MATERIALI E METODI

Tecniche di base di biologia molecolare.

Tutte le tecniche di base di manipolazione degli acidi nucleici (ad es. clonazione molecolare, subclonazione di cDNA in vettori di espressione, trascrizione in vitro) sono state applicate come descritto nel classico manuale di laboratorio: “Molecular Cloning” (Sambrook et al., 1989)

Costrutti.

I vettori plasmidici usati per trascrivere RNA antisenso marcato con Dig in esperimenti di ibridazione in situ sono stati:

• pBluescript KS e SK.(gene bank “52327”, “52329”)

I vettori di espressione usati negli esperimenti di lipotrasfezione sono stati: • pCS2+

E’ un vettore di espressione che consente più usi. E’ progettato per l’espressione di proteine in embrioni di Xenopus. Contiene un forte promotore virale (CMV IE94) seguito da un “polilinker” e dal sito di poliadenilazione di SV40. Un promotore SP6 consente la trascrizione di RNA da sequenze clonate nel polilinker; un promotore T7 inserito tra il polilinker e il sito polyA consente la sintesi di sonde; un secondo polilinker successivo al sito polyA SV40 fornisce diversi siti di restrizione con cui linearizzare il vettore per la trascrizione SP6. Questo vettore include il gene per la resistenza all’ampicillina (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).

• pCS2MT+

Studiato per produrre proteine di fusione, include 6 copie dell’epitopo myc riconosciuto dall’Ab monoclinale 9E10 e policlonale…., clonate all’interno dei siti Cla1 ed EcoR1 del vettore pCS2 (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).

• pCMV-SPORT6 (Invitrogen)

E’ un vettore di espressione, progettato per l’espressione di proteine in embrioni di Xenopus,. Contiene un forte promotore virale (CMV ) seguito da un “polilinker” e dal sito di poliadenilazione di SV40. Un promotore SP6 consente la trascrizione di RNA da sequenze clonate nel polilinker; un promotore T7 inserito tra il polilinker e il sito polyA consente la sintesi di sonde.

Cloni plasmidici

I seguenti cloni plasmidici sono stati utilizzati per la trascrizione in vitro di sonde per ibridazione in situ o per esperimenti di lipotrasfezione:

° Xath5 (Perron et al., 1998); cDNA completo in pBluescript . Per trascrivere l’antisenso è stato linearizzato con NotI e trascritto con la polimerasi T7.

° Xbh1 (Patterson et al., 1998); cDNA di 1Kb inserito in pGEM-3Z. Questo costrutto contiene l’intera regione codificante con eccezione dei primi due aminoacidi. Esso contiene circa 110 basi di 3’UTR. Per trascrivere probes antisenso è stato linearizzato con EcoRI e trascritto con la polimerasi SP6.

° Xchx10 (gene bank BC044049); Il frammento di Xchx10 è costituito da 2994 pb ed è inserito in pCMV-SPORT6. Per trascrivere l’RNA antisenso è stato tagliato con Sal1 e trascritto con la polimerasi T7.

° XcycD1 (Casarosa et al., 2003); cDNA completo in pBluescript KS. Per generare l’RNA antisenso è stato linearizzato con BamHI e trascritto con la polimerasi T3.

° Xhermes (Gerber et al., 1999); Il frammento di Xhermes è costituito da 1.3Kb ed è inserito in pBluescript SK. Il clone di hermes che noi abbiamo utilizzato non è completo, ma non si hanno 400 basi al 5’ terminale. Per trascrivere il probe antisenso abbiamo tagliato con BamH1 e trascritto con la polimerasi T7.

° Xirbp (Gonzalez-Fernandez et al., 1993); Il cDNA di XIrbp è costituito da 888pb ed è inserito in pCMV-SPORT6. Per trascrivere il probe antisenso è stato linearizzato con EcoRV e trascritto con la polimerasi T7.

° XN-tubulina (Richter et al., 1988); Il cDNA di XN-tub di 1.7Kb è inserito in pBluescriptKS. Per ottenere l’RNA antisenso è stato linearizzato con Not1 e trascritto con la polimerasi T3.

° Xotx5b (Viczian et al., 2003); Il cDNA di Xotx5 è di 1.65Kb ed è inserito in pBluescriptSK. Per ottenere l’RNA antisenso è stato linearizzato con NotI e trascritto con la polimerasi T7.

