OGM: STUDIO DEI COSTRUTTI T
OGM: STUDIO DEI COSTRUTTI T
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NOS E CTP2
NOS E CTP2
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CP4EPSPS NELLA MESSA A PUNTO E VALIDAZIONE
CP4EPSPS NELLA MESSA A PUNTO E VALIDAZIONE
DI UN SISTEMA PCR REAL TIME MULTI
DI UN SISTEMA PCR REAL TIME MULTI
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SCREENING
SCREENING
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Stampato a cura dell'Unità Operativa di Supporto Biblioteca, Informazione, Editoria (2012).
Curcio L.*, Pierboni E., Madeo L., Tovo G., Rondini C.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche
INTRODUZIONE
INTRODUZIONE
MATERIALI E METODI
RISULTATI E DISCUSSIONE
Messa a punto metodoL’ottimizzazione della concentrazione dei primers (2) per il CTP2-CP4EPSPS si è ottenuta testando tre diverse concentrazioni di primers combinate tra loro (150, 300, 900 nM), mentre l’ottimizzazione dei primers (8) per il T-NOS si è ottenuta testando 5 concentrazioni diverse combinate tra loro da 600nM a 1000nM, per un totale di 22 combinazioni. L’ottimizzazione della concentrazione delle probes si è ottenuta testando in quadruplice copia diverse concentrazioni crescenti: 50, 100, 150, 200, 250, 300 nM per il T-NOS; 100, 150, 200, 250 e 300 nM per
il CTP2-CP4EPSPS. Metodi PCR Real-Time
Tutte le prove sono state ottimizzate su piattaforma Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System in modalità standard, utilizzando una concentrazione 1x di TaqMan® Universal PCR Master Mix in un volume finale di 20 µL. Il profilo di amplificazione adottato è:
stage 1 a 50°C per 2 minuti, stage 2 a 95°C per 10, stage 3 composto da uno step a 95°C di 15 secondi ed un secondo step a 60°C per 1
minuto, ripetuto per 50 cicli (4). Validazione di Fast PCR Real-Time
Per la validazione del metodo si sono testati: la sensibilità, la specificità, la robustezza e il LOD.
33,5 34 34,5 35 35,5 36 36,5 37 37,5 media Ct 6 0 0 F /6 0 0 R 7 0 0 F /6 0 0 R 8 0 0 F /6 0 0 R 9 0 0 F /6 0 0 R 1 0 0 0 F /6 0 0 6 0 0 F /7 0 0 R 8 0 0 F /7 0 0 R 9 0 0 F /7 0 0 R 1 0 0 0 F /7 0 0 6 0 0 F /8 0 0 R 8 0 0 F /8 0 0 R 9 0 0 F /8 0 0 R 6 0 0 F /9 0 0 R 7 0 0 F /9 0 0 R 8 0 0 F /9 0 0 R 9 0 0 F /9 0 0 R 1 0 0 0 F /9 0 0 6 0 0 F /1 0 0 0 7 0 0 F /1 0 0 0 8 0 0 F /1 0 0 0 9 0 0 F /1 0 0 0 1 0 0 0 F /1 0 0 0
Ottimizzazione primers T-NOS
35,2 35,3 35,4 35,5 35,6 35,7 35,8 35,9 36 me dia Ct 50 nM 100 nM 150nM 200 nM 250 nM 300 nM
conce ntra zione probe
Ottimizzazione probeT -NOS
33,00 33,20 33,40 33,60 33,80 34,00 34,20 34,40 34,60 media Ct 150F /15 0R 300F /15 0R 900F /15 0R 150F /30 0R 300F /30 0R 900F /30 0R 150F /90 0R 300F /90 0R 900F /90 0R concentrazione primers
Ottimizzazione primers CTP2-CP4EPSPS
32,60 32,80 33,00 33,20 33,40 33,60 33,80 34,00 media Ct 100 nM 150 nM 200 nM 250 nM 300 nM concentrazione probe
Ottimizzazione probe CTP2-CP4EPSPS
I risultati ottenuti dall’ottimizzazione della concentrazione dei primers e delle probes per ogni singolo target sono mostrati di seguito. A parità di
quantità di DNA bersaglio utilizzata, la combinazione migliore è stata individuata in base al Ct più basso, un basso scarto tipo ed un alto ∆Rn.
4
37,37
4
37,03
4
37,25
2
38,04
2
37,66
2
38,03
0
10
20
30
40
P 35S NPTII PAT CP4-EPSPS CTP2-CP4EPSPS T-NOSValori LOD e m edia Ct
LOD n° copie
media Ct
Grazie al sistema multi-screening, si è in grado di rilevare sia OGM autorizzati dei quali è possibile eseguire tipizzazione e quantificazione, che possibili eventi non autorizzati (UGM). Nell’ambito della messa a punto e validazione di un metodo multi-screening, per gli elementi genetici T-NOS (terminatore nopalina sintasi) e CTP2-CP4EPSPS (peptide di transito dei cloroplasti-CP4EPSPS) sono state prese in esame sequenze di primers e sonde diverse rispetto a quelle utilizzate sinora (1, 7) che permettessero: per il T-NOS di allestire la PCR con le stesse
modalità operative già impiegate nel multi-screening (8); per il CTP2-CP4EPSPS di evitare dei falsi negativi (2).
Il LOD ottenuto per i nuovi target e gli altri elementi genetici del multi-screening sono mostrati di seguito. I parametri di specificità e sensibilità, così come quelli della robustezza, rientrano nei criteri di accettabilità (dati non mostrati).
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
1) Alexander TW, et al. J. of Biot 112:255-266 (2004). “Use of quantitative real time and conventional PCR to assess the stability of the cp4 epsps transgene from Roundup Ready® canola in the intestinal, ruminal, and fecal contents of sheep”
2) Grhomann L. et al. J Agric Food Chem. 57:8913-8920 (2009). “Collaborative trial validation studies of real-time PCR based GMO screening methods for detection of the bar gene and the ctp2-cp4epsps construct”.
3) ISO 21571:2005.
4) Real-Time PCR Systems, Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System and 733/7500 Real-Time PCR Systems “Chemistry Guide”.
5) UNI EN ISO 21570:2006.
6) Verification of analytical methods for GMO testing when complementing interlaboratory validated methods, ENGL 2011 (ISBN 978-92-79-19925-7).
7) Waiblinger H.U. et al. Anal Bioanal Chem (2009). “A pratical approach to screen for authorised and unauthorised genetically modified plants”.
8) Waiblinger H.U. et al.- Eur Food Res Technol. 226:1221-1228 (2008). “Validation and collaborative study of a P35S and T-nos duplex real-time PCR screening method to detect genetically modified organisms in food products”.
*Ricerca Corrente MINSAL IZSUM 2010 - Ampliamento ed evoluzione della filiera analitica relativa agli OGM: messa a punto e validazione di prove in Fast PCR Real-Time per la rilevazione e la quantificazione di organismi transgenici non ancora e/o recentemente approvati in Europa.
