Capitolo 2

Capitolo 2

Segmentazione di bioimmagini

La segmentazione è uno dei processi fondamentali nella elaborazione delle immagini in genere, e riveste un ruolo particolare per quelle ricavate dall’osservazione di fenomeni biologico-medici. Essa ha come obiettivo l’individuazione e l’esaltazione di oggetti ad alta priorità rispetto allo sfondo o rispetto ad altri oggetti circostanti.

La storia delle immagini biomediche e la relativa elaborazione ha inizio poco più di cento anni fa con la scoperta dei raggi X da parte di Roentgen. Con esse nasce anche l’esigenza di estrarvi quante più informazioni possibili, in modo da aumentarne la leggibilità e supportare in modo sempre più puntuale la decisione medico-clinica.

Fig. 2.1

Segmentazione di

immagine radiografica di arteria coronarica umana

2.1 Campi di applicazione

La segmentazione di immagini trova applicazione nei campi più svariati, tra i quali:

- nel campo medico, biomedico, per il riconoscimento di masse cellulari, tissutali;

Fig. 2.2

Immagine di Risonanza Magnetica (Magnetic Resonance Imaging, MRI) raccolta presso il laboratorio di Risonanza Magnetica, Istituto di

Fig. 2.3

Immagine di cellule tumorali in vitro.

Fig. 2.4

Immagine di immunoistochimica per fluorescenza: sezione di retina di girino di Xenopus . Evidenziazione di proteine specifiche.

- in campo batteriologico, per l’analisi dell’evoluzione di colture batteriche;

Fig. 2.6 Sezione trasversale di retina di Xenopus. In blu nuclei delle cellule,

in rosso strato nucleare esterno ( fotorecettori marcati )

Immagine raccolta presso il Laboratorio di Biologia Cellulare e dello Sviluppo, Università di Pisa

Fig. 2.5

Immagine di coltura batterica (E. Coli ) al microscopio

- in campo biologico, per il controllo di colture, la verifica del manifestarsi di specifiche proteine o complessi proteici marcati; - nelle analisi di laboratorio per il conteggio di globuli rossi, piastrine, e

altro particolato solido;

- nell’analisi della viabilità stradale;

- nel campo dell’indagine astronomica per la rilevazione di corpi celesti;

- nell’analisi dei materiali;

in particolare nel campo dell’elettronica integrata, ad esempio per l’ individuazione di discontinuità nelle connessioni elettriche ;

- nel campo del tele rilevamento; una delle applicazioni è infatti l’analisi del territorio e della sua utilizzazione;

Fig. 2.7

Di seguito vengono descritte le principali tecniche di segmentazione utilizzate per la elaborazione di immagini.

Fig. 2.8

Rappresentazione RGB di una scena fotografata da satellite e relativa segmentazione

2.2 Tecniche di elaborazione

Senza perdere in generalità, di seguito si farà riferimento alla categoria di immagini ‘ad intensità ’. In esse l’informazione è contenuta nel livello di colore proprio di ciascun pixel. In particolare ci si soffermerà sulle immagini a livelli di grigio al quale ogni altro tipo di rappresentazione è riconducibile. In questo caso l’informazione è associata, punto per punto, al relativo livello di grigio (tipicamente 256, per immagini codificate su 8 bit).

I metodi di indagine ed elaborazione più comunemente utilizzati fanno capo alle seguenti tecniche:

- tecniche di elaborazione mediante soglia - tecniche di esaltazione dei bordi

- tecniche basate sull’analisi di zone

- tecniche basate sulla conservazione di proprietà connettive - tecniche di tipo ‘Region Growing’

2.2.1 Elaborazione mediante soglia

Questo tipo di elaborazione (‘Threshold technique’) ha, come punto di partenza, l’analisi dei livelli di grigio dei pixel che compongono il pattern sotto analisi .E’ quindi una tecnica che sfrutta informazioni locali per realizzare la segmentazione voluta. La massima efficacia di questo

metodo si ha quando la gamma di livelli di grigio degli oggetti ricercati è separata da quella propria degli elementi che costituiscono lo sfondo o comunque elementi considerati esterni alla ricerca. Da questo tipo di approccio, nonostante il fatto che l’informazione legata alla posizione non sia significativa, è possibile ottenere facilmente segmentazioni con un buon contenuto informativo.

