DISCUSSIONE
Come appare evidente dalla letteratura, i microRNA giocano un ruolo di grande importanza nei fenomeni del differenziamento. Essi sono in grado di regolare a livello traduzionale l'espressione dei fattori che determinano il destino cellulare, consentendone una espressione differenziale precisa nello spazio e nel tempo senza bisogno di alterare i livelli di trascrizione. Sono inoltre capaci di mantenere “bloccati” gli RNA messaggeri per poi rilasciarli in breve tempo. Queste caratteristiche ne fanno uno strumento ideale per i processi differenziativi, che necessitano di una grande complessità e precisione nel “plasmare” l'espressione dei loro componenti.
Lo screening basato sull'ibridazione di arrays e sull'analisi bioinformatica ha permesso di analizzare buona parte dei miRNA attualmente annotati in Xenopus ed espressi nell'occhio. Mir- 129, mir-155, mir-222 e mir-214 sono miRNA espressi ad alti livelli e in modo specifico nella retina, la cui concentrazione diminuisce fortemente durante lo sviluppo in corrispondenza del differenziamento delle cellule bipolari e della sintesi dei prodotti proteici dei geni che lodirigono.
Inoltre, presentano dei bersagli predetti sul 3'UTR di tali geni e, se inattivati artificialmente, provocano un aumento sia della traduzione di questi ultimi che del numero di cellule bipolari (dati contenuti in Decembrini et Al, manoscritto in preparazione). E' quindi lecito ipotizzare che siano regolatori negativi del destino differenziativo bipolare .
In effetti, i risultati da me ottenuti attraverso le trasfezioni descritte in risultati indicano che questi miRNA sono in grado di mantenere inibiti almeno due dei geni chiave (otx2 e vsx1) che guidano il differenziamento delle cellule bipolari. Tali geni sono sufficienti, se lipofettati, a promuoverne il differenziamento.
In particolar modo 0tx2, pur se bersagliato da 3 dei 4 miRNA, pare subire l'inibizione maggiore.
Questo è in accordo col fatto che otx2 viene tradotto più tardivamente di vsx1 (Decembrini et al., 2006) in una sottopopolazione di cellule bipolari che sono gli ultimi neuroni a formarsi nella retina.
(Decembrini et al., 2006; Viczian et al., 2003)
E' necessario dire che i dati forniti dalle trasfezioni di sensori in cellule riceventi non sempre possono essere utilizzati adeguatamente per stimare la forza dell'azione dei miRNA a causa del loro elevato margine di errore. La trasfezione in linee riceventi, infatti, si è dimostrata soggetta a troppe variabili (efficienza della trasfezione, stato di confluenza delle cellule durante la coltivazione, contesto molecolare endogeno ecc...) dipendenti principalmente dal loro possedere già di per sé un livello elevato di espressione di miRNA, che può alterare le analisi.
Nonostante ciò, esperimenti di trasfezione degli stessi sensori in vivo direttamente in retine di Xenopus, compiuti in parallelo a quelli qui presentati, hanno confermato la capacità dei miRNA in
esame di agire direttamente su otx2 e vsx1 e, attraverso di essi, sul destino cellulare dei progenitori retinici (dati contenuti in Decembrini et Al, manoscritto in preparazione).
E' interessante notare come l'inattivazione dei 4 miRNA da noi individuati provochi una alterazione nel numero di cellule bipolari prodotte quantitativamente maggiore di quello provocato dalla sovraespressione di otx2 e vsx1 (dati contenuti in Decembrini et al, manoscritto in preparazione). Questo sembra indicare che essi possano agire regolando anche altri geni la cui funzione pro-differenziativa non è stata ancora descritta. Inoltre non è possibile escludere che alcuni dei miRNA abbiano effetti indiretti sulla traduzione di vsx1 e otx2. Questo potrebbe essere il caso di mir-214, che pur non avendo bersagli su otx2 (come indicato anche dal saggio di trasfezione), se bloccato provoca comunque un aumento della sua espressione. A questo proposito è noto che mir- 214 è in grado di agire sulla via di trasduzione del segnale di shh (Flynt et al., 2007), che abbiamo visto essere coinvolta nella regolazione del ciclo cellulare dei progenitori retinici.
Il punto importante che emerge dai dati di questa tesi,è l'individuazione di un subset di microRNA capaci di regolare il destino differenziativo verso specifici tipi cellulari all'interno di una struttura dallo sviluppo complesso come la retina attraverso una interazione diretta con geni homeobox. In letteratura sono noti pochi altri esempi di di studi in vivo sul coinvolgimento di miRNA in fenomeni differenziativi a livello cellulare, ad esempio nelle cellule del sistema immunitario (Turner & Vigorito, 2008; Fontana et al., 2007) o dello stesso sistema nervoso (Visvanathan et al., 2007),.Il contributo a mio parere più originale di questo lavoro è però lo studio della relazione tra i 4 miRNA e il ciclo cellulare.
