MATERIALI E METODI
2.1. Reagenti utilizzati
Acrilammide ed ammonio persolfato (APS) forniti da BioRad; albumina (BSA), 3-[(3-Colammidopropil)dimetilammonio]-1-propanesulfonato (CHAPS), dimetilsulfossido (DMSO), acido etilenebis(ossietilenenitrilo)tetraacido (EGTA), Hoechst 3325, benzamidina, dithiothreitol (DTT), fuoruro di fenil-metil sulfonile (PMSS), inibitori della tripsina, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), leupeptina e pepstatina), metformina, paraformaldeide, tripsina-etilenediaminetetraacido (EDTA) e Triton X-100 da Sigma; 5'-amminoimidazolo-4-carbossammide (AICA) riboside è fornito da Toronto Research Chemicals; anticorpo monoclonale anticitocromo c di topo e anticorpi monoclonali di coniglio per anti-caspasi 9 e antifosfoAMPK sono stati forniti da PharMingen e Cell Signalling Technologies Inc. rispetiiamente; anticorpi anti IgG di topo e anticorpo anti IgG di coniglio entrambi coniugati a perossidasi di rafano (HRP) sono stati forniti da Dako e Chemicon International rispetiiamente; Kit Super Signal West Pico Chemioluminescent Substrate forniti dalla Pierce;; membrana in fuoruro d i p oliiinilidene ( PPDS) f ornita d alla M illipore; D ulbeccoos m odiied Eagleos medium (DMEM); L-glutammina ,100x penicillina, streptomicina e fungizone forniti da Euroclone; Siero Boiino Setale (SBS) distribuito da Biochrom, Berlino, Germania; sodio dodecil solfato (SDS) e tris(idrossimetil)amminometano (TRIS) sono forniti da Pharmacia Biotech; le soluzione di siiluppo e di issaggio fornito da Kodak;
le soluzioni di standards prestained sono forniti da Iniitrogen Life Tecnologies; TEMED iiene fornito dalla Boehringer Mannheim.
Le cellule di neuroblastoma umano, SH-SY5Y, sono state gentilmente donate dal Dr. A. Arcangeli, Uniiersità di Sirenze.
2.2. Colture cellulari
Gli esperimenti di questo laioro sono stati condoti i n u na l inea c ellulare d i neuroblastoma di tipo (SH-SY5Y) (Biedler, Helson et al. 1973).
2.2.1 Condizioni di crescita
Le cellule SH-SY5Y di neuroblastoma umano iengono cresciute in DMEM arricchito con 10% SBS, 100 IU/ml penicillina, 100 µg/ml streptomicina e 2.5 µg/ml amfotericina B, e mantenute ad una temperatura di 37°C in unoatmosfera satura di umidità contente 95% aria/5% CO2.
Le cellule SH-SY5Y iengono coltiiano in piastre Corning® da 10 cm di diametro. Raggiunta la confuenza, iengono laiate con un tampone fosfato 10 mM a pH 7,2-7,4 contenente 150 mM di NaCl (PBS), in modo da eliminare loeccesso di terreno di coltura rimasto nella piastra; iengono aggiunti successiiamente 900 μl di tripsina 0,5% -EDTA 0,2%, dopodiché la piastra iiene messa a 37°C per 5 minuti in modo da staccare le cellule adese al fondo e separare gli eientuali contati intercellulari; una iolta che le cellule, osseriate al microscopio otico, risultano ben separate, si aggiunge terreno di
coltura completo in modo da bloccare loazione della tripsina; le cellule iengono risospese e contate. In base agli esperimenti da efetuare, le cellule iengono seminate in piastre da 10 cm di diametro (6 x106 cellule in 8 ml di terreno), o in piastre da 96 pozzeti ( 15000 c ellule/pozzeto i n 1 0 0 μ l d i t e rreno). I l g i orno d o po, l e c e llule iengono tratate con le sostanze richieste dalloesperimento.
2.2.2. Congelamento-scongelamento
Per congelare le cellule è necessario preparare un terreno di congelamento costituito da SBS (50%), DMEM (40%) e DMSO (10%). Le cellule a confuenza, staccate dalla piastra con la tripsina, iengono centrifugate a 300 g per 6 minuti a 4°C; scartato il sopranatante, le cellule si risospendono nel terreno di congelamento preparato poco prima. La sospensione iiene aliquotata in iale da congelamento (1 piastra da 10 cm di diametro per ml); le iale i engono p oste a - 80°C e d opo 2 4 o re p ossono e ssere trasferite nei contenitori per loazoto liquido.
