tuttavia, l’infezione non è assolutamente limitata solo alla popolazione ad elevato rischio.

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1 Riassunto

L’herpes genitale è un’infezione che persiste per tutta la vita ed è causa della comparsa di lesioni genitali estremamente dolorose e ricorrenti, di complicazioni a livello sistemico, di morbidità psico-sociale e di complicazioni serie nei neonati da madri infette, che, anche se rare, possono portare ad handicap neurologici persistenti e a morte. Inoltre è stato dimostrato che l’herpes genitale incrementa il rischio di contrarre altre infezioni sessualmente trasmesse come ad esempio quella dovuta al virus dell’immunodeficienza umana (HIV). La principale causa di herpes genitale è il virus herpes simplex (HSV)-2, tuttavia una proporzione sempre crescente di episodi primari è dovuta ad HSV-1. La trasmissione di HSV per via genitale è solitamente dovuta alla liberazione del virus da parte di individui che non sono a conoscenza di essere infetti o ai quali i test clinici hanno fallito nel diagnosticare l’infezione. La prevalenza dell’herpes genitale aumenta non solo con l’età e con il numero di partner sessuali, ma anche in particolari gruppi etnici e socio-economici;

tuttavia, l’infezione non è assolutamente limitata solo alla popolazione ad elevato rischio.

Gli agenti antivirali, come ad esempio l’aciclovir, possono ridurre la severità della malattia, prevenire le ricorrenze e limitare il periodo in cui il virus viene liberato, ma attualmente non esistono misure di controllo di popolazione efficaci come ad esempio un vaccino.

Un vaccino ideale dovrebbe essere in grado di eradicare, eliminare o contenere l’agente infettivo; un vaccino preventivo contro HSV non solo dovrebbe prevenire l’infezione genitale primaria, ma dovrebbe ridurre o limitare il rischio di infezione a livello del sistema nervoso.

Sulla base di queste conoscenze, abbiamo sviluppato una strategia vaccinale che si basa

sull’utilizzo di un vettore lentivirale derivato dal virus dell’immunodeficienza felina e

codificante per la glicoproteina B di HSV-1 come immunogeno (LAW-gB1). Questo gene è

stato scelto per la sua capacità di indurre una immunità crociata contro HSV-1 e HSV-2 sia

di tipo umorale che cellulare e per la sua spiccata abilità nello stimolare una risposta di tipo

cellulo-mediata, che sembra essere di fondamentale importanza nel contenere l’infezione

erpetica.

Pagina | 7 Per massimizzare ed ampliare l’efficienza di trasduzione, LAW-gB1 è stato prodotto e pseudotipizzato con diversi envelope, ed inizialmente caratterizzato in vitro su diversi tipi cellulari per valutare lo spettro di traduzione e la durata di espressione del transgene. LAW- gB1 è stato poi inoculato in topi C57BL/6 e testato per la sua capacità di indurre sia una risposta umorale che cellulo-mediata verso l’antigene vaccinale. La vaccinazione ha indotto, nella milza, nei linfonodi inguinali e nel midollo osseo, linfociti T CD8

specifici che risultavano assenti nei topi di controllo inoculati con il vettore vuoto. Inoltre, la risposta immunitaria specifica si è dimostrata durevole ed è anche incrementata con il susseguirsi degli inoculi. Anche la risposta umorale si è mantenuta a titoli elevati per tutta la durata del protocollo di immunizzazione.

Il passo successivo è stata la valutazione della protezione, in seguito ad un challenge intravaginale, contro dei ceppi virulenti di HSV-1 e di HSV-2, quest’ultimo somministrato anche ad una dose elevata. Questi studi hanno dimostrato che LAW-gB1 è capace di indurre elevati livelli di protezione nei confronti di entrambi i virus.

