (Bruni et al., 2000):

1. Idrossicumarine: se la cumarina contiene uno o più ossidrili

2. Furanocumarine: se il nucleo della cumarina risulta condensato con quello del furano.

3. Piranocumarine: se il nucleo della cumarina si condensa con quello del pirano 4. Cumarine glicosidate

Nella specie A. thymifolium (Ruiz & Pav.) Standl. sono state identificate cumarine appartenenti ai primi tre gruppi. In particolare i composti 1 e 2 sono classificabili come furanocumarine angolari, i composti 6, 9 e 22 come piranocumarine angolari, mentre 8 e 10 sono delle idrossicumarine.

(23)

3.5.1 Composto 1

Il composto è stato isolato dall’estratto cloroformico (RC). La frazione RC/4 è stata

ottenuta in seguito a cromatografia dell’estratto RC (5.0 g) su colonna di gel di silice

usando il sistema Biotage®_{Isolera™ Spektra eluendo con CHCl}

3. Tale metabolita è stato

isolato anche dalla frazione RC/9/8, ottenuta in seguito a cromatografia RP-HPLC,

utilizzando come fase mobile una miscela eluente MeOH-H2O (55:45) (tR= 19 min).

E’ stato così isolato il composto 1 (Fig. 3.16) che si presenta come un solido cristallino giallo.

Fig.3.16 Struttura composto 19: hedyotiscone A

La formula molecolare del composto è stata determinata come C15H14O4 mediante

esperimenti ESI-MS che mostrano in modalità positiva il picco quasi molecolare a m/z 259

[M+H]+_{e quello relativo alla forma dimerica a m/z 539 [2M+Na]}+_.

Lo spettro 1_{H-NMR rivela due doppietti a δ= 7.60 e δ= 6.27, ognuno con J= 9.6 Hz}

caratteristici della parte δ-lattonica-α,β-insatura dell’anello cumarinico. Il segnale a δ= 6.78 (1H, s H-5) indica la presenza di un anello aromatico penta-sostituito. Un altro singoletto a δ= 3.92 (3H) è stato assegnato a un gruppo metossilico legato all’anello aromatico. Sono inoltre presenti segnali di protoni metilenici geminali a δ= 3.54 (1H, dd, J=16.2, 8.1 Hz, H-2'a) e 3,21 (1H, dd J=16.2 e 8.1 Hz, H-2'b), segnali di due protoni olefinici terminali a δ= 5.13 e δ= 4.99 (ciascuno 1H, s, H2-4'), il segnale di un protone metilico vinilico a δ= 1.79 (3H, s,

H-5') ed infine il segnale del protone ossimetinico allilico a δ=5.42 (1H, t, J=8.1 Hz, H-1'). I picchi di correlazione nello spettro HMBC tra C-1'-H-2', C-1'-H-4', e C-1'-H-5', hanno confermato la presenza di un gruppo isopropenilico legato all’anello furanico. La struttura proposta è stata confermata per confronto con i dati presenti in letteratura (Chen et al.,

2006) che ne hanno permesso il riconoscimento come hedyotiscone A. I dati 1_{H-NMR e}13

C-NMR relativi ai segnali di chemical shifts del composto 1 sono riportati qui di seguito (Tab. 3.9):

(24)

3OD) del composto 1 hedyotiscone A Posizione δH δC Posizione δH δC 2 - 161.2 1' 5.42, t (8.1) 88.7 3 6.27 d (9.6) 112.7 2'a 3.54 dd (16.2, 8.1) 31.8 4 7.60 d (9.6) 143.6 2'b 3.21 dd (16.2, 8.1) 4a - 112.5 3' - 141.9 5 6.78 s 109.4 4'a 5.13 s 113.2 6 - 142.4 4'b 4.99 s 7 - 152.7 5' 1.79 s 16.9 8 - 114.8 OCH3 3.92 s 56.4 8a - 146.1

Il composto è stato isolato dagli estratti cloroformico (RC) e metanolico (RM). La frazione

RC/7/10-11/5 è stata ottenuta in seguito a due cromatografie successive su colonna di gel

di silice usando il sistema Biotage®_{Isolera™ Spektra, la prima a partire dell’estratto R} C (5.0

g) eluendo con CHCl3 e la seconda a carico della frazione RC/7 ottenuta eluendo con CHCl3

→ CHCl3–MeOH (98:2) e CHCl3–MeOH (98:2) → MeOH. Tale frazione è stata

successivamente analizzata mediante RP-HPLC, utilizzando come fase mobile una miscela eluente MeOH-H2O (75:25) (tR= 7 min). Questo metabolita è stato isolato anche dalle

frazioni RC/9/7 e RC/12/7 ottenute in seguito a cromatografia RP-HPLC, utilizzando in

entrambi i casi la fase mobile eluente MeOH-H2O (55:45) (tR= 12 min) e (tR= 19 min) e dalle

frazioni RM/10/13 e RM/11/8 derivanti da cromatografia su colonna Sephadex LH-20

dell’estratto metanolico eluendo con MeOH e successivamente analizzate mediante

RP-HPLC, utilizzando rispettivemente come fase mobile una miscela eluente MeOH-H2O (4:6)

(tR= 34 min) e MeOH-H2O (45:55) (tR= 29 min). Ciò ha condotto all’isolamento del composto 2 (Fig. 3. 17) che si presenta come un solido cristallino giallo.