° Xotx2 (Viczian et al., 2003); Il cDNA di Xotx2 di 900 pb è inserito in pGEM3. Per ottenere l’RNA antisenso è stato linearizzato con EcoRI e trascritto con la polimerasi SP6.

° Xgadd45γ (de la Calle-Mustienes et al., 2002); il cDNA completo di Xgadd45γ è inserito in PGEM-T. Per ottenere l’RNA antisenso stato linearizzato con KspI e trascritto con la polimerasi SP6.

° Xrx1 (Casarosa et al., 1997). Xrx1 (1485 pb) è inserito in pGEM3. Per ottenere l’RNA antisenso è stato linearizzato con BamHI e trascritto con la polimerasi T7.

Anticorpi

I seguenti anticorpi sono statti utilizzati negli esprimenti di immuno-istochimica:

Anticorpi I°

- Anti-Brdu (5-bromo2-deossiuridina): prodotto dalla Sigma-Aldrich; numero del catalogo (B2531); sviluppato in topo; diluizione d utilizzo (1:500).

- Anti-calbindin: prodotto dalla oncogene; numero del catalogo (PC253L); anticorpo policlonale sviluppato in coniglio; diluizione di utilizzo (1:500). Utilizzata per marcare coni (Chang and Harris, 1998).

- Anti-GFP (green fluorescent protein) policlonale: prodotto dalla chemicon; numero del catalogo (AB3080); proveniente dalla jellyfish Aequorea victoria; diluizione di utilizzo (1:200).

- Anti-myc-tag (policlonale): prodotto dalla MBL; numero del catalogo (562); anticorpo sviluppato in coniglio; diluizione di utilizzo (1:500). Utilizzato per rivelare l’espressione di XGadd45γ XciclinaA2-Xcdk2, Xchx10.

- Anti-myc-tag (monoclonale): prodotto dalla Sigma-Aldrich; numero del catalogo (M5546); sviluppato in topo; diluizione di utilizzo (1:500). Utilizzato come sopra.

- Anti-pH3 (fosfo-histone): prodotto dalla upstate; numero del catalogo (06-570); anticorpo policlonale sviluppato in coniglio; diluizione di utilizzo (1:400). Rivela cellule miottiche in un gran numero di specie animali

- Anti-tubulina acetilata: prodotto dalla Sigma-Aldrich; numero del catalogo (T6793); anticorpo monoclinale prodotto in topo, rivela i processi neuritici di neuroni post-mitotici; diluizione di utilizzo (1:500).

Anticorpi II°

- Anti-rabbit IgG (intera molecola): prodotto dalla Sigma-Aldrich; numero del catalogo (T6778); sviluppato in capra; diluizione di utilizzo (1:150); Ab coniugato con (TRIC tetrametilrodamina isotiocianato).

- Anti-mouse IgG (molecola intera): prodotto dalla Sigma-Aldrich; numero del catalogo (C2181); sviluppato in pecora; diluizione di utilizzo (1:200); Ab coniugato con (CY3….); reagisce con le sottoclassi IgG di tipo G1, G2a, G2b, G3.

- Anti-mouse IgG (molecola intera): prodotto dalla Sigma-Aldrich; numero del catalogo (F2883); sviluppato in pecora; diluizione di utilizzo (1:100); Ab coniugato con (FITC fluoresceina isotiocianato).

- Anti-rabbit IgG (molecola intera): prodotto dalla Sigma-Aldrich; numero del catalogo (F1262); sviluppato in capra; diluizione di utilizzo (1:64); Ab coniugato con (FITC).

Embrioni di Xenopus laevis.

I protocolli di base per ottenere embrioni di Xenopus laevis in laboratorio e determinarne lo stadio di sviluppo sono stati precedentemente descritti (REF Newport e

Kirschner, 1982). Qui di seguito vengono ricordati i punti principali e le variazioni rispetto ai procolli pubblicati.

Gli embrioni utilizzati sono stati ottenuti mediante la fecondazione in vitro. Il maschio viene anestetizzato immergendolo in una soluzione allo 0,1% di MS-222 (metansulfonato dell’estere etilico dell’acido 3-aminobenzoico), prima di essere operato per la rimozione dei testicoli. I testicoli possono essere conservati per qualche giorno a 4°C in tampone MMR 1X (vedi composizione più avanti) e gentamicina (20 µg/ml).

