Università di Pisa

Università di Pisa

Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali

Corso di Laurea in Biologia molecolare e cellulare

Tesi di Laurea

Anno accademico 2013-2014

“Ruolo svolto dal recettore serotoninergico 5-HT2B

sull’espressione di Target diretti dell’Acido Retinoico

durante la morfogenesi oculare di embrioni di Xenopus”

Candidato Relatori

“l’amare il proprio lavoro costituisce la migliore approssimazione concreta della felicità sulla terra” Primo Levi

INDICE

1. INTRODUZIONE

1.1. Serotonina 1.2. Ruolo della serotonina nello sviluppo embrionale

1.3. I recettori della serotonina

1.4. Il recettore 5-HT2B e ruolo durante lo sviluppo

1.5. Relazione tra l’acido retinoico e il recettore 5-HT2B durante lo sviluppo 1.6. Morfogenesi oculare

1.7. l’acido retinoico guida i corretti movimenti morfogenetici nell’occhio 1.8. Xenopus laevis come sistema modello

2. SCOPO DELLA TESI

3. MATERIALI E METODI 3.1. Embrioni di Xenopuslaevis

3.2. Microiniezione in embrioni di Xenopus 3.3. Trascritti microiniettati

3.4. Morpholino

3.5. Ibridazione in situ

 Preparazione della sonda

 Cloni usati per l’ibridazione in situ

 Ibridazione in situ “whole mount’’

3.6 Estrazione di RNA, sintesi di cDNA e qPCR

4. RISULTATI

4.1. Introduzione ai risultati

4.2. Esperimenti di perdita di funzione : microiniezione di oligonucleotidi antisenso

modificati (morpholino) in embrioni di Xenopus, diretti contro il recettore 5-HT2B

4.3. Analisi morfologica di embrioni microiniettati con morpholino

4.4. l’abrogazione del recettore 5-HT2B porta ad un alterata espressione di geni chiave

coinvolti nella sintesi dell’acido retinoico a livello della retina ventrale

4.5. Analisi del pattern di espressione di marcatori della retina ventrale : Pax2 e Vax2 4.6. La perdita di funzione del recettore 5-HT2B non interferisce sulla risposta delle

cellule del mesenchima perioculare all’acido retinoico.

4.7. la perdita di funzione del recettore 5-HT2B interferisce i livelli di espressione di

geni chiave coinvolti nella morfogenesi oculare Pitx2 e Foxc1

4.8. la perdita di funzione del gene 5-HT2B altera la componente delle cellule della

cresta neurale del POM

5. DISCUSSIONE & CONCLUSIONI

RIASSUNTO

La serotonina (5-HT) è un neuromodulatore che media una grande varietà di funzioni sia nel sistema nervoso centrale che nel sistema nervoso periferico. La 5-HT, inoltre, può agire anche come fattore di crescita e differenziamento durante l'embriogenesi attivando specifici recettori. Nel nostro laboratorio è stato dimostrato che il recettore serotoninergico 5-HT2B ha un ruolo importante nella morfogenesi retinica e craniofacciale in embrioni di Xenopus laevis. Dati presenti in letteratura, hanno suggerito una possibile interazione tra il “signaling” del recettore 5-HT2B e quello mediato dall’acido retinoico (AR), un importante morfogeno embrionale. Nel promotore del recettore 5-HT2B sono presenti elementi di risposta al AR, ed è stato dimostrato che il ‘’signaling’’ viene attivato da AR e da 5-HT2B e che queste molecole agiscono in maniera antagonistica nel differenziamento condrogenico, nello sviluppo dell’ arto e nella regolazione della la proliferazione del mesenchima della “frontonasal mass” del topo (Bhasin et al. 2004; Bhasin et al. 2004). Essendo l’acido retinoico coinvolto anche nel regolare la chiusura della fessura ottica (Matt et al., 2008), durante il mio internato di tesi, ho studiato il ruolo funzionale del recettore 5-HT2B nel mesenchima perioculare durante la morfogenesi dell'occhio, focalizzando la mia attenzione su una possibile interazione tra il “pathway” di segnalazione dell'acido retinoico e quello del recettore 5-HT2B. Usando come sistema modello Xenopus laevis, ho effettuato esperimenti di perdita di funzione genica mediante microiniezione di oligonucleotidi antisenso modificati (morpholini), diretti contro il recettore 2b rilevando insorgenza di coloboma (mancata chiusura della fessura ottica), uno dei più comuni difetti oculari congeniti. Su questi embrioni ho quindi valutato mediante ibridazione in situ e qPCR l’esressione di geni coinvolti nella sintesi e metabolismo dell’acido retinoico come Raldh3, Raldh10 e Dhrs3 e geni noti per essere target diretti dell’acido retinoico nella retina e nel mesenchima perioculare come Pax2, Vax2, Pitx2 e FoxC1. I risultati fino ad ora ottenuti suggeriscono che l'inibizione dell'attività del recettore 5-HT2B possa indurre un aumento dell’attività del AR con conseguente

aumento del dominio di espressione dei suoi target diretti. Concludendo, si può ipotizzare, che il “pathway” di segnalazione del recettore 5-HT2B interagisca, giocando un ruolo antagonistico, con il “pathway” di segnalazione dell' AR anche durante la morfogenesi oculare.

INTRODUZIONE

1.1. Serotonina

La Serotonina (5-idrossitriptamina, 5-HT) è un neurotrasmettitore appartenente alla

classe di composti aromatici detti indoli che presentano un anello a cinque atomi contente azoto condensato con un anello benzenico. Essa è un neurotrasmettitore sintetizzato nelle cellule enterocromaffini dell’apparato gastrointestinale e nei neuroni serotoninergici del sistema nervoso centrale (SNC) (Bertrand PP, Bertrand RL, 2010). La biosintesi della serotonina prevede come prima tappa l’idrossilazione del triptofano in posizione 5 per formare il 5-idrossi-triptofano (5-HTP), reazione catalizzata dalla triptofano idrossilasi (TPH). Questo enzima esiste in due isoforme che hanno una differente distribuzione nell’organismo: la TPH1 è localizzata prevalentemente nei tessuti periferici, nei fotorecettori dell’occhio e nella ghiandola pineale; la TPH2 è presente esclusivamente nei neuroni serotoninergici del SNC. Il 5-HT viene decarbossilati dalla 5-idrossitriptofano decarbossilasi a 5-HT. La 5-HT viene catabolizzata ad acido 5-idrossi-indolacetico (5-HIAA) tramite l’azione delle monoaminossidasi A (MA0A).