(25)

Fig. 3.17 Struttura composto 2: hedyotiscone B

La formula molecolare del composto è stata determinata come C14H12O4 tramite

esperimenti ESI-MS che mostrano in modalità negativa il picco quasi molecolare a m/z 243

[M-H]-_{e un picco di frammentazione a m/z 199 [M-H-44]}-_{. I dati}1_{H-NMR e}13_{C-NMR sono}

comparabili a quelli del composto 1, eccetto che per l’assenza in 2 del segnale relativo al gruppo metossilico. In aggiunta, le differenze di peso molecolare (m/z=258 per 1 e m/z=244 per 2) e i dati 13_{C-NMR (δ}

C-6= 142.4 per 1 e δC-6= 144.5 per 2) suggeriscono la presenza di un

gruppo idrossilico invece di uno metossilico nel composto 2 (Chen et al., 2006). Le

assegnazioni 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Tab. 3.10) sono state inoltre confermate da esperimenti}

HSQC ed hanno condotto alla caratterizzazione del composto 2 come hedyotiscone B.

Tab.3.10 Dati 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (250 MHz in CD}

3OD) del composto 2 hedyotiscone B Posizione δH δC Posizione δH δC 2 - 161.0 8a - 146.1 3 6.23 d (9.6) 113.8 1' 5.42 t (8.0) 88.6 4 7.60 d (9.6) 144.8 2' 3.56 dd (16.2, 8.0) 32.4 4a - 112.9 3.24 dd (16.2, 8.0) 5 6.86 s 112.6 3' - 139.5 6 - 144.5 4' 5.13 s 114.4 7 - 152.1 4.99 s 8 - 151.1 5' 1.79 s 17.12 I valori di chemical shift sono indicati in ppm e le costanti di accoppiamento J, in Hz, sono riportate tra parentesi

In letteratura è presente uno studio riguardante l’attività biologica dei composti 1 e 2; essi sono stati saggiati per la loro citotossicità nei confronti di linee cellulari umane tumorali di

(26)

fegato (Hep G2), polmone (A549) e seno (MDA-MB-231 e MCF-7). I composti 1 e 2 hanno

mostrato valori marginali di citotossicità verso Hep G2 con un IC50 pari a 14.4 e 17.4 µg/ml

rispettivamente (sono stati considerati significativi valori < 4µg/ml) e sono risultati debolmente citotossici (5-30% di inibizione) a 20 µg/ml nei confronti delle linee cellulari A549, MDA-MB-231 e MCF-7 (Chen et al., 2006).

Il composto è stato isolato dall’estratto cloroformico (RC). La frazione RC/9/3 è stata

ottenuta in seguito a cromatografia dell’estratto RC (5.0 g) su colonna di gel di silice usando

il sistema Biotage®_{Isolera™ Spektra eluendo con CHCl}

3 → CHCl3-MeOH (98:2);

successivamente tale frazione è stata sottoposta a cromatografia ad alta pressione su fase inversa RP-HPLC eluendo con una miscela MeOH-H2O (55:45) (tR= 10 min). E’ stato così

isolato il composto 5 (Fig. 3.18), un solido cristallino otticamente attivo con [α]D= -10 (c

0.16, MeOH) e contrassegnato da bande di assorbimento UV (MeOH) a lunghezza d’onda λmax= (log ε) 346 (4.11) e 209 (4.56) nm.

Fig.3.18 Struttura composto 5: cneorum-cumarina B

La formula molecolare del composto è stata determinata come C15H16O5 ed è stata ottenuta

mediante esperimenti ESI-MS che mostrano in modalità negativa il picco quasi molecolare

m/z 275 [M-H]-_{, e i picchi di frammentazione a m/z 205 [M-H-70]}-_{e 190 [M-H-85]}-_dovuti

rispettivamente alla rottura dell’anello cumarinico e alla perdita della catena in C-8. In modalità positiva è stato registrato il picco quasi molecolare relativo al composto sodiato a

m/z 299 [M+Na]+_{, il picco di frammentazione a m/z 281 [M+Na-18]}+_{, ed infine il picco a m/z}

575 [2M+Na]+_{. Lo spettro}1_{H-NMR mostra i segnali tipici del nucleo cumarinico, ovvero i}

due doppietti relativi a protoni olefinici a δ= 6.21 e δ= 7.62 e il segnale del protone dell’anello benzenico a δ= 7.06. Il composto è stato quindi identificato come 7-idrossi-8-(2'-idrossi-3'-metil-butenil)-6-metossicumarina o cneorum- cumarina B grazie al

confronto dei suoi dati 1_{H-NMR e di altre proprietà spettroscopiche con quelli riportati in}

(27)

Tale metabolita è stato isolato solamente nella specie Cneorum pulverulentum (Vent.) (Rutaceae) nel 1975 (Mondon e Callsen, 1975). I suoi dati 13_{C-NMR sono riportati per la}

prima volta in Tab. 3.11.