Inoltre, gli animali vaccinati che, in seguito al challenge, non presentavano virus nel tampone vaginale, non avevano sviluppato anticorpi contro HSV ed avevano resistito all’infezione, non hanno nemmeno mostrato alcun segno di herpes genitale dopo la somministrazione di una dose elevata di ciclofosfamide che ha depletato più dell’80% dei linfociti circolanti ed è stata in grado di riattivare l’infezione negli animali di controllo mock- vaccinati e naïve, dimostrando così l’assenza di virus latente a livello del sistema nervoso.

Per concludere, è stato anche effettuato un protocollo di immunizzazione nel quale è stato combinato l’utilizzo del vettore LAW-gB1 con un vettore ricombinante derivato dal virus vaccinico modificato Ankara (MVA) e codificante la stessa gB1; anche in questo protocollo, il vaccino si è dimostrato altrettanto promettente

Questi risultati hanno dimostrato come lo sviluppo di strategie profilattiche contro

l’herpes genitale sia una strada percorribile e che il vettore LAW-gB1 ha tutte le

potenzialità per essere un buon candidato vaccinale.

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2 Abstract

Genital herpes is a life-long infection that may result in extremely painful and recurrent genital lesions, systemic complications, serious psychosocial morbidity, and rare but serious outcomes in neonates born to infected women, including permanent neurological handicap and death, moreover it has been shown to increase the risk of human immunodeficiency virus (HIV) acquisition. Herpes simplex virus (HSV)-2 is the principal cause, with an increasing proportion of first-episode disease caused by HSV-1. Genital HSV transmission is usually due to asymptomatic viral shedding by people who are unaware that they are infected and clinical screening fails to detect most infections. Genital herpes prevalence increases not only with age and number of sexual partners but also in specific ethnic and low socioeconomic groups. However, infection is not only restricted to high-risk populations. Antiviral agents, such as acyclovir, can reduce disease severity, prevent recurrences and shorten periods of viral shedding, but currently there are no effective population control measures such as a vaccine. An ideal candidate vaccine should act by eradicating, eliminating or containing the infectious agent; an HSV preventive vaccine should not only prevent acute primary genital herpes disease but should also reduce or eliminate the risk of infection of the central nervous system.

From this standpoint, we have pursued a vaccinal strategy based on a lentiviral vector derived from the feline immunodeficiency virus and delivering the HSV-1 glycoprotein B as immunogen (LAW-gB1). This gene has been chosen for its ability to induce cross-reacting HSV-1 and HSV-2 humoral and cellular immunity and to trigger strong cell-mediated immune responses, shown to be important to contain herpetic infections.

To maximize and broaden efficiency of transduction, LAW-gB1 was produced and

pseudotyped with different envelopes, and first characterized in vitro for spectrum of

transduction and duration of transgene expression in several cell types. LAW-gB1 was then

inoculated into C57BL/6 mice and tested for ability to elicit both humoral and cell-

mediated immune responses. Vaccination induced, in spleen, inguinal lymph nodes and

bone marrow, gB1-specific CD8

lymphocytes that were absent in control mice inoculated

with an empty vector. Furthermore, the specific immune response was long-lasting and

Pagina | 9 increased over time. Also humoral response was maintained at high titers during all the immunization period.

The next step was the evaluation of protection conferred against a fully virulent HSV-1 or HSV-2, also at a very high dose, after an intravaginal challenge, these studies demonstrated that LAW-gB1 was able to induce high levels of protection against both viruses.

Moreover, vaccinated animals that showed neither virus in vagina nor antibodies against HSV and that resisted challenge did not develop any sign of disease upon high dose cyclophosphamide treatment that depleted over 80% of circulating leukocytes and promptly reactivated HSV infection in mock vaccinated and naïve controls, thus demonstrating the absence of latent infection in vaccinated mice.

Finally, an immunization protocol that include also the use of a recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA)-based vaccine expressing gB1 in association with LAW-gB1 was successfully tested.

These results demonstrate that the development of prophylactic measures against

genital herpes is feasible and that LAW-gB1 has the potential for a good vaccine candidate.