Fig 1. Schema riassuntivo della sintesi della Serotonina a partire dal Triptofano

La serotonina produce i suoi effetti attraverso una varietà di recettori di membrana presenti sia nel SNC che nel sistema nervoso periferico e in tessuti non neuronali, quale l’intestino e il sistema cardiovascolare. I recettori della serotonina sono suddivisi in 7 classi (da 5-HT a 5-HT7) distinte in base alle caratteristiche strutturali, funzionali e farmacologiche (Boess FG, Martin Il, 1994). La serotonina come tutte le ammine biogene, dopo il loro rilascio nel vallo sinaptico termina la sua azione grazie all’attività di specifici trasportatori localizzati sulla membrana plasmatica, che ne mediano il “reuptake”. Il trasportatore specifico della serotonina si chiama SERT ed appartiene alla famiglia dei trasportatori dei neurotrasmettitori NA+/CL- dipendenti; esso modula i livelli della serotonina nell’ambiente extracellulare, regolando, in tal modo, anche l’attivazione dei recettori (Chang AS, et al ,1996). Nel citosol, la serotonina viene internalizzata, tramite l’azione di trasportatori vescicolari di monoammine (VMTA), in vescicole di deposito dove viene

conservata fino al momento del rilascio (Sasa M,2001). Sostanze quali la cocaina e i derivati delle anfetamine, che inibiscono il “reuptake” della serotonina e ne incrementano il rilascio, agiscono prolungando l’effetto del neurotrasmettitore (Horne MK, et al 2008). Allo stesso modo la maggior parte degli antidepressivi correntemente impiegati utilizzano l’inibizione specifica del trasportatore della serotonina SERT per aumentare la concentrazione della serotonina extracellulare ( Narboux-Neme N et al, 2008).

Il sistema serotoninergico è il primo ad apparire nell’embriogenesi precoce sia dei vertebrati che degli invertebrati, prima ancora del differenziamento del sistema nervoso, ed è proprio questa fase che la serotonina raggiunge i suoi livelli più elevati di concentrazione. Negli ultimi anni sono emerse numerose evidenze a sostegno dell’ipotesi che la serotonina, prima di agire come neurotrasmettitore per l’encefalo adulto, rappresenti un fattore determinante nella modulazione della plasticità sinaptica e dello sviluppo sia del sistema nervoso centrale che di altri tessuti. I neuroni serotoninergici sono tra i primi a formarsi durante lo sviluppo embrionale, e la serotonina viene rilasciata dagli assoni in crescita prima che le sinapsi siano completamente formate (Gaspar P, et al 2003). Nel SNC dei vertebrati la maggior parte dei neuroni che producono la serotonina sono localizzati in una ristretta zona dell’encefalo, tra mesencefalo e romboencefalo, dove sono raggruppati nei nuclei del raphe denominati (B1-B9). Esiste inoltre, una piccola popolazione di questi neuroni a livello del nucleo dorso-mediale ipotalamico. Nei mammiferi, i nuclei del raphe compaiono a stadi molto precoci dello sviluppo e si suddividono in due gruppi in base alla pozione che assumono lungo l’asse rostro-caudale del tronco encefalico (Lidov e Molliver, 1982; Wallace e Lauder, 1983). La serotonina è sintetizzata anche nei fotorecettori della retina, nella ghiandola pineale, ed, a livello periferico, nelle cellule entrerocromaffini dell’intestino, nei tessuti neuroepiteliali dei polmoni e nelle cellule parafollicolari della tiroide. (Gaspar et.al, 2003). Inoltre esistono altri tipi cellulari che grazie ad una transiente o meno espressione di un trasportatore serotoninergico, possono contenere 5-HT senza produrla. Per esempio nei

mammiferi, nei primi stadi dello sviluppo, è stata riscontrata la presenza di 5-HT a livello del cuore, del mesenchima craniale (Lauder et all, 1998; Shuey et all, 1992) e della notocorda (Wallace, 1982) ; si suppone però che la 5- HT riscontrata in questi distretti sia di origine materna in quanto negli embrioni non sono ancora comparsi i neuroni che la producono.

Più tardivamente nell’embriogenesi, quando i neuroni serotoninergici sono differenziati, si riscontra la presenza di serotonina nel talamo, nella corteccia limbica, nell’ipotalamo, nella retina e nel nucleo olivare superiore (Narboux-Neme N et al., 2008). Infine, nell’organismo adulto si riscontra la presenza di serotonina nelle piastrine che la ricaptano dal circolo sanguigno e la rilasciano quando sono attivate (Buczko W, 1994). La serotonina regola numerosi processi fondamentali sia durante lo sviluppo embrionale che nell’organismo adulto. Tra le funzioni fisiologiche regolate dalla serotonina sono i processi della memoria, il ciclo sonno-veglia, la secrezione neuroendocrina, il comportamento sessuale, l’appetito, l’attività motoria, la termoregolazione e il dolore (Mohammad-Zadeh LF et al., 2008). La serotonina svolge, inoltre, un ruolo fondamentale nella regolazione dell’attività dei sistemi respiratorio, cardiovascolare e gastrointestinale (Hodges MR et al.,2008; Nebigil et al., 2001). Un’alterata regolazione della trasmissione serotoninergica nell’uomo ha effetti su numerosi aspetti comportamentali ed è la causa di disordini dell’alimentazione e di patologie neuropsichiatriche quali, ad esempio, la schizofrenia, l’ansia, lo stress e la depressione (Sodersten P et al., 2008). Molte sostanze che modulano il sistema serotoninergico sono alla base dei trattamenti farmacologici per tali malattie. E’ stato, inoltre, dimostrato il coinvolgimento della serotonina in patologie quali la sindrome di Down, l’autismo, il morbo di Alzheimer e l’epilessia (Whitaker-Azimitia 2001). Alterazioni dei livelli di serotonina sono ritenuti responsabili di numerose patologie dell’uomo e degli animali che comprendono disordini cardiaci, malattie gastrointestinali, tumori, miopatie e numerose altre (Hodges et al.,2008 ; Nebigil CG e Maroteaux L 2001).