Le femmine di Xenopus laevis vengono prestimolate con 100 UI di Folligon Intervet per uso veterinario, da 4 a 11 giorni prima della deposizione e con 800/1000 UI di Profasi HP 5000 Serono (gonadotropina corionica) 12-15 ore prima della deposizione; entrambi gli ormoni vengono somministrati tramite iniezione nel sacco perilinfatico.

Le uova da fecondare vengono ottenute esercitando una leggera pressione sull’addome degli animali e vengono raccolte in piastre Petri, contenenti MMR 0,1X. La fecondazione è effettuata tramite omogenato di testicolo in MMR 1X, disposto sulle uova da fecondare. L’avvenuta, fecondazione è evidenziata dal fenomeno della rotazione corticale.

Dopo almeno 25 minuti dalla fecondazione, gli embrioni vengono provati del loro rivestimento gelatinoso, mediante il trattamento con la soluzione degelificante, contenente DTT (ditiotreitolo). L’MMR 0,1X viene rimosso e sostituito con la soluzione degelificante, in cui gli embrioni vengono lasciati per circa 5-10 minuti fino a che non sia evidente la perdita del rivestimento gelatinoso. A questo punto, la soluzione di DTT viene eliminata sciacquando le uova fecondate in MMR 0,1X.

Gli stadi embrionali sono stati identificati secondo i criteri di Nieuwkoop e Faber (1967). Soluzioni: MMR NaCl 0,1 M KCl 2 mM MgSO4 1 mM CaCl2 2 mM HEPES 5 mM pH 7.8 EDTA 0,2 M

Soluzione degelificante DDT 3,2 mM Tris-HCl 0,2 M pH 8.8

Trattamenti con Idrossiurea/Afidicolina (HUA).

Sono stati trattati embrioni a partire da stadio 22 fino a stadio 39 in terreno MMR 0,1X con una concentrazione di idrossiurea 150mMe di afidicolina 20µM.

L’idrossiurea ha la capacità di bloccare la nucleoside difosfato reduttasi, un enzima che catalizza la riduzione dei ribonucleotidi in deossiribonucleotidi, evento fondamentale per la biosintesi del DNA. L’afidicolina invece è un inibitore, della DNA polimerasi eucariotica.

Questa combinazione di inibitori della sintesi del DNA è stata usata in quanto l’idrossiurea da solo entra in funzione in un tempo relativamente breve (circa entro 2 ore), ma non inibisce completamente la sintesi del DNA, mentre l’afidicolina inizia la propria attività in un tempo relativamente lento (circa 4-6 ore) ma blocca in maniera completa e irreversibile la sintesi di DNA.

Lipotrasfezione di embrioni di Xenopus laevis.

La tecnica di lipotrasfezione in specifiche regioni del SNC di embrioni di Xenopus è stata precedentemente descritta (Holt et al., 1990). Tuttavia, nonostante oramai da anni alcuni laboratori nel mondo applichino la lipotrasfezione alle vescicole ottiche embrionali, le specifiche modifiche apportate al protocollo originale non sono state pubblicate. Gran parte delle modifiche qui descritte sono frutto dei preziosi consigli ricevuti dalla Dr.ssa Andrea Viczian, del laboratorio di William Harris (Cambridge, UK)

Gli esperimenti di lipotrasfezione di questa tesi sono stati sempre condotti su embrioni di Xenopus a stadio 17-18, iniettando cDNA nella vescicola ottica in formazione. La lipotransfezione è un protocollo efficace per lo studio funzionale cellula-autonomo di geni che si esprimono durante la retinogenesi (Holt et al., 1990). Infatti con questa tecnica è possibile studiare l’effetto del guadagno o della perdita di funzione di un gene di interesse nella progenie di singoli progenitori retinici lipotrasfettati all’interno di retine normali. In questo caso gli effetti della lipotrasfezione non possono essere

verosimilmente mediati da segnali extra-cellulari, ma sono dovuti a segnali intrisnseci alla cellula lipotrasfettata.

Figura 10. Tecnica della lipotrasfezione.