I risultati dell'analisi del pattern di espressione spaziale (ibridazione in situ) e temporale (array e qRT-PCR) dei 4 miRNAs ci permettono di affermare che essi sono sostanzialmente più abbondanti in cellule progenitrici in attiva proliferazione, con una concentrazione via via decrescente nello sviluppo. La loro diminuzione segue un andamento che corrisponde da una parte all'allungamento del ciclo cellulare (inteso come l'intervallo tra due mitosi), rilevato tramite saggi di incorporazione di BRDU, e dall'altra all'attivazione dei geni differenziativi. Gli esperimenti con idrossiurea- afidicolina e ciclopamina ci hanno permesso di confermare che la variazione dei livelli di espressione dei 4 miRNA è in effetti dovuta, con ogni probabilità, ad un effetto della durata del ciclo, dal momento che trattamenti diretti specificamente sui suoi meccanismi sono in grado di mimare il livello di espressione caratteristico di uno stadio temporale differente, e di produrre fenotipi eterocronici (Decembrini et al., 2006; dati contenuti in Decembrini et al, manoscritto in preparazione).
Non siamo in grado di fornire una spiegazione precisa sul perchè i miRNA diminuiscano all'allungarsi del ciclo, anche se possiamo proporre delle ipotesi. Una possibilità è che i miRNA vengano prodotti in una sola fase del ciclo cellulare, e vengano in qualche modo degradati (ad esempio nei corpi P) nel resto dell'interfase e della mitosi. Se così fosse, l'allungamento del ciclo corrisponderebbe ad un aumento dell'intervallo tra due sintesi successive, e di conseguenza il livello di espressione tenderebbe a calare progressivamente, rimanendo costante solo nel caso in cui la proliferazione fosse sufficientemente rapida e uniforme.
Alcuni dei risultati da me ottenuti sembrano avvalorare questa ipotesi, e suggerire che la fase in cui avviene la produzione dei miRNA sia la fase S, in cui viene duplicato il patrimonio genetico della cellula. Infatti il trattamento con idrossiurea, che blocca le cellule proprio in fase S, aumenta di molto l'espressione dei 4 miRNA. Dato che le cellule trattate non proliferano, un simile risultato è possibile solo nel caso in cui esse siano bloccate proprio nella fase in cui i miRNA vengono prodotti.
Una implicazione di questo modello è che la fase S potrebbe essere considerata un “punto di non ritorno” per quanto riguarda l'espressione dei miRNA implicati nel differenziamento. Questo è molto interessante, dato che riporta alla mente alcuni dei classici studi di trapianto eterocronico di tessuto neurale effettuati nella corteccia di furetto (McConnell, 1988). Questi studi evidenziano che la fase S è la “soglia” oltre la quale un progenitore precoce trapiantato in un contesto tardivo non acquisisce il destino differenziativo del tessuto ospite, tuttavia non chiariscono i meccanismi molecolari alla base di questo fenomeno.
Il nostro modello, se si dimostrasse valido in tessuti diversi dalla retina, potrebbe contribuire a fornire questa spiegazione. Un progenitore neurale precoce, con ciclo breve, trapiantato in un ambiente saturo di segnali diretti a rallentarne la proliferazione, subirebbe un calo nella sua concentrazione endogena di miRNA (e di conseguenza attiverebbe geni specifici per destini differenziativi tardivi, inibiti da quegli stessi miRNA) solo se il trapianto avvenisse prima della fase S. In caso contrario la concentrazione dei miRNA, essendo già avvenuto il passaggio di sintesi, resterebbe alta (e il progenitore, se ricevesse lo stimolo a differenziare, lo farebbe seguendo un destino precoce).
Il modello da noi proposto, per quanto affascinante, resta comunque in larga parte da convalidare. Futuri studi dovranno da una parte individuare i promotori che regolano la trascrizione dei miRNA, per verificare che essi siano attivati da fattori collegati al ciclo (ad esempio uno dei fattori e2f, che si attivano proprio nella transizione tra la fase G1 e la fase S), e dall'altra studiare
l'espressione miRnomica in modelli animali e cellulari in cui il ciclo sia stato alterato o bloccato in fasi diverse dalla S (ad esempio in fase G1 o M) o in cui alcuni geni chiave (come retinoblastoma) siano stati inattivati per knock-down. Altri studi sarebbero necessari per identificare altri possibili bersagli dei miRNA da noi identificati, o per identificare nuovi miRNA coinvolti nel differenziamento di tipi cellulari diversi dalle cellule bipolari (ad esempio i fotorecettori).
In conclusione, il mio lavoro di tesi e i lavori compiuti in parallelo ad esso hanno dimostrato l'esistenza di un gruppo di miRNA sensibili al ciclo cellulare in grado di influenzare il differenziamento neuronale durante lo sviluppo della retina . Meccanismi simili potrebbero esistere in differenti sistemi dove il destino differenzitivo sia influenzato dal tempo di sviluppo, da segnali mitotici e dalla progressione del ciclo cellulare.. I dati raccolti permettono di ipotizzare che i miRNA, variando la loro espressione, agiscano come le lancette di un “orologio molecolare” in grado di tradurre il passare del tempo nell'attivazione cronologicamente regolata di una serie di programmi differenziativi guidati da geni specifici. “Orologi molecolari” di questo tipo permetterebbero la formazione della complessità strutturale necessaria alle esigenze di elaborazione e integrazione dell'occhio e del sistema nervoso in genere.