3OD) del composto 5 cneorum-cumarina B Posizione δH δC Posizione δH δC 2 - 164.3 8a - 149.8 3 6.21 d (10.0) 111.5 1’ 3.21 dd (13.5, 2.0) 30.4 4 7.62 d (10.0) 146.7 3.12 dd (13.5, 10.0) 4a - 115.0 2’ 4.49 m 76.0 5 7.06 s 108.2 3’ - 149.2 6 - 146.5 H2-4’ 4.69 s 111.2 7 - 148.0 5’ 1.87 s 18.0 8 - 114.5 6-OCH3 3.92 s 57.0

ottenuta in seguito a cromatografia su colonna di gel di silice usando il sistema di purificazione flash Biotage® Isolera™ Spektra dell’estratto RC (5.0 g) eluendo con CHCl3

-MeOH (98:2) → CHCl3-MeOH (95:5). Successivamente è stata analizzata mediante RP-HPLC,

utilizzando come fase mobile una miscela eluente MeOH-H2O (55:45) (tR= 10 min). Il

(28)

Fig. 3.19 Struttura composto 6: toddanina

La formula molecolare del composto è stata determinata come C15H16O5 ed è stata ottenuta

mediante esperimenti ESI-MS, che mostrano in modalità positiva il picco quasi molecolare

a m/z 277 [M+H]+_{, i frammenti a m/z 259 [M+H-18]}+ _e_{m/z 205 [M+H-18-54]}+_{, oltre che il}

picco relativo alla forma dimerica a m/z 575 [2M+Na]+_{. L’analisi dello spettro}

monodimensionale 1_{H-NMR, molto simile a quello della brailina suggerisce lo scheletro di}

una 6-metossipiranocumarina angolare (Tsai et al., 1997). Il confronto con gli spettri bidimensionali HSQC, HMBC e DQF-COSY e con i dati presenti in letteratura ha consentito di definire la struttura del composto 6, caratterizzato come toddanina. Tale composto è stato isolato per la prima volta dalla specie Toddalia asiatica (L.) Lam. appartenente alla famiglia delle Rutaceae (Tsai et al., 1998). I dati 1_{H-NMR sono riportati in Tab. 3.12.}

Tab. 3.12 Dati 1_{H-NMR (250 MHz in CD}

3OD) del composto 6 toddanina Posizione δH Posizione δH 2 - 8a - 3 6.28 d (9.4) 1’ - 4 7.61 d (9.4) 2’ 3.91 d t (6.6, 5.1) 4a - 3’ 3.17 dd (17.7, 5.1) 5 6.77 s 2.98 dd (17.7, 5.1) 6 - 4’ 1.39 s 7 - 5’ 1.41 s 8 - OCH3 3.90 s

Il composto è stato isolato dagli estratti cloroformico (RC) e metanolico (RM). La frazione

RC/14/2 è stata ottenuta in seguito a cromatografia su colonna di gel di silice usando il

sistema di purificazione flash Biotage® Isolera™ Spektra dell’estratto cloroformico con

eluizione CHCl3-MeOH (95:5) → CHCl3-MeOH (9:1). Successivamente è stata analizzata

mediante RP-HPLC, utilizzando come fase mobile una miscela eluente MeOH-H2O (45:55) (tR= 10 min); si è ottenuto così il composto 8 (Fig. 3.20) che si presenta come un solido giallo

aghiforme. Tale metabolita è stato isolato anche dalle frazioni RM/11/4 e RM/12/1, ottenute

(29)

MeOH e sottoposte a RP-HPLC, utilizzando una miscela eluente MeOH-H2O (45:55) con (tR=

6 min) e (tR= 9 min) rispettivamente.

Fig. 3.20 Struttura composto 8: fraxetina

mostrano in modalità negativa il picco quasi molecolare m/z 207 [M-H]-_{e il picco di}

frammentazione a 192 [M-H-15]- _{dovuto alla perdita di un metile, mentre in modalità}

positiva il picco quasi molecolare a 209 [M+H]+_{. Il segnale di un carbonile estereo a δ= 163.8}

osservato nello spettro 13_{C-NMR e i segnali di protoni accoppiati a δ= 6.20 (1H, d, J= 9.4}

H-3) e a δ= 7.89 (1H, d, J= 9.4, H-4) nello spettro 1_{H-NMR indicano la presenza di uno scheletro}

cumarinico. L’analisi degli spettri 1D e 2D NMR ed il confronto con i dati presenti in letteratura hanno consentito di caratterizzare il composto 8 come fraxetina (Okuyama et

al., 1996).