2.2.2 Elaborazione mediante esaltazione dei bordi

Questo approccio (‘Edge-based method’) si focalizza sulla rilevazione dei contorni sfruttando le discontinuità nei livelli di grigio presenti nell’immagine. Un punto di debolezza di questo metodo sta nella difficoltà di chiudere le linee di profilo in presenza di rumore. Infatti per le immagini semplici e libere da rumore, la rilevazione dei bordi porta facilmente alla delineazione diretta del contorno. Tuttavia, la rilevazione del bordo in immagini rumorose e complesse produce spesso bordi mancanti o comunque non sufficienti a formare un insieme di curve chiuse. Gli operatori di Sobel, di Prewitt e di Laplace sono esempi dei metodi di rilevazione del bordo.

2.2.3 Elaborazione mediante analisi a zone

Un metodo basato sull’analisi delle regioni (‘region-based method’) tipicamente procede come segue: l'immagine viene suddivisa in regioni collegate tra loro raggruppando i pixel vicini con livelli simili di intensità. Le regioni adiacenti vengono successivamente fuse tra loro in base al

risultato di un test di verifica che coinvolge l' omogeneità e l' evidenza dei contorni di regione. Test che impongono criteri troppo stringenti generano solitamente frammentazione nelle immagini risultanti: la determinazione dei criteri è quindi un punto chiave.

2.2.4 Elaborazione mediante conservazione di proprietà connettive

Un metodo di segmentazione basato sulla conservazione di proprietà connettive (‘connectivity-preserving relaxation-based segmentation method’), citato in letteratura solitamente come modello di profilo attivo (‘active contour model’), è stato proposto recentemente. L’elaborazione ha inizio da un primo contorno che poi viene modificato iterativamente applicando funzioni di contrazione/espansione secondo una funzione di energia. Anche se il modello di minimizzazione dell’energia non è nuovo, affiancandolo con uno basato sulla conservazione elastica di un profilo, consente di ottenere risultati interessanti. Il rischio che si corre nell’uso di questi metodi è rimanere intrappolati nei minimi locali delle funzioni utilizzate; è un aspetto di cui tener conto e di non facile soluzione. Contrariamente alla natura euristica di questi metodi, la geometria di calcolo suggerisce un approccio più algoritmico. Tipicamente si formalizza in primo luogo un criterio matematico di verifica della qualità di una segmentazione eseguita. Ciò permette di formulare il problema in analisi come problema di ottimizzazione sotto determinati vincoli geometrici. Una funzione che è possibile considerare ‘oggettiva’ e che si cerca di ottimizzare è la varianza delle interclassi utilizzata anche nell'analisi discriminante.

2.2.5 Elaborazione con approccio ‘Region Growing’

A differenza del metodo derivativo, questo approccio sfrutta le informazioni spaziali e garantisce la formazione di regioni tra loro collegate. Il processo di segmentazione delle immagini denominato

‘Region Growing’ (‘Crescita per zone’) è un approccio che prevede

l’esecuzione di un numero fissato di segmentazioni gerarchiche e successive a differenti livelli di dettaglio. Di fatto è una implementazione ricorsiva di una segmentazione effettuata per pixel adiacenti. La routine prevede che l’utente scelga un punto di partenza all’interno del pattern da riconoscere. Il valore di livello di grigio così individuato costituisce il punto di partenza (detto ‘seed pixel’, ‘pixel seme’) per la successiva elaborazione: si vanno ad analizzare ricorsivamente i pixel adiacenti a quello selezionato inizialmente. Quelli che hanno un livello di grigio appartenente ad un intervallo prefissato vengono selezionati, gli altri scartati.

L’approccio Region Growing prevede i seguenti passi:

- Si seleziona un gruppo di piccole aree in accordo a criteri di somiglianza.

- Si sceglie un arbitrario ‘seed pixel’ che viene confrontato con quelli adiacenti.

- Dal seme si passa ad una regione che ‘cresce’ aggiungendo progressivamente quei pixel adiacenti che sono ‘simili’ a quello iniziale secondo criteri di somiglianza fissati.

- Quando la crescita di una regione si ferma è sufficiente scegliere un altro pixel ‘seme’ che ancora non è stato analizzato e non appartiene a

nessuna regione e far ripartire la routine. Il processo termina quando tutti i pixel dell’immagine sono stati presi in considerazione.