Per scongelare le cellule, le iale sono preleiate dal congelatore o dal contenitore per loazoto liquido e messe in un bagneto termostatico a 37°C per qualche minuto, in modo che lo scongelamento sia rapido ed uniforme. A questo punto la sospensione delle cellule è messa in una proieta contenente 5 ml di DMEM, che ierrà centrifugata a 1200 g per 6 minuti a temperatura ambiente. Il pellet otenuto i iene s ospeso nuoiamente in un iolume di terreno completo adeguato al supporto di crescita: 5 ml nel caso di una iasca da 25 cm2 oppure 8 ml nel caso ienga utilizzata una piastra di 10 cm di diametro.
2.3. Saggio dell’MTT
Tale saggio serie per ialutare la iitalità delle cellule coltiiate in determinate condizioni. Le cellule iiie, infati, sono in grado di ridurre chimicamente il colorante il composto MTT, un sale di tetrazolio solubile in acqua, il quale diiiene un sale di formazano insolubile in acqua e di color iioleto (Mosmann 1983; Hansen, Nielsen et al. 1989; Liu, Peterson et al. 1997; Liu and Schubert 1997).
Il tratamento d elle c ellule è e seguito i n m aniera t ale d a a iere 6 p ozzeti p e r condizione sperimentale, con una densità di 15000 cellule per pozzeto al momento della semina. Dopo loincubazione a tempi diiersi con AICA riboside, metformina o composto C, al mezzo di coltura iiene aggiunto loMTT (concentrazione inale di 0.5 mg/ml) e la piastra iiene posta di nuoio a 37°C. Dopo mezzoora si elimina dai pozzeti il terreno, aspirandolo delicatamente con una pipeta m ulticanale. D opo e ssersi accertati che non siano rimaste tracce di soluzione nei pozzeti, si aggiungono 100 µl di DMSO a ciascuno di essi (Taiarini, Colombaioni et al. 2000) e si agita la piastra per 10 min a temperatura ambiente allo scopo di sciogliere i cristalli del sale di formazano. Se le cellule sono metabolicamente iitali, efetuando q u indi l a r i duzione d e l M T T, quando iiene aggiunto il DMSO si osseria la formazione di un colore iioleto. La iitalità è quantiicata m ediante l a l etura d e lloassorbanza t r amite u n l e tore di piastre ELISA, ad una lunghezza doonda di 570 nm, usando come riferimento loassorbanza a 650 nm. Ogni esperimento è stato ripetuto almeno 3 iolte ed i dati sono
espressi come percentuale rispeto a l c ontrollo ( pozzeti c o ltiiati s e nza l o AICA riboside, metformina o composto C per il tempo indicato negli esperimenti) in cui la capacità di riduzione del MTT è stata considerata il 100% di iitalità.
2.4. Caraterizzazione di aaoatosi
Cellule (15,000 cellule/pozzeto) s ono s tate c resciute s u p iastre d a 9 6 p ozzeti e d incubate in presenza o assenza di AICA riboside o metformina. La retrazione dei neuriti e la diminuzione del iolume cellulare sono stati iisualizzati al microscopio a contrasto di fase. Cellule sono state issate con 2% paraformaldeide in 0.1 M di bufer fosfato salino pH 7,4 (PBS) per 30 minuti a temperatura ambiente, dopodiché iengono laiate con PBS. Inseguito le cellule iengono tratate con Hoechst 33258 1 µg/ml in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente, e laiate con PBS. I nuclei delle cellule SH-SY5Y cresciute normalmente mostrano una fuorescenza difusa. Per eiidenziare i nuclei frammentati e/o condensati è stato utilizzato il microscopio a fuorescenza iniertito Zeiss (Axioiert 35), utilizzando una eccitazione a 340-380 nm con un iltro d i emissione a banda lunga a 430 nm. Per quantiicare loapoptosi è stato utilizzato un obietiio 40x; Le immagini sono state acquisite presso il laboratorio della Dot.ssa Colombaioni Istituto di Neuroisiologia d el C NR ( Pisa), c on una t elecamera C CD proiiista di un sensore KAS 400 Kodak fornita da D.T.A. (Pisa). L'osseriatore non conosceia il tratamento efetuato in ogni pozzeto.
2.5. Preaarazione degli estrati citosolici
Per rileiare il rilascio di citocromo c, la presenza di caspasi-9 o AMPK fosforilata le cellule sono solubilizzate nei modi descriti di seguito.
2.5.1.