1.2. Ruolo della serotonina nello sviluppo embrionale

Alcuni neurotrasmettitori sono presenti in stadi molto precoci dell’embriogenesi sia dei vertebrati che degli invertebrati, prima ancora del differenziamento del sistema nervoso. Essi durante lo sviluppo embrionale svolgono un ruolo diverso da quello svolto nel sistema nervoso maturo, regolando i processi di differenziamento e/o di morfogenesi (Gaspar P et al.,2003; Lauder et al,. 1988; Whitaker-Azmitia PM 2001). Numerose evidenze dimostrano il ruolo dei neurotrasmettitori nel controllo della divisione cellulare, nei movimenti morfogenetici durante la segmentazione e la gastrulazione, nella chiusura del tubo neurale e nella neurogenesi precoce (Nguyen L et al ., 2001). Tra i sistemi monoaminergici, quello serotoninergico, che è il primo a comparire nell’embriogenesi, svolge un ruolo fondamentale. La 5-HT è infatti presente all’interno degli ovociti e degli embrioni precoci di vertebrati ed invertebrati, dal riccio di mare ai mammiferi. Essa si ritrova ancor prima della comparsa delle strutture nervose (Buznikov et al., 2005; Levin et al., 2006). E’ prodotta dalle cellule staminali embrionali (Walther et al., 1999) e probabilmente gioca un ruolo importante nella maturazione dell’uovo (Buznikov et al., 1993), nel controllo della segmentazione e della frequenza con cui le cellule si dividono, nel patterning delle strutture citoscheletriche (Lee et al., 1991), nell’adesione tra blastomeri, nei movimenti di gastrulazione (Hamalainem e Kohonen, 1989; Colas et al., 1999), nel controllo della comunicazione mediante giunzioni gap (Moore e Burt, 1995; Rorig and Sutor, 1996), nello stabilirsi dell’asimmetria sinistra-destra (Levin et al., 2006; Beyer et al.,2012), nella specificazione dell’identità neurale e delle connessioni all’interno del sistema nervoso in via di sviluppo (Lauder et al., 1983; Whitaker-Azmitia, 2001; Fukumoto et al., 2005). Molti fattori di crescita che influenzano lo sviluppo del sistema serotoninergico sono anche importanti negli eventi di plasticità sinaptica. Tra questi, quello più studiato è il fattore di crescita astrogliale, S100β, i cui livelli sono aumentati dalla 5-HT, a prova del fatto che i neuroni serotoninergici possono regolare la loro stessa crescita oltre a quella dei

loro “targets” (Whitaker-Azmitia, 2001). Il sistema serotoninergico è anche in grado di autoregolare il proprio differenziamento attraverso l’attivazione del recettore 5-HT1A, del “brain derived neurotrophic factor” (BDNF) e il suo recettore trkB (Sodhi and Sanders-Bush, 2004). Il rilascio di 5-HT dai terminali sinaptici può influenzare i processi di neurogenesi (Lauder and Krebs, 1976), di apoptosi, di rifinimento dendritico, di migrazione cellulare e plasticità sinaptica (Chubakov et al., 1986; Lauder, 1990). La combinazione di questi eventi dà origine alle sofisticate organizzazioni dell’ippocampo e delle mappe della corteccia somatosensitiva. Più tardivamente nello sviluppo, invece, la 5-HT regola la crescita dendritica, la formazione delle spine dendritiche e le arborizzazioni (Faber and Haring, 1999). Il ruolo della 5-HT nello sviluppo è stato studiato con approcci diversi.

Uno di questi è l’inibizione della sintesi di 5-HT somministrando paraclorofenilalanina (PCPA), un composto che agisce bloccando la triptofano idrossilasi. In seguito a questo trattamento si osserva un aumento della sintesi dell’ossido nitrico nel corpo calloso, nello striato e nell’ippocampo che mette in evidenza l’esistenza di una stretta relazione tra il sistema serotoninergico e quello nitrergico durante lo sviluppo (Ramos et al., 2002). Questo dato risulta interessante alla luce del fatto che anche per l’ossido nitrico è stato ipotizzato un ruolo nella regolazione della plasticità sinaptica. Inoltre da questi studi emerge che la corretta densità di spine dendritiche dell’ippocampo e del raphe dipende strettamente dalle proiezioni serotoninergiche in queste aree (Alves et al., 2002). E’ stato ipotizzato che parte dell’azione di questa amina nella plasticità neuronale si esplichi attraverso il controllo dell’espressione di molecole di adesione cellulare quali le PSA-NCAM che, negli organismi presi in considerazione, risultano notevolmente ridotte (Brezun and Daszuta,2000). In ratti a cui la PCPA viene somministrata subito dopo la nascita, mediante iniezione nella regione lombare, è possibile osservare come la deplezione di 5 HT influisca sulla maturazione dei neuroni motori; infatti questi animali riportano disfunzioni posturali probabilmente dovute ad un arresto dello sviluppo di questi motoneuroni (Pflieger et al., 2002). Un altro approccio

sperimentale molto utilizzato è la generazione di topi “knock-out” (KO) per alcuni dei geni coinvolti nello sviluppo e/o nella funzionalità del sistema serotoninergico. Dallo studio del topo “knock-out” per la monoaminoossidasi A (MaoA), l’enzima responsabile della degradazione della 5-HT, sono emersi molti dati interessanti. Innanzitutto l’inattivazione di questo enzima porta ad un aumento, pari a nove volte, dei livelli di 5-HT nell’encefalo durante la prima settimana dopo la nascita. In questo periodo si riscontra un forte accumulo di 5-HT in tutti i neuroni che esprimono in modo transiente il trasportatore serotoninergico (SERT). La corteccia somatosensoriale di questi topi non presenta più la sua tipica divisione in colonne, che sono la base morfologica delle mappe corticali, a dimostrazione del fatto che l’aumento di 5-HT compromette la corretta aggregazione e segregazione delle fibre talamocorticali (Cases et al., 1996). Simili effetti si ritrovano nel sistema visivo dove viene alterata la normale segregazione degli assoni retinici (Upton et al., 1999). Altre alterazioni riscontrate in questo modello riguardano il controllo locomotorio e respiratorio nei neonati (Bou-Flores et al., 2000). Nel topo ”knock out” per il trasportatore serotoninergico (SERT), la 5- HT continua ad essere secreta ma non viene rimossa dal vallo sinaptico. Questo comporta un ristagno sinaptico della 5-HT ed un aumento dei livelli basali di 5-H ed un aumento dei livelli basali di 5-H extracellulare a carico del telencefalo (Mathews et al., 2004) quindi uno sviluppo anormale degli assoni talamocorticali e retinici, molto simile a quello osservato nei topo “knock out” per MaoA. Questo indica che un eccesso di 5-HT a livello dello spazio extracellulare, causa modificazioni a carico dello sviluppo (Upton et al. 1999; Persico et al., 2001). I topi Sert-/- mostrano inoltre un aumento del comportamento legato ad ansia e depressione e una riduzione del comportamento aggressivo (Holmes et al.,2002; Holmes et al., 2003) anche se ciò sembra un paradosso se si considera che proprio l’inibizione del trasportatore è alla base della maggior parte delle cure antidepressive (Bengel et al.,1998; Lesch et al., 2003). Altri neuroni potrebbero invece beneficiare dell’aumentata stimolazione dei recettori serotoninergici come indicato da una diminuzione del fenomeno. La