E’ un metodo di tipo ‘bottom-up’ in quanto si parte dalla regione che si vuol esaltare rispetto al resto dell’immagine che viene così a costituire lo sfondo.

Questo tipo di segmentazione consente di individuare in modo ottimale i confini degli oggetti individuati per osservazione. Il fatto di avviare l’elaborazione da un particolare pixel e lasciar crescere completamente la regione prima di individuarne altri può influenzare la segmentazione in favore di regioni già segmentate.

Ciò può avere effetti indesiderati, quali:

- le regioni già individuate possono dominare il processo di crescita causando ambiguità nei pressi dei bordi di regioni adiacenti che potrebbero non venir individuate correttamente

- differenti scelte dei semi iniziali possono dar luogo a risultati differenti

- possono esserci problemi se il seme, scelto arbitrariamente, sta in corrispondenza di una discontinuità

Al fine di tener conto delle suddette problematiche sono state sviluppate delle tecniche di tipo ‘simultaneo’:

- Eventuali regioni simili e adiacenti sono considerate contemporaneamente

- Non è consentito ad una singola regione di dominare completamente il processo

- Un certo numero di regioni vengono fatte crescere contemporaneamente

- Regioni simili vengono gradualmente fuse in una unica in espansione

Fig. 2.9

Principio di funzionamento della tecnica Region Growing

Per la sua caratteristica di ricorsività, questa tecnica è stata sviluppata in particolare modo nei processi di calcolo parallelo in cui due o più processori elaborano contemporaneamente la stessa immagine o sezioni in cui la stessa è stata divisa.

L’approccio diretto però non è esente da problemi. Infatti può non essere chiaro dove terminare il processo di crescita dando così luogo a sotto o sovra segmentazione. Inoltre vista la ricorsività di questo approccio, esso risulta, dal punto di vista della complessità di calcolo , pesante da eseguire.

In alcuni casi questa tecnica è stata affiancata al clustering spettrale. In pratica in questo approccio ‘misto’ il processo ‘Region Growing’ controlla ancora la segmentazione dell’immagine fissando una soglia per la successiva analisi spettrale, così che questa ultima sia spazialmente delimitata alle sole zone di interesse al fine di separarle al massimo.

Nel presente lavoro di tesi, tra le tecniche di indagine passate in rassegna ne sono state selezionate e sviluppate tre:

- segmentazione mediante soglia; - segmentazione mediante gradiente;

- segmentazione secondo la tecnica ‘Region growing’.

La scelta ha come obiettivo l’utilizzazione di metodi di analisi tra loro complementari sia per tipo di approccio che per flessibilità di intervento da parte dell’operatore.

2.3 Segmentazione di immagini di coltura batterica

2.3.1 Escherichia Coli

L’ E. Coli (fam. Enterobacteriaceae ) è un batterio molto studiato in ambito medico e biologico in quanto ospite abituale dell’intestino umano. Quantitativamente esso costituisce lo 0,1% circa dei batteri che complessivamente vivono nel nostro intestino. La sua funzione è importante in quanto consente l’assimilazione dei complessi vitaminici K e B12. Un suo sviluppo anomalo può però provocare infezioni alle vie urinarie, degli organi genitali, delle vie biliari, infezioni delle vie respiratorie, alcune forme di meningite nel neonato. In ambito industriale trova applicazione nella produzione di proteine di ricombinazione e prodotti chimici di interesse. Una importante caratteristica di questo bacillo è la sua capacità di duplicazione molto rapida anche in assenza di ossigeno e con una richiesta nutrizionale piuttosto elementare: in una coltura con glucosio, la divisione, che tipicamente avviene ogni 50 minuti circa, può infatti arrivare ad avvenire anche in circa venti minuti. Ciò

Fig. 2.10

Immagine di E. Coli al microscopio elettronico

implica chiaramente che un processo incontrollato può portare alla formazione di colonie enormi all’interno di un organismo nel giro di poche ore con conseguenze anche gravi. Nasce così l’esigenza di un suo monitoraggio costante nel tempo. Nel 1997, un ceppo di questo batterio è stato causa della morte di venti persone nello Lanarkshire (USA). Si è infatti scoperto che ne esiste una varietà in grado di resistere alla inattivazione termica da refrigerazione utilizzata nell’industria alimentare.

Le successive elaborazioni hanno come oggetto immagini di coltura di E. Coli raccolte al microscopio.