Nello schema è raffigurata la tecnica di iniezione della lipotrasfezione. L’iniezione è diretta verso i territori presuntivi dlla retina, in embrioni di Xenopus laevis a stadio 17. Nella microfotografia è possibile osservare un clone di cellule marcate (in verde) con la GFP, derivante dalla lipotrasfezione di un singolo progenitore retinico. I diversi tipi cellulari sono facilmente identificabili per morfologia e posizione negli strati. I nuclei cellulari sono stati evidenziati con Hoechst (in blu).

Vettori di espressione.

Il cDNA di tutti i geni lipotrasfettati è stato clonato nel vettore plasmidico pCS2+, con l’eccezione del cDNA Xchx10, che è stato utilizzato nel vettore pCMV-SPORT6. La promozione della trascrizione è sotto il controllo del promotore costitutivo del citomegalovirus umano (hCMV). I vettori pCS2MTXcdk2 e pCS2MTXciclinaA2, recanti una sequenza myc-tag, sono stati precedentemente utilizzati in esperimenti di lipotrasfezione (Casarosa et al., 2003). Il vettore pCS2MTXXgadd45γ (Fig. 11) è stato gentilmente fornito dal Prof. Gomez-Skarmeta (CSIC, Madrid). Il vettore pCMV-SPORT6Xchx10 proviene dalla collezione di cDNAs di “Image Consortium Vectors (http://www.hgmp.mrc.ac.uk/geneservice). I vettori di espressione per i geni Xbh1, Xotx2 e Xotx5 sono stati precedentemente descritti (Poggi et al., 2004; Viczian et al., 2003).

Prima della lipotransfezione il cDNA del gene di interesse, se non recante una sequenza “tag” (cioè un epitopo riconoscibile mediante un anticorpo) è stato miscelato con un gene reporter in rapporto molare di 1 a 3. Sono stati utilizzati due geni reporter: EGFP-pCS2+, codificante per una versione “enhanced” della GFP, e pCS2MT+, recante una sequenza “tag” contenente 6 ripetizioni di una regione umana specie-specifica della proteina c-myc. Quest’ultima sequenza Tag è la stessa contenuta nei costrutti pCS2MTXgadd45γ, pCS2MTXcdk2 e pCS2MTXciclinaA2 e co-espressa con le relative proteine.

Il DNA è stato mescolato con il reagente liposomico DOTAP (N-[1-(2,3-diolielossi) propil]-N,N,N-trimetilammonio metilsolfato; Roche) in proporzione 1 microgrammo di DNA:3microlitri di DOTAP. A questa nuova miscela viene aggiunto 1/10 del volume finale di un colorante vitale verde Fast Green (disciolto in PBS1X, % peso volume), in modo da poter seguire la corretta localizzazione del liquido iniettato negli embrioni.

Microiniezione.

Gli aghi impiegati per la microiniezione all’interno della vescicola ottica vengano preparati per “tiratura” a caldo con un classico “Puller” da elettrofisiologia (Sutter Instruments Co; parametri: heat 95, pull 50), a partire da capillari in vetro (Drummond). Prima di essere montato sul microiniettore, l’ago deve essere spezzato sotto il microscopio binoculare con un paio di pinzette da dissezione Dumont “biologie” n. 5, in modo da avere un’estemità compresa fra 20 e 40 micrometri, e riempito di olio minerale mediante una siringa da insulina. Il caricamento del DNA da liopotrasfettare è eseguito dal microiniettore stesso, per aspirazione. In generale, vengono caricati nell’ago 2,5-4 µl di soluzione. Al momento della lipotransfezione si trasferiscono gli embrioni in una piccola piastra Petri alla quale è fissata, sul fondo, una griglia di plastica con maglie di circa 1 mm, per mantenere fermi gli embrioni durante la lipotransfezione. Le lipotransfezioni vengono eseguite con un microiniettore Drummond Nanoject, che consente l’iniezione di volumi compresi tra 4,6 nl e 73,6 nl ad incrementi discreti di 4,6 nl. Per ogni retina viene iniettato un volume fra 30 e 100 nl della miscela (cDNA-DOTAP).

Visualizzazione ed analisi delle cellule lipotrasfettate.

