1.1 - IL CUORE: ACCENNI DI ANATOMIA E FISIOLOGIA 4

SOMMARIO

1 – INTRODUZIONE 4

1.1 - IL CUORE: ACCENNI DI ANATOMIA E FISIOLOGIA 4

1.1.1 - INFARTO MIOCARDICO 10

1.1.2 – RIPRISTINO DEL FLUSSO EMATICO E DANNO DA

IPOSSIA-RIPERFUSIONE 14

1.1.3 – CARDIOPROTEZIONE 20

1.1.3.1 – PRECONDIZIONAMENTO MIOCARDICO (IPC) 20

1.1.3.1.1 – EARLY IPC 21

1.1.3.1.1.1 – FASE PRE-ISCHEMICA 21

1.1.3.1.1.2 – FASE POST-ISCHEMICA 23

1.1.3.1.2 – LATE IPC 23

1.1.3.1.3 –LIMITAZIONI IPC 24

1.1.3.2 – PEPTIDI NATRIURETICI ED ENDOTELINA 25

1.1.3.3 – UROTENSINA II 29

1.1.3.3.1 – RUOLO DELL’UT II NELLE PATOLOGIE CARDIOVASCOLARI 32

1.2 – INGEGNERIA TISSUTALE 35

1.2.1 - INGEGNERIA TISSUTALE CARDIACA 37

1.2.1.1 - BIOMATERIALI USATI PER LA REALIZZAZIONE DI SCAFFOLDS

CARDIACI 39

1.2.1.1.1 - POLIMERI NATURALI 40

1.2.1.1.2 - POLIMERI SINTETICI 42

1.2.1.2 - TIPOLOGIE DI SCAFFOLDS CARDIACI 45 1.2.1.3 - SOSTANZE INDUCENTI FORMAZIONE DEL TESSUTO 50

1.3 – S2PR SYSTEM 52

1.3.1 – INTRODUZIONE 52

1.3.2 - L’IMPORTANZA DEGLI STIMOLI MECCANICI 53 1.3.3 - TIPOLOGIE DI BIOREATTORI PER L’INGEGNERIA TISSUTALE

CARDIOCIRCOLATORIA 54

1.3.4 – S2PR SYSTEM: STRUTTURA E FUNZIONE 61

1.3.5 – SET-UP SPERIMENTALE 66

2 – SCOPO DELLA TESI 68

3 – MATERIALI E METODI 69

3.1 – COLTURA CELLULARE 69 3.1.1 – PROTOCOLLO DI ESTRAZIONE DI CARDIOMIOCITI NEONATALI DI

RATTO 69

3.2 – STERILIZZAZIONE SCAFFOLDS 71

3.3 – SEMINA SU SCAFFOLDS E CONSERVAZIONE 71

3.4 – VITALITA’ 71

3.5 – STIMOLAZIONE MECCANICA IN S2PR 73

3.6 - IPOSSIA – RIPERFUSIONE 73

3.6.1 – STRUMENTAZIONE E FUNZIONAMENTO 73

3.6.2 - SELEZIONE DEI TERRENI E DEI TEMPI SPERIMENTALI 75

3.7 – DCFDA CELLULAR ROS DETECTION ASSAY 75

3.7.1 – PROTOCOLLO SPERIMENTALE 76

3.8 – SENESCENCE DETECTION KIT 77

3.8.1– PROTOCOLLO SPERIMENTALE 77

3.9 – RAT UROTENSIN II (UTII) ELISA KIT 78

3.9.1 – PROTOCOLLO SPERIMENTALE 78

3.10 – HYDROGEN PEROXIDE FLUORIMETRIC DETECTION KIT 79

3.10.1 - PROTOCOLLO SPERIMENTALE 79

3.11 – STUDI DI BIOLOGIA MOLECOLARE 80

3.11.1 - ESTRAZIONE DELL’ RNA TOTALE 80

3.11.2 – DETERMINAZIONE DELL’ RNA TOTALE 80

3.11.3– ANALISI DI REAL TIME PCR SEMIQUANTITATIVA 81 3.11.4 – SELEZIONE DEI GENI DI RIFERIMENTO E ANALISI STATISTICA DEI

DATI 83

4 - RISULTATI 85

4.1 - VITALITA’ CELLULARE SU SCAFFOLD 85

4.2 - BIOLOGIA MOLECOLARE 85

4.3 - VITALITA’ IN BIOREATTORE 88

4.4 - IPOSSIA-RIPERFUSIONE 89

4.5 - UROTENSINA (UT-II) 90

4.6 – STRESS OSSIDATIVO 92

4.6.1 – QUANTIFICAZIONE DI H

O

TRAMITE KIT FLUORIMETRICO 92 4.6.2 – VALUTAZIONE DELLA PRODUZIONE DI ROS TRAMITE ANALISI DI

MICROSCOPIA FLUORESCENTE 94

4.7 – VALUTAZIONE DELLA SENESCENZA CELLULARE 95

5 – DISCUSSIONE E CONCLUSIONI 96

6 – BIBLIOGRAFIA 99