2.4 Sezione di funzione relativa alla segmentazione

2.4.1 Segmentazione con soglia

Premendo il tasto ‘Soglia’ l’utente è invitato a selezionare l’ immagine e la zona da elaborare. A selezione avvenuta, viene attivata una funzione che consente di visualizzare nel titolo le coordinate del punto corrente ed il relativo livello di grigio. Essa è in grado di funzionare anche dopo il ridimensionamento a video della finestra in oggetto. Facendo pressione con il mouse su un punto viene visualizzato un ingrandimento locale. Questo particolare è stato introdotto per facilitare e per aumentare la precisione durante la selezione del pixel e del relativo tono di grigio. (Figura 2.11)

La pressione del tasto ‘Seleziona livello di grigio’ attiva la funzione di visualizzazione del livello nel titolo già discussa in precedenza, e consente la scelta del pixel da cui elaborare. Il puntatore circolare aiuta nella selezione.

A selezione avvenuta viene avviata la segmentazione vera e propria; vengono visualizzate due figure: in una i pixel che possiedono proprio il livello selezionato, in una seconda quelli di valore uguale od inferiore. Entrambe portano indicazione nel titolo del tipo di elaborazione effettuata. (Figure 2.12 e 2.13)

Formalmente, la relazione considerata è la seguente:

(indicando con ‘LMin’ il minimo livello di intensità visualizzabile, considerando un pixel di coordinate (i,j) ed un valore di soglia ‘Threshold‘)

If Image(i,j) <= Threshold then Image(i,j) = LMin Fig. 2.11

Per aumentare ulteriormente la flessibilità, si è introdotta la possibilità di indicare un valore specifico di livello dall’ esterno. (Figura 2.14)

Fig. 2.12 Pixel a livello di grigio indicato Fig. 2.13 Segmentazione a soglia

Selezionando l’ opzione ‘Si’ viene visualizzata una finestra di dialogo in cui si immette il valore che viene confermato alla pressione di ‘OK’. (Figura 2.15)

Il risultato è immediatamente mostrato a video insieme alla immagine originale e ad una finestra di dialogo che illustra i possibili passi successivi.

In particolare, una funzione che è stata introdotta a questo livello è quella di ‘Ritocco’. Essa consente di andare a modificare localmente quanto emerso dall‘elaborazione per soglia precedente. Può accadere infatti che, per effetto del rumore o delle caratteristiche intrinseche dell’ immagine stessa, emergano elementi che non interessano oppure incompleti; è possibile eliminarli semplicemente utilizzando il puntatore come se fosse un pennello correttore. La pressione del puntatore modifica istantaneamente lo spazio da esso coperto cancellando quanto selezionato. Ciò consente di ripulire facilmente le elaborazioni così da

Fig. 2.14

Interrogazione

Fig. 2.15

lasciare intatto il contenuto informativo e non inficiare le elaborazioni successive.

Per facilitare il confronto passo-passo con il risultato originale, questa ultima viene visualizzata a parte mentre si va ad operare il ritocco

su una replica (con titolo ‘Immagine ritoccata‘ ).

Ciò consente di valutare progressivamente le correzioni apportate ed eventualmente di poter ripartire da capo (Figure 2.16, 2.17).

Fig. 2.16 Risultato intermedio Fig. 2.17 Visualizzazione informazione

Al termine della fase di ritocco è possibile salvare quanto ottenuto. Si consiglia di assegnare un nome significativo per poter successivamente recuperare con facilità il file. La pressione del tasto ‘Salva’ avvia infatti la relativa funzione che chiede conferma dell’operazione in corso e successivamente consente l’immissione del nome. Al termine della procedura si è informati sul buon esito della memorizzazione.

Per poter recuperare quanto salvato si procede cliccando ‘File’ - ‘Open’ nel menu di Matlab, ed andando poi a selezionare il file nella directory in cui è stato memorizzato ( tipicamente quella corrente di lavoro ).

Per ovviare all’assenza di un tasto ‘Annulla’ che consenta di fare un passo indietro durante la fase di ritocco, si consiglia di salvare l’ elaborato prima di passi ritenuti critici, quali nelle vicinanze dei bordi, in caso di alta densità di oggetti, etc.

Fig. 2.18

Operazione di ritocco

Al termine della procedura di memorizzazione l’immagine non viene chiusa per cui è possibile comunque proseguire nel relativo ritocco.