Gli embrioni lipotransfettati a stadio 17-18 vengono fissati, sezionati ed analizzati generalmente a stadio di sviluppo 42, corrispondente a retina embrionale matura e completamente stratificata. Nelle sezioni della retina si analizzano le cellule che esprimono il reporter Green Fluorescent Protein (GFP), o il myc-tag coespresso con la proteina lipotrasfettata. La GFP è una proteina spontaneamente fluorescente isolata dalla medusa del Pacifico Aequorea victoria. La sua funzione è di trasdurre in vivo, grazie ad un trasferimento di energia, la chemioluminescenza blu indotta in un’altra proteina, l’aequorina, in seguito al legame col Ca²+, in una luce fluorescente verde (Morin and Hastings, 1971). In entrambe i casi, la GFP, o il fluorocromo di un anticorpo secondario contro il myc-tag, permettono di distinguere le cellule lipotrasfettate mediante analisi con un microscopio ad epifluorescenza.

La natura delle cellule è stata valutata su basi morfologiche e in relazione alla posizione delle cellule negli strati; quest’ultima viene facilitata dalla colorazione dei nuclei cellulari con il fluorocromo Hoechst. Oltre a questi criteri, nel caso dei fotorecettori

sono stati distintamente analizzati, in alcuni casi, coni e bastoncelli, facendo uso di uno specifico anticorpo (anti-calbindin) che in Xenopus marca specificamente i coni (Chang and Harris, 1998).

Negli esperimenti oggetto di questa tesi, per ogni tipo di costrutto o combinazione di costrutti lipotrasfettati, sono stati effettuati tre o più esperimenti indipendenti, ciascuno su un numero minimo di 6 embrioni (corrispondente quindi a 12 retine lipotrasfettate). L’efficienza di lipotrasfezione, misurata in numero di cellule per retina analizzata, varia da meno di dieci a due–tre centinaia. Il numero di cellule lipotrasfettate dipende in realtà non solo dal numero di progenitori lipotrasfettati, ma anche del numero di divisioni cellulari che essi hanno effettuato dal momento della lipotrasfezione a quello dell’analisi. Se da un lato le dimensioni medie di un clone di controllo analizzato a st. 42 è di 10 cellule, geni ad effetto proliferativo come Xcdk2/XciclinaA2 o Xrx1 producono cloni grandi più del doppio, mentre il blocco proliferativo può ridurre ad un terzo la dimensione dei cloni (Casarosa et al., 2003).

Trattamento statistico dei dati Tipi cellulari

Per ciascun costrutto, o combinazione di costrutti lipotrasfettati, la percentuale di ciascun tipo cellulare rispetto al numero totale di cellule contate è stata calcolata su campioni di circa 100 cellule, provenienti dall’analisi di una o più retine lipotrasfettate. n, riportato nelle figure dei risultati, rappresenta il numero totale di cellule contate per ciascun costrutto/combinazione di costrutti lipotrasftettati. La percentuale media è stata calcolata su un numero minimo di tre campioni. Per ciascun valore percentuale medio sono stati calcolati deviazione standard ed errore standard della media (SEM). SEM è stato utilizzato per costruire le barre di confidenza di tutti gli istogrammi mostrati. Differenze fra due medie percentuali sono state giudicate significative quando superiori alla somma delle loro SEM; questo è indicato da un asterisco sopra alle barre di errore negli istogrammi mostrati.

Incorporazione di BrdU

Negli esperimenti di incorporazione di BrdU è stata calcolata la percentuale di cellule (totali o di un certo tipo differenziativo) lipotrasfettate e con nuclei BrdU-positivi, rispetto al numero totale di cellule lipotrasfettate e con nuclei BrdU-negativi. L’analsisi

statistica delle differenze percentuali è stata condotta poi come descritto sopra per i tipi cellulari.

Istologia.

Per l’analisi istologica delle retine lipotransfettate, ibridate con sonde Dig o immunocolorate, gli embrioni sono stati fissati, inclusi e criosezionati seguendo procedure standard.

La fissazione è un trattamento atto a preservare il tessuto da fenomeni degenerativi e per fissarne la struttura originaria. Gli embrioni che hanno raggiunto lo stadio desiderato vengono posti in “vials” con una soluzione di parafolmaldeide al 4% (peso/volume) in tampone PBS 1X. La fissazione prosegue per 1-1½ ora a temperatura ambiente su una bascula.

Soluzioni: Paraformaldeide

“Stocks” di paraformaldeide al 20% (peso/volume) in acqua sono generalmente aliquotati e conservati a -20°C. Per l’uso, la soluzione deve essere sciolta a non più di 50°C. Questa è stabile a 4°C per circa un mese. Una volta diluita ad una concentrazione d’uso finale del 4% in PBS 1X, la soluzione va usata entro qualche giorno.