produzione di topi “knock-out” per la Tph1 ha messo in evidenza che questa è fondamentale per lo sviluppo corretto del cuore. I topi KO per Tph1 hanno un cuore di dimensioni maggiori rispetto al cuore dei “wild type” e sono affetti da disfunzioni cardiovascolari progressive che comportano l’insorgenza di difetti cardiaci (Cote et al., 2003) e di morte cellulare a carico del telencefalo dei topi “knock out” per SERT (Persico et al., 2003). Altri studi condotti sul topo mostrano un coinvolgimento della 5-HT materna nella migrazione delle cellule delle creste neurali facciali (Yavarone et al., 1993; Moiseiwitsch e Lauder, 1995), nella morfogenesi delle strutture craniofacciali (Shuey et al., 1992; Bhasin et al., 2004) e nella proliferazione delle cellule del miocardio (Nebigil e Maroteaux, 2001). Infatti embrioni in coltura trattati con antagonisti serotoninergici hanno uno sviluppo embrionale anormale caratterizzato da una deficienza del mesenchima della testa, da archi mandibolari ipoplastici, da occhi e tubo neurale anormali e da difetti cardiovascolari che includono la mancanza di trabecole e la riduzione dello spessore della parete ventricolare (Choi et al., 1997).

In conclusione tutti i dati che sono noti sino ad oggi dimostrano come il sistema serotoninergico sia sicuramente coinvolto in processi di formazione dei circuiti neuronali e di sinaptogenesi.

1.3 I recettori della Serotonina

La serotonina è l’unica fra le monoamine biogene ad esercitare la sua azione mediante l’attivazione di un 14 distinti recettori suddivisi in 7 classi sulla base delle caratteristiche strutturali e funzionali (Boess FG, Martin IL (1994);Chang AS

1996). Fatta eccezione per il recettore 5-HT3, che appartiene alla famiglia dei canali ionici, tutti i recettori per la serotonina appartengono alla superfamiglia dei recettori accoppiati a proteine G e, suddivisi in ulteriori 14 sottotipi, rappresentano una delle famiglie più complesse di recettori di neurotrasmettitori. La famiglia dei recettori HT1 è composta da cinque membri (HT1A, HT1B, HT1D, HT1E, HT1F) che hanno un’omologia di sequenza del 40-63% nell’uomo. I recettori 5-HT1 sono accoppiati alla proteina Gi/o, enzima sensibile alla tossina della pertosse, che inibisce l’azione dell’adenilato ciclasi con conseguente diminuzione della produzione di adenosina monofosfato ciclica (cAMP). La famiglia dei recettori 5-HT2 è costituita da tre membri, 5-5-HT2A, 5-5-HT2B e 5-5-HT2C. Essi sono accoppiati alla proteina Gq/11 che aumenta la concentrazione di inositolo-3-fosfato (IP3) e di calcio citosolico; in accordo con il ruolo svolto da tali recettori nella contrattilità muscolare e nella stimolazione cerebrale. I recettori 5-HT3 appartengono alla superfamiglia dei recettori accoppiati a canali ionici e sono costituiti da cinque subunità che delimitano un canale centrale; tali recettori sono localizzati sui neuroni centrali e periferici, dove essi causano una rapida depolarizzazione in seguito al movimento di cationi da e verso la cellula (Na+ e Ca++ in entrata e K+ in uscita). I recettori 5-HT4, 5-HT6 e 5-HT7 sono accoppiati alla proteina Gs e, tramite l’attivazione dell’enzima adenilato ciclasi, promuovono la formazione di cAMP che interagisce con vari bersagli, quali la proteina chinasi A (PKA) o canali ionici del calcio (Barnes NM, Sharp T, 1999). Alcuni recettori serotoninergici svolgono un ruolo chiave nello sviluppo embrionale di diversi organismi, oltre ad esplicare importanti funzioni nella fisiologia dell’adulto (Raiymond JR et al., 2001). Il recettore 5-HT1A, ad esempio, è stato clonato nei mammiferi e in Xenopus laevis (Marracci et al, 1997) ed è espresso a stadi precoci dello sviluppo embrionale nei nuclei del raphe, nell’ippocampo e nell’occhio del ratto (Hillon J et al., 1994). Studi in vivo hanno dimostrato che la serotonina agisce attraverso tale recettore stimolando la neurogenesi nell’ippocampo (Gould E, 1999). Topi knock-out (KO) per 5-HT1A mostrano alterazioni comportamentali legate all’ansia (Ramboz S et

al.,1998). Il recettore 5-HT1A nell’adulto influenza le funzioni cognitive ed emozionali del SNC (Barnes NM, Sharp T, 1999). Nei ratti, la somministrazione di agonisti del recettore 5-HT1A induce iperfagia, ipotermia ed alterazioni del comportamento sessuale (Higgins GA et al.,1998). Studi neuroendocrini hanno dimostrato che la stimolazione del recettore 5-HT1A induce un aumento dei livelli plasmatici dell’ormone adrenocorticotropo, dei corticosteroidi e della prolattina (Gilbert F et al.,1998). La funzione predominante di tale recettore, tuttavia, è quella connessa ai processi cognitivi e comportamentali e alla regolazione della percezione del dolore (Barnes NM, Sharp T, 1999). Il recettore 5-HT1B, espresso a stadi precoci dello sviluppo nei nuclei del raphe, nel nucleo striato, nel cervelletto e nelle cellule gangliari della retina, agisce inibendo la produzione di cAMP e il flusso di calcio nei terminali. assonici (Barnes NM, Sharp T, 1999). Topi nulli per tale recettore mostrano un aumento dei livelli di aggressività (Saudou F et al.,1994). Il recettore 5-HT2A, coinvolto nei processi di maturazione e differenziamento neuronale, regola l’espressione del fattore neurotrofico BDNF (brain-derived neurotrophic factor) nella neocorteccia e nell’ippocampo influenzandone i processi tardivi dello sviluppo (Vaidya WA et al.,1997). Numerosi studi dimostrano il ruolo del recettore 5-HT2A nella patogenesi della schizofrenia (Busatto GF, Kerwin, 1997). Altre patologie in cui sembra essere coinvolto il recettore 5-HT2A sono la depressione, l’ansia e disordini compulsivi ossessivi (Barnes NM, Sharp T, 1999). La diffusa espressione del recettore 5-HT2B nell’embriogenesi precoce (cellule della cresta neurale, tubo neurale, cuore, intestino, somiti, vescicole ottiche, archi faringei, mesenchima cranio-facciale) fa supporre un ruolo fondamentale di 5-HT2B nella morfogenesi mediata dalla serotonina. Pochi invece sono i dati relativi agli effetti funzionali dell’attivazione di 5-HT2B nell’età adulta. Recenti studi che utilizzano agonisti di tale recettore suggeriscono un ruolo nel controllo dell’ansia (Barnes NM, Sharp T, 1999). Il recettore 5-HT2C è coinvolto soprattutto nello sviluppo sinaptico della corteccia visiva (Wang Y et al., 1997). Topi nulli per 5-HT2C mostrano un deficit nel potenziamento a lungo termine dell’ippocampo