Tab.3.13 Dati 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (250 MHz in CD}

3OD) del composto 8 fraxetina Posizione δH δC Posizione δH δC 2 - 163.8 7 - 140.74 3 6.20, d (9.4) 112.61 8 - 134.02 4 7.89, d (9.4) 146.77 9 - 140.60 5 6.73, s 101.3 10 - 112.13 6 - 147.10 OCH3 3.89, s 56.78

3.5.6 Composto 9: nuova cumarina naturale

il sistema Biotage®_{Isolera™ Spektra, eluendo con CHCl}

3-MeOH (95:5) → CHCl3-MeOH (9:1);

(30)

inversa RP-HPLC eluendo con una miscela MeOH-H2O (45:55) (tR= 17 min). Ciò ha condotto

all’isolamento del composto 9 (Fig. 3.21) che si presenta come una polvere color giallo-chiaro e che risulta otticamente attivo con [α]D= -33 (c 0.08, MeOH).

Fig. 3.21 Struttura composto 9: 4’-idrossi-2’-diidrotoddanina

La formula molecolare del composto, determinata come C15H14O6 è stata ricavata mediante

esperimenti HR-ESI-MS (m/z 291.0599 [M+H]+_{, 313.0467 [M+Na]}+_{) (Fig. 3.22) e con il}

supporto degli spettri 13_{C e}13_{C-DEPT NMR. Lo spettro UV (λ}

max = 345, 304, 270sh, 253 nm)

indica la presenza di un nucleo cumarinico (Amaro-Luis et al., 1990).

Fig. 3.22 Spettro HRESIMS in modalità positiva del composto 9

Lo spettro 1_{H-NMR a 600 MHz (Fig. 3.23) (Tab. 3.14) mostra i doppietti caratteristici dei}

(31)

H-5, che indica la presenza di un anello aromatico penta-sostituito. Un altro singoletto a δ 4.03 è stato assegnato ai protoni di un gruppo metossilico aromatico. Gli altri chemical

shifts nello spettro 1_{H-NMR suggeriscono lo scheletro di una 6-metossipiranocumarina}

angolare; si osservano infatti tre ulteriori singoletti a δ 7.02, 3.78 e 1.62, rispettivamente attribuibili a un protone olefinico, a un gruppo idrossimetilenico e ad uno metilico.

La connettività di ogni protone con il rispettivo carbonio è stata confermata tramite lo spettro bidimensionale HSQC (Fig. 3.24), mentre le assegnazioni dei dati 13_{C-NMR sono}

state compiute per mezzo di esperimenti HMBC (Fig. 3.25). Nel composto 9 è stato riconosciuto lo scheletro base della toddanina, grazie ai dati riportati in letteratura (Tsai et

al., 1998). In particolare, lo spettro HMBC mostra che il segnale a δ 7.02 (H-3') si correla con

quello a δ 120.9 (C-8) e a 164.5 (C-2'); H2-4' (δ 3.78) mostra correlazioni con C-5' (δ 24.0),

C-1' (δ 73.0) e C-2' (δ 164.5); Me-5' (δ 1.62) correla con C-1' (73.0) e C-2' (δ 164.5); H-5 (δ 7.06) correla con C-6 (δ 144.5), C-7 (δ 147.6); H-4 (δ 8.06) con C-2 (δ 162.3), C-3 (δ 114.0),

C-4a (δ 115.3), C-5 (δ 100.0), e C-8a (δ 143.9). Un crosspeak tra i segnali a δ 4.03 (OCH3) e

a δ 144.5 ppm (C-6) conferma la posizione del metossile sul C-6. Sulla base di queste evidenze, la struttura del composto 9 è stata determinata come 4'-idrossi-2'-diidrotoddanina, una nuova cumarina naturale.

(32)

(33)

3OD) e 13C-NMR (150 MHz in CD3OD) del composto 9 4'-idrossi-2'-diidrotoddanina Posizione δH δC Posizione δH δC 2 - 162.3 8a - 143.9 3 6.39 d (9.4) 114.0 1’ - 73.0 4 8.06 d (9.4) 146.8 2’ - 164.5 4a - 115.3 3’ 7.02 s 105.2 5 7.06 s 100.0 4’ 3.78 s 69.0 6 - 144.5 5’ 1.62 s 24.0 7 - 147.6 OCH3 4.03 s 56.0 8 - 120.9

I valori di chemical shift sono indicati in ppm e le costanti di accoppiamento J, in Hz, sono riportate tra parentesi; dati confermati da esperimenti COSY, 1D-TOCSY, HSQC e HMBC.

il sistema Biotage®_{Isolera™ Spektra, eluendo con CHCl}

3-MeOH (9:1) → MeOH;

successivamente tale frazione è stata sottoposta a cromatografia ad alta pressione su fase

inversa RP-HPLC eluendo con una miscela MeOH-H2O (4:6) (tR= 23 min). E’ stato così isolato

il composto 10 (Fig. 3.26) che si presenta come un solido cristallino, otticamente attivo con [α]D= -6 (c 0.15, MeOH).