PBS 1X: NaCl 13,7 mM KCl 22 mM Na2HPO4 80 mM KH2PO4 15 mM pH 7.4 Disidratazione

La soluzione di fissativo viene sostituita con una soluzione crioprotettiva costituita da saccarosio al 20% in PBS 1X. Gli embrioni vengono lasciati fino a quando precipitano sul fondo del tubo (fino a 24 ore a 4°C). Questo passaggio ha la funzione di eliminare

gran parte dell’acqua presente nei tessuti, disidratandoli lentamente ed impedendo la formazione di microcristalli di ghiaccio nel successivo passaggio di congelamento.

Inclusione.

Per poter facilitare il taglio, gli embrioni vengono posti in una resina a base acquosa liquida a temperatura ambiente e a basso punto di congelamento: OCT o “Tissue-Tek”. Gli embrioni vengono disposti in una vaschetta di plastica parallelamente al fondo, ricoperti di resina e fatti solidificare in un bagno di etanolo a -80°C per circa 15 minuti. Le vaschette vengono poi conservate a -80°C fino al giorno del taglio.

Criosezioni di retine embrionali.

I blocchetti, generalmente contenenti più embrioni disposti parallelamente l’uno all’altro, vengono tagliati utilizzando un criostato Leica C1850, in modo da ottenere sezioni trasversali dello spessore di 12 µm. Le sezioni sono raccolte su vetrini del tipo SuperFrost, la cui superficie è attivata elettrostaticamente per permettere una adesione immediata delle sezioni effettuate, e mantenuti poi a -80°C fino al momento dell’uso. Le sezioni, prima di essere sottoposte ai protocolli successivi, devono essere lasciate asciugare all’aria per almeno un’ora in modo da consentire una migliore aderenza al vetrino.

Immunoistochimica.

In tutti gli esperimenti di immunoistochimica descritti, la rivelazione è avvenuta utilizzando anticorpi secondari coniugati con un fluorocromo.

Le sezioni ottenute al criostato sono state sottoposte a tre lavaggi da 10 minuti ciascuno in PBS 1X per eliminare le tracce di resina di inclusione. Le sezioni sono state successivamente sottoposte a trattamento con anticorpo primario in una soluzione “blocking”. Questa soluzione, preparata in PBS 1X, contiene del siero di capra o di agnello (1% volume/volume) e dell’albumina (0,5% peso/volume) che servono a saturare siti di legame aspecifico degli anticorpi, un detergente che aumenta la permeabilità delle cellule (0,1% Triton, volume/volume) e l’anticorpo primario all’opportuna diluizione (vedi paragrafo “Anticorpi”). 150 microlitri di questa soluzione vengono messi sulla superficie del vetrino portaoggetto, che viene poi coperto da un

coprioggetto 24X60mm. I vetrini coperti vengono posti all’interno di una camera umida (una piastra quadrata da culture di lieviti) sul cui pavimento sono posti due strati di carta da filtro 3MM imbevuta di PBS1x. I vetrini poggiano su supporti cilindrici (pipette da 5 mls) incollate al fondo della piastra. La camera umida viene messa ad incubare per un’ora a 37°C oppure tutta la notte a 4°C. Al termine dell’incubazione, il coprioggetto viene fatto scivolar via dal vetrino immergendo quest’ultimo in PBS 1X. L’anticorpo I in eccesso o non legato specificamente viene eliminato effettuando tre lavaggi in PBS 1X (15 minuti ciascuno). Con analoghe procedure si procede ad incubare l’anticorpo secondario, aggiungendo Hoechst per la contro-colorazione in fluorescenza dei nuclei cellulari. Al termine dell’incubazione dell’anticorpo II vengono fatti tre lavaggi e i vetrini vengono montati con il montante acquoso Aqua Polimount.

In alcuni casi le reazioni di immunoistochimica sono seguite al protocollo di ibridazione in situ. In questo caso, al termine della rivelazione del substrato cromogenico delle fosfatasi alcalina (NBT-BCIP o Fast Red, vedi paragrafo successivo “ibridazione in situ su sezioni”), le sezioni sono state lavate tre volte in PBS1X (15 minuti per ogni lavaggio) e sottoposte ad incubazione con anticorpo I.