(Edagawa Y et al., 2001). Esistono numerose risposte comportamentali associate all’attivazione centrale del recettore 5-HT2C, quali ipo-locomozione, ipofagia, ansia ed ipertermia (Barnes NM, Sharp T, 1999).

1.4 Il recettore 5-HT2B

Il cDNA del recettore 5-HT2B è stato clonato nel ratto e nel topo (Foguet et al., 1992), nell’uomo (Kursar et al., 1994) e in Xenopus laevis (De Lucchini et al., 2003). Nella

struttura è molto simile a tutti i recettori accoppiati a proteine G; è una proteina integrale di membrana, di 450- 500 aminoacidi (il numero varia a seconda delle specie considerate) e con sette domini idrofobici transmenbrana, connessi da tre domini idrofilici intracellulari e tre extracellulari.

.

Fig 2. Modello tridimensionale di un recettore serotoninergico accoppiato a proteine G. E’ una proteina integrale di membrana, con sette domini idrofobioci transmembrana e ha l’estremità amminica nel

versante extracellulare e quella carbossilica nel versante citosolico

Il terminale amminico della sequenza è orientato verso lo spazio extracellulare mentre il terminale carbossilico verso quello intracellulare. Lungo i domini extracellulari sono presenti dei siti canonici di glicosilazione, segno di possibili modificazioni post-traduzionali e dei residui di cisteina che permettono la formazione di ponti disolfuro e conseguenti modificazioni conformazionali della proteina. A livello dei domini intracellulari, invece, si trovano dei siti per l’interazione con proteine Gq/11 e altre proteine regolatorie e dei siti di fosforilazione bersaglio per diverse serina/treonina chinasi. Inoltre a livello del terminale carbossilico c’è un motivo strutturale conservato chiamato S/TXV che interagisce con il dominio PDZ delle proteine che lo contengono;

questo dominio è coinvolto nelle vie di trasduzione del segnale attivate da cNOS (sintasi dell’ossido nitrico costitutiva) e iNOS (sintasi dell’ossido nitrico inducibile) (Raymond et al., 2001). Sempre a questo terminale sono presenti dei siti di palmitoilazione e fosforilazione che sono indispensabili per l’internalizzazione del recettore (Parker et al., 2003).

Nell’uomo, l’RNA messaggero per il 5-HT2B è espresso abbondantemente nel fegato e nel rene e a livelli più bassi nel pancreas, nella milza, nel cervelletto, nell’ipotalamo dorsale, nel setto laterale e nell’amigdala mediale (Bonhaus et al., 1995; Duxon et al., 1997).

La sua espressione nell’embriogenesi lo rende un ottimo candidato per la mediazione degli effetti morfogenetici serotonina-dipendenti. Studi effettuati sul topo hanno messo in evidenza la presenza dell’RNA messaggero per questo recettore durante l’embriogenesi precoce anche nelle cellule delle creste neurali, nel tubo neurale, nel cuore, nell’intestino, nei somiti, nelle vescicole ottiche, negli archi faringei e nel mesenchima craniofacciale (Choi et al.,1997). Le prime evidenze, in vivo, del ruolo di questo recettore nello sviluppo derivano da uno studio fatto su embrioni di topo trattati con la ritanserina, antagonista dei recettori 5-HT2 (Fig. 3).

Fig 3.In A e D, embrioni di topo “wild type” a 9 giorni di gestazione, in visione laterale (A) e frontale (D). In B e E, embrioni di topo, trattati per 24 ore con ritanserina, a 9 giorni di gestazione. Dal confronto

emergono il forte ritardo dello sviluppo e le gravi alterazioni a carico delle regioni cefaliche e del cuore dei topi trattati rispetto ai controlli. Da: Choi et al., 1997.

Questi embrioni mostrano un forte ritardo della crescita, un’anomalia della piega cefalica, prosencefalo e rombencefalo sottosviluppati, archi branchiali ipoplastici, difetti del numero e della forma dei somiti, della chiusura e della forma del tubo neurale e malformazioni cardiache tra cui edema pericardico e assenza delle trabecole miocardiche. Gli embrioni trattati presentano anche un aumento del numero delle cellule delle creste neurali craniali che vanno in apoptosi. Da questo studio è emersa l’ipotesi che il recettore 5-HT2B possa avere un ruolo importante nei processi di migrazione, proliferazione cellulare e sopravvivenza delle cellule delle creste neurali e nella migrazione e/o nell’inibizione del differenziamento cellulare delle cellule del miocardio (Choi et al., 1997). Il topo “knock-out” per 5-HT2B ha un fenotipo letale, con diversi gradi di penetranza, embrionale o neonatale, causato da malformazioni cardiache. I topi che sopravvivono alla nascita mostrano dilatazione cardiaca con una penetranza del 100% e un’anomalia nell’organizzazione miofibrillare e nelle giunzioni cellulari cardiache. Il fenotipo di questo topo sembra dovuto a difetti della proliferazione e della crescita delle cellule miocardiche nello sviluppo. Gli stessi autori che hanno studiato il topo “knock-out” per 5-HT2B hanno proseguito le ricerche su cardiomiociti in coltura dimostrando che in condizioni di stress, la 5-HT protegge le cellule da morte apoptotica e che questo effetto è mediato dal recettore 5-HT2B (Nebigil et al., 2003).