(34)

La formula molecolare del composto, determinata come C15H18O6, è stata ottenuta

mediante esperimenti HR-ESI-MS che mostrano il picco relativo allo ione

pseudo-molecolare a m/z 293.1160 [M-H]-_{e tre frammenti principali a m/z 278 (dovuto alla perdita}

di 15 unità di massa), m/z 205 (per la perdita di 88 unità di massa), e a m/z 190 (per la

perdita di 15 e di 88 unità di massa). Le somiglianze dello spettro UV (λmax = 345, 257sh,

230sh nm) con quello del composto 9 indicano la presenza di un nucleo cumarinico. L’analisi dello spettro 1_{H-NMR mostra due doppietti relativi ai protoni H-3 e H-4 (J 9.5 Hz)}

rispettivamente a δ 6.19 e δ 7.88, un protone aromatico a δ 7.04 (1H, s, H-5), un gruppo 2,3-diidrossiisopentilico evidenziato dai segnali a δ 1.30 (6H, s, H-4' e H-5'), 3.04 (1H, br d,

J = 13.0 Hz, H-1'), 3.20 (1H, dd, J = 13.0, 10.5 Hz, H-1'), 3.73 (1H, m, H-2'), ed infine un gruppo

metossilico a δ 3.92 (3H, s). Lo spettro 13_{C-NMR rivela la presenza di 15 carboni di cui due}

metilici, uno metossilico, uno metilenico, quattro metinici e sette quaternari. Le attribuzioni dei chemical shifts degli atomi di carbonio sono state stabilite tramite gli spettri HSQC e

HMBC. Sono state infatti osservate correlazioni HMBC tra H-4C-2, H-4C-4a, H-4C-5;

H-5C-6, H-5C-8, H-5C-8a; H-1'C-8, H-1'C-8a, H-1'C-2'; H-4'/H-5'C-1', H-4'/H-5'C-2', H-4'/H-5'C-3'; OMeC-6 che hanno permesso inoltre di posizionare il gruppo metossilico sul C-6 e il gruppo 2,3-diidrossiisopentilico sul C-8. Sulla base di questi dati, il composto 10 è stato caratterizzato come 7-idrossi-8-[2’,3’-diidrossiisopentil]-6-metossicumarina, una nuova cumarina naturale.

La stereochimica relativa al gruppo 2’,3'-diolo è ancora in fase di elucidazione e richiede l’uso di tecniche di dicroismo circolare. I dati NMR del composto 10 sono riportati in Tab. 3.15.

3OD) e 13C-NMR (150 MHz in CD3OD) del composto 10 7-idrossi-8-[2’,3’-diidrossiisopentil]-6-metossicumarina Posizione δH δC Posizione δH δC 2 - 164.5 8a - 150.0 3 6.19 d (9.5) 111.0 1'a 3.04 br d (13.0) 28.6 4 7.88 d (9.5) 146.6 1'b 3.20 dd (13.0, 10.5) 4a - 115.0 2' 3.73 m 79.4 5 7.04 s 108.0 3' - 74.0 6 - 146.5 4' 1.30 s 25.0 7 - 148.0 5' 1.30 s 24.0 8 - 116.0 6-OCH3 3.92 s 56.3

I valori di chemical shift sono indicati in ppm e le costanti di accoppiamento J, in Hz, sono riportate tra parentesi; dati confermati da esperimenti COSY, 1D-TOCSY, HSQC e HMBC.

(35)

l’isolamento del composto 22 (Fig. 3.27), che si presenta come un solido cristallino.

Fig. 3.27 Struttura composto 22: 6-demetil-4'-idrossi-2'-diidrotoddanina o 2',4'-diidrossinorbrailina

La formula molecolare del composto 22 (C14H12O6) è stata determinata mediante

esperimenti HR-ESI-MS (ione a m/z 277.0578 [M+H]+_{) e con il supporto dei dati}13_C-NMR.

Lo spettro ESI-MS mostra in modalità negativa il picco quasi molecolare a m/z 275 [M-H]–

e due frammenti a m/z 245 [M-H-30]-_{e 201 [M-H-30-44]}-_{. Il confronto dei dati}

spettroscopici del composto 22 con quelli del composto 9 (Tab. 3.16 e Tab. 3.14) indica che essi differiscono solo per il gruppo metossilico sul C-6, assente nel composto 22. Tale metabolita è stato quindi identificato come 6-demetil-4'-idrossi-2'-diidrotoddanina o 2',4'-diidrossinorbrailina.