Iniezione e rivelazione della Bromodeossiuridina (BrdU).

Embrioni a stadio 31-34 sono stati anestetizzati mediante immersione in una soluzione allo 0,1% (peso/volume) di MSS (metil metan sulfossido) in tampone MMR 0,1X. Gli embrioni sono stati iniettati nell’addome con 100 nl di Bromodeossiuridina (BrdU) 15mg/ml, utilizzando lo stesso metodo di iniezione descritto per la lipotrasfezione. Gli embrioni sono poi stati fissati, crioprotetti, congelati e sezionati come descritto. Prima di essere sottoposte ad incubazione con anticorpo anti-BrdU, le sezioni sono state trattate per 25 minuti in HCl 2N. Questo trattamento deproteinizza la cromatina rendendo accessibile l’epitopo al riconoscimento da parte dell’anticorpo. Dopo il trattamento in HCl , quest’ultimo è stato rimosso con 5 lavaggi di 15 minuti in PBS1X e le sezioni sono state sottoposte ad incubazione con anticorpo I anti-BrdU. Nel caso di rivelazione di BrdU in esperimenti di lipotrasfezione, alla soluzione di anticorpo anti-BrdU è stato a aggiunto anticorpo anti myc-tag policlonale per rivelare le cellule lipotrasfettate.

Ibridazione in situ su sezioni.

Per la sintesi di sonde antisenso ad RNA marcate con Digossigeninan (Dig) si effettua una reazione di trascrizione in vitro standard usando Sp6, T7 o T3 RNA polimerasi, aggiungendo la miscela di reazione contenente i tre rNTPs rATP, rCTP, rGTP e rUTP-Dig (rUTP-Dig mix Roche). La miscela di reazione viene preparata aggiungendoi seguenti reagenti a temperatura ambiente:

Tampone di trascrizione 5x 4µl DTT 100mM 2µl DNA linearizzato (1µg/µl) 1µl Rnase-Inhibitior (20UE/µl) 1µl RNA polimerasi 2µl Miscela di nucleotidi con:

digossigenina-UTP 2.5 mM 2µl H2O RF fino a 20µl

Dopo incubazione a 37°C per due ore, si aggiunge 1µl di Dnasi (1mg/ml) e si pone 37°C per altri 15 minuti. Per effettuare la precipitazione alcolica si aggiungono 70µl di RbCl 5M e 1V di isopropanolo. Dopo aver mescolato capovolgendo il tubo diverse volte, si mette il tutto a precipitare a -80°C per 15 minuti. A questo punto si centrifuga a 12000 rpm a 4°C per 20 minuti; successivamente, eliminando il sovranatante, si aggiungono 100 µl di EtOH 70% preraffreddato e si centrifuga a 12000 rpm a 4° per 5 minuti. Si libera infine il pellet da tutto l’etanolo residuo, lasciandolo evaporare all’aria a temperatura ambiente e si risospende in 50 µl di H2O RF (oppure TE pH 7.5 RF). La stima della quantità del trascritto ottenuto viene effettuata su gel di agarosio, servendosi dell’ausilio di tRNA a concentrazione nota, come “marker” di quantità. I trascritti possono essere conservati in “stock” nella miscela di ibridazione a -80°C.

Ibridazione e rivelazione.

La sonda trascritta in vitro viene diluita in Tampone di ibridazione (vedi composizione più avanti) fino a raggiungere la concentrazione di 1-0,1 µg/ml (questo dipende dall’efficienza della sonda e viene di volta valuato empiricamente); la sonda

opportunamente diluita viene denaturata per 5 minuti a 70°C. Si aggiungono 150 µl di miscela di ibridazione contenente la sonda ad ogni vetrino e lo si copre con un coprioggetto. La reazione di ibridazione avviene “overnight” a 65°C in una camera umida contenente carta assorbente “Whatman” imbevuta con sali di ibridazione 1X + 50% formammide.

Per i lavaggi post-ibridazione, si trasferiscono i vetrini in un portavetrini verticale senza fondo, in modo che i coprioggetto possano scivolare via. Si effettua un primo lavaggio a 65°C per 15 minuti in una soluzione contenente:

1X SSC

50% formammide 0,1% Tween-20

Questa soluzione deve essere preriscaldata a 65°C. In seguito si effettuano tre lavaggi da 30 minuti con la stessa soluzione a 65°C e due lavaggi a temperatura ambiente in MABT (vedi composizione più avanti).