L’azione del recettore 5-HT2B si esplica attraverso diverse cascate di trasduzione che sono state studiate mediante esperimenti in vitro.

Fig 4. Schema delle principali vie di trasduzione del segnale attivate dal legame della serotonina al recettore 5-HT2B. Da: Nebigil et al., 2000

Come tutti i recettori della 5-HT di tipo 2 è accoppiato sia ad una proteina Gq/11 che attiva la fosfolipasi Cβ 21 (PLCβ) e porta alla produzione di IP3 e diacilglicerolo (DAG), sia ad un’altra proteina G che attiva la fosfolipasi A2 (PLA2) e che a sua volta stimola la produzione di acido arachidonico (AA) (Raymond et al., 2001). Il recettore 5-HT2B può stimolare la progressione del ciclo cellulare attraverso due vie indipendenti e parallele che portano all’attivazione dei complessi chinasici ciclina D1/cdk4 e ciclina E/cdk2. L’attivazione della ciclina D1 sembra coinvolgere la transattivazione della via di trasduzione del segnale del recettore chinasico del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF); la ciclina E, invece non richiede l’intervento di questo recettore. A monte di entrambe queste vie si ritrova un elemento comune che è la chinasi Src (Nebigil et al., 2000b; Raymond et al., 2001). Il recettore 5-HT2B è in grado di stimolare anche la produzione intracellulare di cGMP attraverso l’attivazione delle sintasi dell’ossido nitrico costitutiva e inducibile (cNOS e iNOS). Esiste anche un’altra via di azione del recettore 5-HT2B: quella antiapoptotica. E’ stato visto come l’accoppiamento di 5-HT2B con una proteina Gq porti all’attivazione, in caso di stress, sia della via di ERK1/ERK2 (extracellular signal-regulated kinase), che di quella di PI3K/Akt (fosfaditilinositolo 3 chinasi), che rispettivamente inibiscono, indipendentemente, Bax e ANT-1, fattori proapoptotici; ciò impedisce il rilascio del

citocromo c dal mitocondrio e, di conseguenza, l’attivazione della caspasi 9 e l’entrata in apoptosi della cellula.

1.5 Relazione tra l’acido retinoico e il recettore 5-HT2B durante lo sviluppo

Il fenotipo dei topi trattati con ritanserina antagonista dei recettori 5-HT2 è paragonabile a quello di topi trattati con acido retinoico, fattore che regola negativamente la proliferazione e la migrazione delle cellule creste neurali. In aggiunta a ciò, nel promotore del recettore 5- HT2B sono presenti elementi di risposta al AR ed è stato dimostrato che in differenti sistemi cellulari la via del segnale del recettore 5-HT2B e quella attivata dall’acido retinoico possano convergere su elementi comuni, in modo antagonista, allo scopo di regolare la sopravvivenza e il differenziamento cellulare, come dimostrato nel topo per quanto riguarda lo sviluppo dell’arto e la regolazione della proliferazione del mesenchimica della “frontal mass di topo (Choi et al., 1997; Bhasin et al., 2004).

1.6 ruolo del recettore 5-HT2B durante lo sviluppo di Xenopus

Studi condotti in Xenopus laevis hanno messo in evidenza che l’RNA messaggero di X5-HT2B, durante lo sviluppo, è presente nei precursori neuronali in proliferazione del tubo neurale e della retina (De Lucchini et al ; 2003)

.

Fig 5. In A e C, espressione dell’mRNA di 5-HT2B negli strati nucleare interno ed esterno e nella zona del margine ciliare della retina e nel tubo neurale di embrioni di Xenopus. In B e D, localizzazione dei precursori neuronali in proliferazione della retina e del tubo neurale di embrioni di Xenopus, mediante

un saggio per l’incorporazione della BrdU. Dal confronto delle quattro immagini emerge che l’espressione dell’mRNA di X5-HT2B è più forte in corrispondenza delle zone in proliferazione. Da: De

Lucchini. et al, 2003.

Nel nostro laboratorio è stato analizzato il “pattern” di espressione del recettore 5-HT2B in Xenopus, mettendo in evidenza la sua espressione a livello della retina, degli archi branchiali, in cellule sparse del tubo neurale e del diencefalo e a livello del mesenchima perioculare (Fig. 6).

Fig 6. Embrioni di Xenopus a stadio 37 processati per ibridazione in situ con la sonda complementare all’mRNA del recettore 5-HT2B. La marcatura è presente nella retina (freccia in A), nel primo arco

branchiale (freccia in A’), in cellule sparse del tubo neurale e del diencefalo (freccia in B’) e nel mesenchima perioculare (freccia in C’)

Più recentemente è stato inoltre dimostrato che questo recettore partecipa allo sviluppo e alla morfogenesi retinica e che modula in maniera “cell autonomous” il comportamento delle cellule post migratorie scheletogeniche delle creste neurali craniali del primo arco branchiale partecipando alla formazione dell’articolazione mascella-mandibola. (De Lucchini et al., 2005; Reisoli et al., 2008; Reisoli et al., 2010).

1.7 La morfogensi oculare

Lo sviluppo dell’occhio nei vertebrati è un complesso processo che coinvolge molteplici interazioni induttive tra il neuroectoderma del prosencefalo (che dà origine alla retina e al nervo ottico), l’ectoderma superficiale (che dà origine alla lente,