(36)

3OD) e 13C-NMR (150 MHz in CD3OD) del composto 22 2',4'-diidrossibnorbrailina Posizione δH δC Posizione δH δC 2 - 162.5 8 - 120.5 3 6.39 d (9.4) 114.3 8a - 143.7 4 7.98 d (9.4) 146.4 1’ - 73.2 4a - 115.7 2’ - 164.7 5 7.11 s 99.5 3’ 6.97 s 105.0 6 - 143.0 4’ 3.84 s 69.3 7 - 147.0 5’ 1.65 s 23.4

I valori di chemical shift sono indicati in ppm e le costanti di accoppiamento J, in Hz, sono riportate tra parentesi; dati confermati da esperimenti COSY, 1D-TOCSY, HSQC e HMBC.

3.6 Flavonoidi

I flavonoidi rappresentano una vasta classe di composti fenolici con struttura triciclica basata sul nucleo del γ-benzopirone in cui sono presenti un anello benzilico (A), un secondo anello di tipo piranico (C) fuso con il precedente, ed un terzo anello (B) di tipo benzilico. La diversa funzionalizzazione dell’anello centrale genera le varie classificazioni. Nel genere

Arcytophyllum sono stati identificati flavonoidi appartenenti alle classi di flavanoni e

flavonoli; dalla specie A. thymifolium (Ruiz & Pav.) Standl. sono stati isolati 2 flavanoni e 5 flavonoli, glicosidici e non, che differiscono tra loro per la porzione zuccherina e diversi sostituenti.

Il composto è stato isolato dall’estratto cloroformico (RC). La frazione RC/7/10-11/9 è stata

ottenuta in seguito a due cromatografie successive su colonna di gel di silice usando il

sistema Biotage®_{Isolera™ Spektra, la prima a partire dell’estratto R}

C (5.0 g) eluendo con

CHCl3 e la seconda a carico della frazione RC/7 ottenuta eluendo con CHCl3 → CHCl3 –MeOH

(98:2) e CHCl3 –MeOH (98:2) → MeOH. Tale frazione è stata successivamente analizzata

mediante RP-HPLC, utilizzando come fase mobile una miscela eluente MeOH-H2O (75:25)

(tR= 19 min). Ciò ha condotto all’isolamento del composto 3 (Fig. 3.28) che si presenta come

(37)

Fig. 3.28 Struttura composto 3: 7-O-(3''-metilbut-2''-enil)-ossi naringenina o 7-prenilossinaringenina

La formula molecolare del composto è stata determinata come C20H20O5 dall’analisi di

esperimenti ESI-MS che mostrano in modalità negativa il piccco quasi molecolare a m/z 339

[M-H]-_{, e in modalità positiva un picco quasi molecolare a m/z 341 [M+H]}+_{. L’analisi dello}

spettro monodimensionale 1_{H-NMR, e degli spettri bidimensionali HSQC e HMBC ed il}

confronto con i dati presenti in letteratura (Al-Rehaily et al., 2003) hanno consentito di caratterizzare il composto 3 come O-(3''-metilbut-2''-enil)-ossi naringenina o 7-prenilossinaringenina. Lo stesso composto privo del gruppo prenile in posizione C-7 (naringenina) è stato isolato nella specie A. nitidum (Kunth) Schltdl. (Cap. 2.1.2.1). I dati 1

H-NMR e 13_{C-NMR sono riportati in Tab. 3.17.}

3OD) del composto 3 7-prenilossinaringenina Posizione δH δC Posizione δH δC 2 5.39 dd (12.0, 3.0) 78.9 1' - 130.4 3a 3.16 dd (17.0, 12.0) 43.2 2', 6' 7.34 d (8.0) 128.0 3b 2.75 dd (17.0, 3.0) 3',5' 6.85 d (8.0) 115.7 4 - 196.1 4’ - 156.3 5 - 164.0 1'' 4.58 d (7.0) 65.4 6 6.04 d (2.0) 94.9 2'' 5.43 t (6.5) 118.5 7 - 162.9 3'' - 139.2 8 6.07 d (2.0) 95.8 4'' 1.81 s 25.8 9 - 167.4 5'' 1.76 s 18.2 10 - 103.1

(38)

3.6.2 Composto 7: nuovo flavonoide naturale

il sistema Biotage®_{Isolera™ Spektra eluendo con CHCl}

3-MeOH (98:2 → 95:5) → CHCl3

-MeOH (95:5 → 9:1); successivamente tale frazione è stata sottoposta a cromatografia ad

alta pressione su fase inversa RP-HPLC eluendo con una miscela MeOH-H2O (7:3) (tR= 22

min). E’ stato così isolato il composto 7 (Fig. 3.29) che si presenta come un solido amorfo

color arancio e che risulta otticamente attivo con [α]D= -37 (c 0.08, MeOH).