Citocromo c
Allo scadere del tempo preiisto dal tratamento, iiene eliminato il terreno di coltura dalla piastra. Dopo due laiaggi con PBS (4-5ml) le cellule iengono staccate con un apposito rastrello, si raccolgono in una eppendorf e si centrifuga per 6 minuti a 300 giri a 4 °C. Dopodiché si toglie il sopranatante e si sospende il pellet in 36 μl di lisi senza digitonina, si aggiungono 4 μl di digitonina 0.1% e si incubano per 10 minuti a 4 °C; allo scadere del tempo, i campioni iengono centrifugati a 800 giri per 12 minuti a 4 °C; il soiranatante iiene delicatamente aspirato, posto in una nuoia eppendorf e centrifugato a 12.000 giri per 10 min. a 4 °C.
Bufer di lisi: 250 mM saccarosio, 1.5 mM EGTA, 1.5 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 25 mM Tris-HCl pH 6.8, digitonina 0.01%, 1 mM DTT,ed inibitori delle proteasi (1 mM benzamidina, 0.1 mM PMSS, 2.5 µg/ml leupeptina, 2.5 µg/ml di inibitore della tripsina, 2.5 µg/ml pepstatina A) (Giannecchini, D'Innocenzo et al. 2003)
2.5.2. Casaasi-9
Dopo due laiaggi e centrifugazione come descrito sopra, le cellule sono sospese in 1 iolume di tampone di lisi, congelate-scongelate tre iolte e centrifugate 14.000 g x 15 min a 4 °C.
Bufer di lisi: 50 mM Pipes/NaOH pH 6.5, 2 mM EDTA, 0,1% CHAPS, 1 mM DTT ed inibitori delle proteasi: 0,1 mM PMSS, 1 mM benzamidina, 2,5 µg/ml leupeptina, 2,5
µg/ml inibitore della tripsina, 2,5 µg/ml pepstatina A.
2.5.3. AMPK-P
Le cellule iengono laiate per due iolte con PBS (4-5ml) e una iolta con un tampone di lisi senza Triton prima di aggiungere il tampone di lisi sotodescrito. L e c e llule iengono staccate dalla piastra di coltura con un apposito rastrello, raccolte in una eppendorf e centrifugate per 3 minuti a 13.000 g a 4 °C. Il soiranatante così otenuto iiene diiiso in aliquote contenenti 20 μl di ogni campione ai quali iengono aggiunti 5 μl di Sample Bufer 5x contenente PMSS.
Bufer d i l isi: 2 50 m M m annitolo, 5 0 m M Tris H Cl, p H 7 ,4, 5 0 m M N aS,1 m M EGTA,1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM pirofosfato sodico, 1 mM DTT e inibitori delle proteasi: 0.1 mM PMSS, 0.1 mM benzamidina, 5 µg/ml inibitore della tripsina.
2.6. Misurazione delle aroteine.
Allo scopo di caricare le stesse quantità di proteine in ogni pozzeto del gel la concentrazione delle proteine contenute negli estrati citosolici è stato utilizzato il metodo di Bradford (Bradford 1976).
2.7. SDS-PAGE ed immunobloting
2.7.1. Comaosizione dei gel eletroooretici
I gel di eletroforesi di 0,75 mm di spessore sono stati formati facendo polimerizzare le soluzioni di 15% acrilammide per rileiare il citocromo c e la caspasi-9 (pesi
molecolari ~14 e ~29 kDa rispetiiamente) e al 12% per AMPK(~64 kDa).
15% in acrilammide: 1.1 ml di H2O distillata; 2,5 ml di acrilammide; 1,3 ml di TRIS-HCl pH 8,8 1,5 M; 50 μl di APS 10% ; 2μl TEMED).
12% in acrilammide: 1.6 ml di H2O distillata; 2 ml di una soluzione di acrilammide, composta da 30% acrilammide e 0,8% bisacrilammide; 1,3 ml di TRIS-HCl pH 8,8 1,5 M; 50 μl di APS 10%; 2μl TEMED.
Ad ogni gel, ben polimerizzato, iiene aggiunto lo Stacking Gel in cui iengono modellati dei pozzeti del iolume di 25 μl con loausilio di un petinino. In ciascuno di tali pozzeti iengono caricati i campioni proteici da separare.
Stacking Gel: 550 μl di H2O distillata; 170 μl di acrilammide 30%; 260 μl di TRIS-HCl pH 6,8 0,5 M; 10 μl di APS 10%; 2μl TEMED) rispeto al gel di separazione, è la parte del gel.