Si effettua poi una reazione di “blocking” in MABT + 2% “blocking reagent” (Roche) + 20% siero di capra. Si aggiunge 1 ml di questa soluzione a ogni vetrino e si incuba in una camera umida per un’ora. L’anticorpo anti-DIG deve essere diluito 1/2500 all’interno della soluzione di “blocking”. Si aggiungono quindi 150 µl di “blocking”, in cui è stato diluito l’anticorpo, su ogni vetrino; si copre con coprioggetto e si lascia incubare “overnight” in una camera umida a temperatura ambiente.

I lavaggi post-anticorpo (5 in tutto) vengono effettuati a temperatura ambiente in MABT per 30 minuti ciascuno. Questi sono seguiti da due lavaggi da 10 minuti nel tampone di reazione cromogenica della fosfatasi alcalina (vedi composizione qui di seguito).

La reazioni di colorazione può essere fatta in modo da visualizzare il segnale in luce bianca o in fluorescenza.

Nel primo caso si esegue sciogliendo 18µl di colorante NBT-BCIP (stock liquido, Roche) per ogni ml di tampone di reazione cromogenica della fosfatasi alcalina, e incubando le sezioni con questa soluzione al buio e a temperatura ambiente. L’anticorop anti-DIG è coniugato alla fosfatasi alcalina: là dove l’enzima è presente avviene una reazione cromogenica con formazione di un precipitato blu-violetto. Bisogna controllare l’andamento della reazione ad intervalli di poche ore per evitare che si formi un eccessivo precipitato. Per fermare la reazione occorre risciacquare più volte, per pochi

minuti, i vetrini in PBS 1X. Nel caso di rivelazione di segnale fluorescente, al posto del NBT-BCIP si usa il substrato Fast Red (Roche), seguendo le indicazioni del produttore. Il Fast Red produce un segnale fluorescente che per caratteristiche di eccitazione ed emissione è paragonabile quello dei fluorocromi rodamina o Cy3. Per questo il Fast Red è stato utilizzato nei casi di co-rivelazione immunoistochimica coniugandolo all’uso di fluorocromi verdi (es fluoresceina o Cy2).

Soluzioni: Tampone di ibridazione Formammide 50% Sali 10X 1X Denhardt’s 1X Destran solfato 50%

MABT (Maleic Acid Buffer Tween) pH 7.5 Acido maleico 100 mM

NaCl 150 mM Tween-20 0,1%

Tampone di reazione cromogenica della fosfatasi alcalina Tris 100 mM pH 9.5

MgCl2 50 mM NaCl 100 mM Tween-20 5 mM

Levamisol 2 mM (inibitore della fosfatasi endogena)

10X Sali (1L) NaCl 114 g Tris HCl 14,04 g Tris Base 1,34 g NaH2PO4*2H2O 7,8 g Na2HPO4 7,1 g 0,5M EDTA 10 ml

Microfotografie.

I preparati istologici sono stati analizzati utilizzando un microscopio Nikon Eclipse 600, dotato di obiettivi 4X, 10X, 20X e 40X.. Le osservazioni in luce bianca (es. ibridazioni in situ rivelate con substrato della fosfatasi alcalina NBT-BCIP) sono state effettuate contrastando i preparati con il dicroismo circolare (DIC). Le osservazioni in fluorescenza sono state effettuate utilizzando blocchi ottici con spettri di eccitazione-emissione standard per i tre tipi di fluorocromo maggiormente in uso: rodamina (luce in emissione rossa) fluoresceina (luce in emissione verde; questo è stato utilizzato anche per la rivelazione di GFP) e DAPI (luce in emissione blu; questo è stato utilizzato esclusivamente per la rivelazione dei nuclei cellulari con fluorocromo Hoechts). Le immagini sono state acquisite con una fotocamera digitale Photometrix, modello”Cool Snap”, dotata di sensore CCD a colori con dinamica di 12 bit per canale e risoluzione 1,3 Mpixels. I pannelli delle figure mostrate sono stati costruiti utilizzando i programmi Adobe Photoshop e Microsof t PowerPoint.