Fig. 3.29 Struttura composto 7: 7-O-(3''-metillbut-2''-enil)-ossi eriodictiolo o 7-prenilossieriodictiolo

La formula molecolare del composto 7 è stata determinata come C20H20O6 ed è stata

ottenuta mediante analisi HR-ESI-MS (m/z 379.1221 [M+Na]+_{) (Fig. 3.30) ed avvalendosi dei}

dati 13_{C-NMR (Tab. 3.18). Le bande di assorbimento UV (MeOH) a lunghezza d’onda λ}

max

(39)

Fig. 3.30 Spettro HRESIMS in modalità positiva del composto 7

Il composto 7 è stato identificato come 7-prenilossieriodictiolo (Garo et al., 1998) sulla base delle seguenti osservazioni relative allo spettro 1_{H-NMR (Fig. 3.31) (Tab. 3.18): anello A}

5,7-disostituito (due doppietti a δ 6.04 e 6.06), anello B 3',4'-5,7-disostituito (3 protoni aromatici come sistema ABX a δ 6.95, d, J = 2.0 Hz; δ 6.82 e 6.81, segnali sovrapposti), due segnali di gruppi metilici a δ 1.76 e 1.80 ed infine uno relativo ad un protone metinico a δ 5.44. Lo

spettro 13_{C-NMR (Tab. 3.18) evidenzia la presenza di 20 atomi di carbonio, attribuibili alla}

(40)

Le attribuzioni dei segnali NMR sono state compiute mediante esperimenti 1D-TOCSY, DQF-COSY, HSQC (Fig. 3.32) e HMBC (Fig. 3.33). Sono stati infatti identificati picchi di correlazione HMBC tra δ 6.95 (H-2') e 80.8 (C-2), 147.0 (C-4') e 119.3 (C-6'), δ 6.04 (H-6) e 168.4 (C-7), 104.2 (C-10), δ 4.58 (H-1'') e 168.4 (C-7), 120.0 (C-2''), 139.7 (C-3''), δ 3.13 e 2.74 (H-2a e H-2b) e 80.8 (C-2), 197.9 (C-4), 132.0 (C-1'), δ 1.80 (H-4'') e 120.0 (C-2''), 139.7 (C-3'') e 18.3 (C-5''). Alla luce di questi dati, la struttura del composto 3 è stata elucidata come 7-O-(3''-metillbut-2''-enil)-ossi eriodictiolo o 7-prenilossieriodictiolo, un nuovo flavanone naturale. La stereochimica relativa al C-2 sarà successivamente assegnata attraverso il dicroismo circolare.

(41)

(42)

3OD) e 13C-NMR (150 MHz in CD3OD) del composto 7 7-prenilossieriodictiolo Posizione δH δC Posizione δH δC 2 5.33 dd (12.0, 3.0) 80.8 2' 6.95 d (2.0) 114.7 3a 3.13 dd (17.0, 12.0) 44.0 3' - 146.8 3b 2.74 dd (17.0, 3.0) 4’ - 147.0 4 - 197.9 5' 6.81a _116.1 5 - 164.8 6' 6.82a _119.3 6 6.04 d (2.0) 96.2 1'' 4.58 d (7.0) 66.5 7 - 168.4 2'' 5.44 t (6.5) 120.0 8 6.06 d (2.0) 95.5 3'' - 139.7 9 - 165.0 4'' 1.80 s 26.0 10 - 104.2 5'' 1.76 s 18.3 1' - 132.0

I valori di chemical shift sono indicati in ppm e le costanti di accoppiamento J, in Hz, sono riportate tra parentesi; dati confermati da esperimenti COSY, 1D-TOCSY, HSQC e HMBC; a_{segnali sovrapposti.}

3.6.3 Composto 23

ottenuta in seguito a cromatografia su colonna Sephadex LH-20 dell’estratto metanolico eluendo con MeOH. Successivamente è stata analizzata mediante RP-HPLC, utilizzando

l’isolamento del composto 23 (Fig. 3.34), che si presenta come una polvere amorfa

giallo-chiara. Tale metabolita è stato isolato anche dalla frazione RM/11/7, ottenuta in seguito a

cromatografia RP-HPLC, utilizzando come fase mobile una miscela eluente MeOH-H2O

(43)

Fig. 3.34 Struttura composto 23: kaempferolo 3-O-β-D-glucopiranosil-(1→2)-β-D-galattopiranoside

La formula molecolare del composto è stata determinata come C27H30O16 ed è stata

ottenuta tramite esperimenti ESI-MS, che mostrano in modalità negativa il picco quasi

molecolare a m/z 609 [M-H]-_{e un frammento principale a m/z 285 [M-H-162-162]}-_{, dovuto}

alla perdita di due esosi; inoltre in modalità positiva è stato registrato il picco equivalente

al composto sodiato a m/z 633 [M+Na]+_{. L’analisi degli spettri}1_{H-NMR, 1D-TOCSY e HSQC,}

mette in evidenza la presenza di due unità saccaridiche legate al kaempferolo tramite glicosilazione in C-3. I dati presenti in letteratura (Han et al., 2001) hanno permesso di caratterizzare il composto 23 come kaempferolo 3-O-β-D-glucopiranosil-(1→2)-β-D-galattopiranoside, un flavonolo già noto in natura. I dati NMR sono riportati in Tab. 3.19.