2.7.2. Seaarazione eletroooretica e trasoerimento
La separazione delle proteine, atraierso i l g el d i a crilammide ( sopra d escrito), preiede che queste abbiano tute carica negatiia. In questo modo si spostano iengono atrate t u te da l po l o po s itiio e l o u nica co s a in cu i di f eriscono è l a l or o dimensione. Per otenere u na c arica n egatiia o mogenea i engono a ggiunti, p er ciascun campione, 5 μl di Sample Bufer 5x. Loapposita camereta iiene riempita di electrode bufer (3 g di TRIS, 1 g SDS e 14,14 g di glicina per litro di soluzione), dopodiché iiene fata p assare u na c orrente d i 2 00 P a traierso g l i e l etrodi. A l termine della separazione (circa 45 min), il gel iiene estrato dai ietri. Sia gel che membrana PPDS iengono equilibrati nel Bloting Bufer (3 g di TRIS, 14,14 g glicina e 20% metanolo per litro di soluzione) prima del trasferimento che iiene condoto a 90
P per 60 min.
Sample Bufer 1x: 0,0625 M TRIS pH 6,8, 2% SDS, 5% b-mercaptoetanolo, 10% glicerolo, 0,02% di Blu di Bromofenolo.
2.7.3. Immunobloting
2.7.3.1. Citocromo c
In seguito al trasferimento, la membrana iiene prima sotoposta a laiaggi, (tre per dieci minuti ciascuno) con PBS - 0.05% Tween 20. Successiiamente iengono bloccati tuti i s iti d i l egame c he p ossono i nterferire c ol s uccessiio l egame d elloanticorpo speciico per il citocromo c, con una soluzione contenente late scremato al 3% (in PBS – 0,05% Tween 20) ad una temperatura di 4 °C, per tuta la note.
Loindomani, dopo tre laiaggi di dieci minuti ciascuno con PBS – 0,05% Tween 20, la membrana iiene incubata con loanticorpo primario diluito 1:2000 in una soluzione contenente il 1% late scremato in PBS - 0.05% Tween 20 per 2 ore a temperatura ambiente. Dopodiché, la membrana iiene di nuoio laiata e sotoposta alloincubazione con loanticorpo secondario coniugato con la perossidasi di rafano, diluito 1:500 in una soluzione contenente il 1% late scremato in PBS - 0.05% Tween 20.
2.7.3.2. Casaasi-9
In seguito al trasferimento, la membrana iiene laiata tre iolte per dieci minuti con PBS – 0,1% Tween 20, e successiiamente bloccata con late scremato al 5% in PBS-0.1% Tween 20 a temperatura ambiente, per 1 ora. Dopo tre laiaggi come sopra iiene sotoposta a incubazione per 4 ore a temperatura ambiente con loanticorpo primario, in grado di riconoscere la caspasi-9, diluito 1:500 in 5% late s cremato-PBS–0,1% Tween 20. Dopodiché, la membrana iiene di nuoio laiata tre iolte ed incubata con anticorpo secondario, diluito 1:2000 in 3% late s cremato-PBS–0,1% Tween 2 0 a temperatura ambiente.
2.7.3.3. AMPK oosoorilata
La membrana iiene laiata, come per la caspasi-9, e successiiamente bloccata per 1 ora con late scremato al 5% in PBS-0.1% Tween 20 a temperatura ambiente.
Dopo tre laiaggi, di dieci minuti ciascuno con PBS-0.1% Tween 20, iiene incubata con loanticorpo anti-AMPK fosforilata diluito 1:400 in 5% di BSA-PBS-0.1% Tween 20, per tuta l a n ote a d un a t e mperatura d i 4 ° C . D o po t r e l a iaggi i i ene s o toposta ad
unoora doincubazione con anticorpo secondario, diluito 1:2000 in 3% late scremato-PBS-0.1% Tween 20, a temperatura ambiente.
2.8. Chemiluminescenza
Dopo loincubazione con loanticorpo secondario, le membrane iengono nuoiamente laiate con PBS-0,1%Tween 20; le bande proteiche iengono rileiate mediante chemioluminescenza utilizzando il Kit Super Signal West Pico Chemioluminescent Substrate. In particolare, le membrane iengono tratate a l b uio c on 3 m l d i u na soluzione fata con il 50% H2O2 e 50% di luminolo.
La perossidasi legata alloanticorpo secondario reagisce con loH2O2 ed il luminolo libera un fotone per ogni sito di reazione; i fotoni liberati andranno ad impressionare una lastra autoradiograica posta sulle membrana.
Le lastre iengono siiluppate per il tempo necessario e issate per circa 5 min.
2.9. Analisi statistica
I dati sono espressi come media ± errore standard della media (SEM). La signiicatiiità è stata c alcolata m ediante i l t est d i M ann-Whitnee: p p0,001; pp0,01; pp0,05.