all’epitelio della cornea, alla congiuntiva e alle palpebre) e le cellule delle creste neurali da cui deriva parte del mesenchima perioculare (che darà origine alla coroide, alla sclera, allo stroma della cornea, all’iride e alla camera anteriore). (Johnston et al., 1979; Trainor e Tamm 1995; Cvekl e Tamm, 2004). Molte strutture del segmento anteriore originano dalla unione di due differenti tessuti embrionali come l’ectoderma e il mesenchima. Studi condotti sul topo hanno mostrato i diversi eventi richiesti per un corretto sviluppo oculare e per la normale morfogenesi del segmento anteriore dell’occhio. La “optic pits” è prima struttura morfologica oculare a formarsi; verso lo stadio embrionale E9 del topo evagina lateralmente dal neuroepitelio del diencefalo ventrale a formare la vescicola ottica (Pei e Rhodin 1970; Kaufman, 1992) fino ad incontrare la superficie oculare dell’ectoderma (OSE). La OSE è uno strato multipotente che quando opportunamente stimolato contribuisce alla formazione della lente, della cornea e della congiuntiva. Il segmento anteriore dell’occhio inizia la sua formazione quando la vescicola ottica distale prende contatto con l’ OSE sovrastante. Nei topi questo contatto avviene allo stadio embrionale E9.5 e risulta nell’induzione del placode del cristallino all’interno dell’OSE (Pei e Rhodin 1970; Kaufman, 1992). Il placode del cristallino si invagina verso la linea mediana della testa formando il precursore della lente, in contemporanea la vescicola ottica si invagina anch’essa formando il calice ottico costituito da due strati che si differenziano diversamente; lo strato esterno forma la retina pigmentata, mentre lo strato interno forma la retina nervosa. Durante la fase (E10) si ha anche la formazione della cornea e di altre strutture del segmento anteriore, la cui morfogenesi ha inizio con la migrazione del mesenchima in gran parte di derivazione delle creste neurali, che migra nel territorio tra l’abbozzo della lente e l’OSE (Pei e Rhodin, 1970; Kaufman, 1992; Cvekl e Tamm, 2004). Durante questa fase una sottopopolazione di cellule delle creste neurali che migrano nel primo arco faringeo darà origine insieme alle cellule mesenchimatiche della testa di origine mesodermica, al mesenchima perioculare (POM).

Fig 7. Schema dello sviluppo dell’occhio nei vertebrati. La vescicola ottica evagina dal diencefalo e promuove la formazione del placode della lente (A,B), poi si invagina diventando una coppa ottica bi

stratificata (C,D). E: anatomia dell’occhio completamente sviluppato

Alla morfogenesi del segmento anteriore dell’occhio quindi contribuisce il mesenchima perioculare (POM), una struttura formata da cellule mesenchimali che derivano sia dalle creste neurali craniche che dal mesoderma, e che circondano l’occhio nelle prime fasi di sviluppo (Gage e Zacharias, 2009). In particolare la sottopopolazione di cellule del POM che deriva dalla cresta neurale da origine alla sclera, stroma della cornea, iride, camera anteriore del corpo vitreo. Queste cellule contribuiscono inoltre a guidare i movimenti morfogenetici che regolano la chiusura della fessura ottica. Il POM, inoltre, fornisce i segnali essenziali per la morfogenesi oculare, inclusi processi come l’estensione morfogenetica del tratto ottico e la corretta formazione dell’epitelio pigmentato (Gage et al, 2005). Nella periferia dell’occhio,

invece, queste cellule formano le cartilagini e le ossa orbitali, i vasi sanguigni e i tessuti connettivi associati ai muscoli extraoculari.

Fig 8. Schematizzazione della morfogenesi del segmento anteriore dell’occhio. Ectoderma(blu), ectoderma neurale (verde), e cellule della cresta neurale e cellule mesenchimatiche di origine

mesodermica (arancione). (Gage e Zacharias, 2009).

1. fornire multipli “lineages” cellulari maturi che sono necessari per il corretto sviluppo del segmento anteriore dell’occhio (che comprendono lo stroma e l’endotelio corneale, la camera anteriore e lo stroma dell’iride).

2. è necessario che le cellule originate dall’epitelio superficiale interagiscano con il POM per il corretto sviluppo della palpebra (Le Lievre and Le Douarin, 1975).

3. Infine, il POM fornisce segnali essenziali per il patterning dell’ectoderma oculare primordiale, includendo la specificazione dell’epitelio pigmentato della retina e la differenziazione del nervo ottico a partire dall’ectoderma neurale (Evans e Gage 2005; Fuhrmann et al., 2000, Matt et al., 2008).

Per quanto riguarda i meccanismi molecolari coinvolti nelle diverse funzioni del POM, studi condotti sul topo e sul pollo hanno fornito l’evidenza del legame tra il segnale dell’acido retinoico proveniente dalla coppa ottica e il fattore di trascrizione con omeodominio Pitx2 che si trova espresso all’interno delle creste neurali e il segnale canonico Wnt/β- catenina all’interno dell’ectoderma superficiale oculare. Pitx2 è un nodo critico di integrazione che lega le due vie di segnalazione. La comprensione profonda della rete di interazioni molecolari risulta quindi fondamentale per comprendere a fondo i meccanismi alla base dello sviluppo del segmento anteriore dell’occhio e delle eventuali patologie ad esso connesse. (Gage e Zacharias, 2009).

Fig 9. Rappresentazione schematica dello sviluppo del mesenchima perioculare nel topo. (Ales Cvekl et al. 2004.)

1.8 L’acido retinoico guida i corretti movimenti morfogenetici nell’occhio

La sintesi di Acido retinoico (AR) a partire dalla vitamina A (retinolo) prevede due reazioni ossidative consecutive. La prima, che porta alla formazione del retinale, richiede la classe IV di retinolo deidrogenasi (Ang et al., 1996); la seconda, che porta alla sintesi dell’ AR attraverso l’ossidazione del retinale, richiede negli embrioni dei vertebrati tre retinaldeide deidrogenasi, Raldh1, Raldh2 e Raldh3 (March-Armstrong et al., 1994; Luan et al., 1999; Mic et al., 2000;). Dopo la sua sintesi a partire dalla vitamina A, l’acido retinoico può legarsi a particolari recettori nucleari, i recettori RAR α, β e γ, che dimerizzando con i corecettori RXR α, β e γ sono in grado di modulare l’espressione genica nelle cellule dei tessuti bersaglio (Chambon,., 1996) attraverso il legame a specifiche sequenze di DNA, dette RAREs (retinoic acid responsive

elements), poste nelle regioni regolatrici di alcuni geni (Leid et al., 1992; Mangelsdorf e Evans, 1995)

Alcuni studi suggeriscono una relazione tra la ridotta funzionalità dell’AR e difetti nello sviluppo dell’occhio nell’uomo e del topo (Lohnes et al., 1994 e Seeliger et al., 1999). Attualmente è chiaro che l’AR controlla lo sviluppo dell’occhio studi genetici nel topo suggeriscono che l’acido retinoico controlli lo sviluppo dell’occhio agendo a livello del mesenchima perioculare (Matt et al., 2005). Molotkov et al (2002) hanno dimostrato che l’AR è coinvolto nello sviluppo neuronale dell’occhio, attraverso la sua capacità di stimolare i movimenti morfogenetici necessari per l’invaginazione della retina.