(44)

3OD) del composto 23 kaempferolo 3-O-β-D-glucopiranosil-(1→2)-β-D-galattopiranoside Posizione δH δC Posizione δH δC Aglicone 3-Gal 1'' 5.34 d (7.5) 101.5 2 - 158.5 2'' 4.05 dd (9.0, 7.5) 80.2 3 - 134.9 3'' 3.71 dd (9.0, 4.0) 74.8 4 - 179.8 4'' 3.85 dd (4.0, 2.5) 70.0 5 - 163.1 5'' 3.42 m 76.9 6 6.20 d (2.0) 99.9 6''a 3.58 dd (12.0, 3.0) 62.6 7 - 166.1 6''b 3.56 dd (12.0, 5.0) 8 6.39 d (2.0) 94.7 2''-Glc 1''' 4.77 d (8.0) 104.7 9 - 158.8 2''' 3.38 dd (9.5, 8.0) 75.4 10 - 105.7 3''' 3.39 t (9.5) 77.9 1' - 122.7 4''' 3.40 t (9.5) 71.3 2', 6' 8.10 d (9.0) 132.0 5''' 3.34 m 78.2 3', 5' 6.90 d (9.0) 116.3 6'''a 3.82 dd (12.0, 3.0) 62.2 4’ - 161.5 6'''b 3.71 dd (12.0, 5.0)

3.6.4 Composto 25

(45)

Fig. 3.35 Struttura composto 25: quercetina 3-O-β-D-glucopiranosil-(1→2)-β-D-galattopiranoside

La formula molecolare del composto è stata determinata come C27H30O17 ed è stata

ottenuta tramite esperimenti ESI-MS, in particolare in modalità positiva sono stati registrati

il picco equivalente al composto sodiato a m/z 650 [M+Na]+ _{e un picco di un frammento a}

m/z 488 [M+Na-162]+_{, dovuto alla perdita di un esoso. L’analisi dello spettro}

monodimensionale 1_{H-NMR e dello spettro bidimensionale HSQC, mette in evidenza una}

forte somiglianza con il composto 23 per quanto riguarda la porzione zuccherina, mentre l’aglicone costituisce il punto di differenza. Il confronto con i dati spettroscopici del composto 23 e con quelli presenti in letteratura (Zerback et al., 1989) ha consentito la caratterizzazione del composto 25 come quercetina 3-O-β-D-glucopiranosil-(1→2)-β-D-galattopiranoside. I dati NMR sono riportati in Tab. 3.20.

(46)

3OD) del composto 25 quercetina 3-O-β-D-glucopiranosil-(1→2)-β-D-galattopiranoside Posizione δH δC Posizione δH δC Aglicone 6' 7.56 dd (8.5, 2.0) 121.7 2 - 154.9 3-Gal 1'' 5.26 d (7.5) 97.9 3 - 132.6 2'' 4.07 dd (9.0, 7.5) 80.2 4 - 176.9 3'' 3.71 dd (9.0, 4.0) 72.8 5 - 160.6 4'' 3.85 dd (4.0, 2.5) 67.0 6 6.19 d (1.8) 98.1 5'' 3.44 m 75.3 7 - 163.5 6''a 3.58 dd (12.0, 4.0) 59.3 8 6.39 d (1.8) 92.9 6''b 3.56 dd (12.0, 4.0) 9 - 155.7 2''-Glc 1''' 4.76 d (7.6) 103.8 10 - 103.3 2''' 3.41 dd (9.0, 7.6) 73.8 1' - 120.6 3''' 3.42 t (9.0) 76.2 2' 7.51 d (2.0) 114.8 4''' 3.42 t (9.0) 69.0 3' - 144.2 5''' 3.34 m 75.9 4’ - 147.9 6'''a 3.80 dd (12.0, 3.0) 60.1 5' 6.83 d (8.5) 115.4 6'''b 3.70 dd (12.0, 5.0)

3.6.5 Composto 26

Il composto è stato isolato dall’estratto metanolico (RM). La frazione RM/13 è stata ottenuta

in seguito a cromatografia su colonna Sephadex LH-20 dell’estratto RM (9,4 g) eluendo con

MeOH. Direttamente dalla frazione RM/13 (eluizione dopo 1080-1140 ml), senza ricorrere

a ulteriori tecniche cromatografiche, è stato isolato il composto 26 (Fig. 3.36), che si presenta come una polvere color giallo intenso.