Se si è accorti, non si rende quindi necessaria la presenza di un tasto (ed una relativa funzione ) che consenta di effettuare un passo indietro.

2.4.2 Segmentazione con gradiente

Selezionando il tasto ‘Gradiente’ si avvia la procedura per segmentare l’immagine secondo questo metodo. Si è invitati, come nel caso precedente, a selezionare il file da elaborare.

Indicata con una funzione di due variabili, il gradiente può essere espresso come

Di fatto, l’operazione di gradiente su una immagine è realizzata attraverso la convoluzione bidimensionale tra questa ed una matrice contenente opportuni i coefficienti ( tipicamente detta ‘Kernel’).

Considerando due funzioni e di due variabili discrete ed , la loro convoluzione bidimensionale può essere così espressa:

Fig. 2.19

La funzione, ad elaborazione avvenuta, visualizza quattro figure: l’immagine di partenza ed il risultato dell’ elaborazione secondo i filtri di Sobel, Prewitt e Roberts.

Le relative matrici (Kernel) sono:

-1 -2 -1 0 0 0 1 2 1 -1 -1 -1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 -1 Matrice di Sobel = Matrice di Roberts = Matrice di Prewitt =

/ 8

/ 6

2

I coefficienti a moltiplicare normalizzano il risultato.

Come nel caso precedente, è ancora possibile eseguire sia il ritocco del risultato della segmentazione attraverso lo strumento correttivo, che la relativa memorizzazione.

Ancora una volta ogni figura riporta nel titolo l’indicazione del metodo applicato. Per una maggiore leggibilità e per uniformare tra loro i risultati ottenuti dalle elaborazioni, la visualizzazione avviene in nero su sfondo bianco.

In figura 2.20 è riportato un esempio di elaborazione .

Si può notare, pur tenendo conto delle differenze tra metodo e metodo, come questo strumento sia poco efficace nei casi di immagini in cui i pattern che si sta tentando di individuare ed esaltare sono

Fig. 2.20

Segmentazione con gradiente

sui bordi non sono chiuse e se non addirittura assenti. Per le sue caratteristiche intrinseche, il metodo secondo gradiente infatti funziona correttamente nei casi in cui i soggetti sotto indagine sono particolarmente contrastati rispetto allo sfondo, nel qual caso il differenziale di livello di grigio tra questo ultimo e gli oggetti sotto indagine è ben marcata.

2.4.3 Segmentazione con approccio ‘Region Growing’

Per l’utente, il funzionamento di questa sezione di programma è simile a quello relativo alla parte di segmentazione per soglia.

Alla pressione del tasto denominato ‘Region Growing’ viene avviata una funzione che invita l‘ utente a selezionare una immagine tra quelle già caricate a video. E’ prevista la possibilità di selezionare sia immagini a colori nella rappresentazione RGB che immagini a livelli di grigio.

Nel caso specifico si è indagato sulle formazioni di colore rosso ( nucleo delle cellule colorato con marcatore specifico ed evidenziazione per fluorescenza).

Di seguito si riporta un ulteriore esempio di elaborazione su immagine a colori. In figura 2.22 si ha il frame di elaborazione complessivo; nelle figura 2.23 e 2.24 due particolari ( invertiti per un maggior risalto).

Fig. 2.22

E’ possibile sia salvare l’elaborazione così come ottenuta, che modificarla preventivamente attraverso lo strumento di ritocco già decritto.

Fig. 2.23

Particolare (segmentazione della zona in rosso)

Fig. 2.24

Particolare (segmentazione della zona in blu)

La gestione delle immagini di tipo a livelli di grigio consente maggiori gradi di libertà per l’utente. Infatti, come indicato in figura 2.25, una volta selezionata e caricata l’immagine da segmentare, vengono richieste due quantità: la dimensione della zona interessata dal campionamento, la tolleranza ammessa.

La prima quantità incide sulla dimensione degli oggetti che si vanno cercando, la seconda sulla capacità della routine di discriminare tra pixel ad essi appartenenti o meno.

Vengono indicati due valori di default. La pressione del tasto ‘Ok’ avvia l’elaborazione.

Fig. 2.25

Fig. 2.26

Segmentazione di immagine a livelli di grigio secondo la tecnica ‘Region Growing’