I tre geni codificanti gli enzimi che portano alla formazione dell’acido retinoico Rldh1,

Rldh3, Rldh2 sono espressi nell’occhio in modo tessuto -specifico durante la

morfogenesi oculare, nella fase che va dalla formazione della vescicola ottica verso la formazione della coppa ottica. Nel topo, Raldh1 si esprime a livello dorsale della retina neurale durante la formazione della coppa ottica, Raldh2 è espresso transitoriamente nella vescicola ottica, ma non nella coppa ottica e Raldh3 si esprime nel ectoderma di superficie (lente prospettica) nella fase vescicola ottica e a livello dell’epitelio pigmentato retinico (RPE) e nella fase precoce di formazione della coppa ottica e, infine, nella retina neurale ventrale durante le fasi più tardive . In Topi mutanti -/- per Raldh1 non si osservano difetti nell’occhio e questo risultato probabilmente è dovuto alla compensazione genica mediata dalla presenza delle altre due isoforme del recettore (Raldh2 e Raldh3) (Cvel e Tamm,2004).D’interesse sono stati invece gli studi effettuati sul Raldh3 in cui gli embrioni mostrano una mancata segnalazione da parte dell’AR a livello della retina ventrale nella fase di formazione della coppa ottica e questo causa inoltre difetti nello sviluppo della retina (Dupè et al., 2003). La mancanza di Raldh2 invece impedisce la formazione della retina oltre la fase di vescicola ottica, ma tale difetto può essere recuperato attraverso un trattamento con AR di origine materna (Felix A. Mic et al., 2004).

E’ stato dimostrato che durante lo sviluppo dell’occhio sono espressi a livello nucleare i recettori (Rarα , Rarγ, Rarβ) ( Dollè 2009) .Studi di Knockout sul topo hanno dimostrato che questi 3 recettori per l’acido retinoico ( RAr) hanno un ruolo fondamentale durante lo sviluppo dell’occhio (Felix A. Mic et al.,2004) Gli embrioni che presentano una mutazione che annulla la funzionalità di una sola isoforma di questi RAr porta a difetti morfologici ralativamente minori, ma topi Knockout per almeno due isoforme RArs causano differenti anomalie degli occhi, tra cui la microftalmia e il colobona (Lohnes et al., 1994). Il Coloboma è un disturbo del sistema visivo molto comune negli esseri umani caratterizzato da un difetto nella chiusura della fessura ottica. La fessura ottica è un’apertura che rimane nella parte ventrale della retina in seguito alla chiusura dei due margini della coppa ottica. È una struttura necessaria per permettere il passaggio dei vasi sanguigni e degli assoni delle cellule gangliari (vedi figura sotto).

Fig 10 : schema della formazione della fessura ottica, prima (A) e durante la sua chiusura(B). Gestri et al. 2011.

Praticamente nulla si sa circa i meccanismi genetici e movimenti cellulari che sono alla base della chiusura della fessura ottica, ma studi recenti indicano che il mesenchima perioculare (POM), svolge un ruolo critico in tale processo. Non è ancora chiaro come le cellule del (POM) possano influenzare la morfogenesi ventrale dell’occhio e se il coloboma possa essere una conseguenza della mancata fusione dei

margini ventrali della retina ed in tal caso se le cellule del (POM) possano avere un ruolo diretto o indiretto nei processi di fusione (Gestri G. et al.2011).

Benchè attraverso studi precedenti il mesenchima perioculare sia stato indicato come target diretto dell’acido retinoico, studi su zebrafish mostrano come il “signaling” mediato dai recettori dell’acido retinoico (RAr) regoli la chiusura della fessura ottica, agendo sia sulla coppa ottica ventrale che sulle cellule del mesenchima perioculare (POM), attraverso due “programmi” genetici distinti che funzionano in maniera indipendente (Giuseppe Lupo et al., 2011). Inoltre in embrioni di Xenopus leavis è stato dimostrato come la specificazione della parte ventrale dell’occhio sia regolata da interazioni tra ilpathway di hedgehog (Hh) , acido retinoico e segnalazione mediata dal recettore per il fattore di crescita dei fibroblasti (FGFR) ( Giuseppe Lupo et al.,2005).

Fig 10. Schema dei principali stadi di sviluppo di Xenopus . Da wolpert et al.,1998

Questo anfibio costituisce un modello di elezione per gli studi sullo sviluppo perché, in qualsiasi periodo dell’anno, la femmina può essere indotta, mediante iniezione dell’ormone umano gonadotropina corionica, a deporre nell’ambiente esterno 1000/1500 uova, che possono essere fecondate con facilità in vitro. Le grandi dimensioni delle uova degli anfibi, circa 1mm di diametro, le rendono particolarmente adatte alla manipolazione sperimentale. Un’altra caratteristica di questo anfibio è rappresentata dalla rapidità con cui si sviluppano gli embrioni; una volta fecondato, l’uovo si divide in due blastomeri in circa 90 minuti e le divisioni successive avvengono in maniera sincrona ogni 20 minuti, fino allo stadio di blastula. L’embriogenesi di Xenopus è stata studiata e descritta da Nieuwkoop e Faber (1967) e quindi mediante la consultazione delle tavole compilate da questi autori è possibile capire a che stadio si trovi l’embrione. Esse individuano infatti le principali modificazioni che distinguono i diversi stadi dello sviluppo. Lo stesso lavoro fornisce un’importante indicazione sui tempi di sviluppo dell’embrione a diverse temperature,

rendendo possibile una manipolazione dei tempi stessi che possono arrivare a ridursi di un terzo se gli embrioni sono stabulati a 14°C; questo aspetto ha un evidente vantaggio pratico in quanto permette, se necessario, di rallentare notevolmente la crescita dell’embrione, adattandola alle proprie esigenze sperimentali. Grazie alle caratteristiche che ho elencato è possibile effettuare sugli embrioni, sin dagli stadi più precoci dello sviluppo, sia trattamenti farmacologici, sia esperimenti di perdita e guadagno di funzione mediante la tecnica della microiniezione in embrioni allo stadio di due o quattro cellule. Per fare esperimenti di guadagno di funzione si microinietta l’mRNA del gene di interesse, sovraesprimendolo, mentre per gli esperimenti di perdita di funzione si microiniettano o oligonucleotidi antisenso modificati (morpholino) o mRNA antisenso o mRNA codificanti per proteine mutate o delete. Inoltre, insieme ai costrutti di interesse è possibile microiniettare il trascritto di un gene reporter come EGFP o βgalattosidasi che permette di visualizzare la zona iniettata.