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5. DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
Mediante l’utilizzo dei microarrays sono stati individuati 44 geni specifici dei neoblasti, la cosiddetta Neoblast signature; uno di questi geni è omologo a geni appartenenti alla famiglia delle proteine associate al retinoblastoma (Rossi et al., 2007). Il gene completo, isolato durante questo lavoro di Tesi, è stato denominato DjRbAp48 e l’analisi della sequenza ha mostrato una significativa omologia a livello amminoacidico, di questo gene, con gli altri i membri RbAp di questa famiglia proteica.
I dati ottenuti da esperimenti di ibridazione in situ confermano che DjRbAp48 è un marcatore di neoblasti: questo gene ha un pattern di espressione simile a quello del marcatore molecolare di neoblasti DjMCM2 (Salvetti et al., 2000); in particolare, DjRbAp48 è espresso a livello dei neoblasti sparsi nel parenchima, in quelli accumulati lungo la linea mediana dorsale e nei clusters dorsali laterali.
Nel corso della rigenerazione, dopo la chiusura della ferita, le cellule staminali proliferano, migrano e si accumulano formando un blastema rigenerativo; la progenie di neoblasti che si trova nel blastema va incontro a differenziamento e va a formare le parti mancanti del corpo della planaria. Gli animali, in cui l’espressione di DjRbAp48 è stata ridotta, non sono in grado di formare il blastema, come avviene negli animali trattati con raggi X in cui i neoblasti sono distrutti come conseguenza dell’irraggiamento. Tuttavia, la perdita dei neoblasti non è la causa primaria del fallimento della rigenerazione in questi animali. Infatti, i neoblasti di animali sottoposti a RNAi, rispondono
67 al taglio proliferando e accumulandosi al di sotto dell’epitelio della ferita, ma non sono capaci di generare un blastema funzionale.
Un’osservazione interessante è che gli animali trattati con dsDjRbAp48 hanno un numero di cellule apoptotiche maggiore rispetto ai controlli. In particolare, l’analisi al TEM ha evidenziato la presenza di clusters di cellule apoptotiche con un alto rapporto nucleo/citoplasma, al di sotto dell’epitelio della ferita in una regione corrispondente a quella dove si forma il blastema negli animali di controllo. Inoltre l’analisi al TEM, dimostra che queste cellule apoptotiche hanno incorporato BrdU. Quindi, poichè i neoblasti sono le uniche cellule proliferanti in planaria, si può ipotizzare che questi clusters di cellule apoptotiche siano la progenie dei neoblasti proliferanti presenti nel post- blastema che, dopo aver smesso di proliferare, migrano nella regione soprastante e infine muoiono per apoptosi.
Sulla base di queste osservazioni, si può concludere che DjRbAp48 non è coinvolto nel mantenimento dei neoblasti, ma potrebbe essere necessario per il differenziamento della progenie dei neoblasti. Un possibile ruolo di DjRbAp48 in questo contesto, è supportato anche dall’evidenza che questo gene è espresso nella regione del blastema di animali rigeneranti wild-type. L’ipotesi è che negli animali trattati con dsDjRbAp48, i neoblasti siano attivati dal taglio, quindi proliferino, ma non riescano ad andare incontro al differenziamento, e quindi muoiano per apoptosi; giunge infine la morte dell’animale perchè i neoblasti rimanenti, nonostante continuino a proliferare per cercare di produrre un blastema, non riescono a formarlo e di conseguenza non vengono rigenerate le parti mancanti dell’animale, né rimpiazzate le cellule perse durante il fisiologico turnover cellulare. L’ipotesi che DjRbAp48 non sia coinvolto nel mantenimento dei neoblasti, è confermata da evidenze sperimentali in cui animali rigeneranti sottoposti a interferenza genica per un gene, DjPum, che è coinvolto nel mantenimento dei neoblasti, non presentano i neoblasti accumulati al di sotto dell’epitelio della ferita (Salvetti et al., 2005). Un’altra conferma di quanto ipotizzato è data da esperimenti in cui l’RNAi di un altro gene, Smed-bruli, necessario per il mantenimento delle cellule staminali, causa la perdita completa dei neoblasti (Guo et al., 2006).
68 Questa ipotesi è supportata anche dai risultati ottenuti da studi sugli animali intatti. Sebbene gli animali, iniettati con dsDjRbAp48, mostrino un fenotipo tipico di animali irradiati, un numero significativo di neoblasti è ancora presente in queste planarie, anche in animali che mostrano regressione della testa, come indica l’espressione dei marcatori molecolari di neoblasti DjMCM2, DjPiwi-1, Djnos e la conta dei neoblasti in fase M e S.
Sebbene non sia possibile stabilire un gradiente antero-posteriore nell’espressione di DjMCM2, i neoblasti localizzati nella regione anteriore del corpo sembrano scomparire più rapidamente di quelli localizzati nella regione posteriore in seguito a trattamento con dsDjRbAp48. Una possibile spiegazione è che il complesso di organi e sistemi che sono principalmente localizzati nella regione anteriore, possa essere soggetta ad un ricambio cellulare maggiore rispetto a quelli localizzati nella regione posteriore del corpo determinando quindi una rapida scomparsa dei neoblasti presenti nella regione cefalica (Oviedo e Levin, 2007).
Perchè gli animali intatti sottoposti a RNAi del gene DjRbAp48 muoiono?
Considerando i risultati ottenuti da esperimenti su animali rigeneranti trattati con dsDjRbAp48, l’idea è che gli animali sottoposti a RNAi muoiano perché non riescono a sostituire le cellule differenziate in quanto la progenie dei neoblasti non è in grado di andare incontro a differenziamento cellulare.
L’induzione di apoptosi e la riduzione dell’espressione di marcatori di cellule differenziate che sono state osservate sostengono questa ipotesi. Anche se negli animali sottoposti a RNAi, sono state trovate cellule in mitosi a tutti i tempi analizzati, la progenie dei neoblasti può comunque non riuscire a differenziarsi e a sostenere il turnover cellulare, portano alla fine a morte gli animali.
In questo contesto, DjRbAp, come altre proteine di questa famiglia, potrebbe controllare l’espressione di geni necessari per il commitment/differenziamento dei neoblasti agendo sull’architettura della cromatina. Infatti, la coordinazione tra attivazione e silenziamento dei geni durante il differenziamento cellulare, richiede un rimodellamento dell’architettura della cromatina per silenziare a lungo termine geni specifici (Cremer and Cremer, 2001). I fattori RbAp46 e RbAp48 fanno parte di molti complessi coinvolti nel rimodellamento della cromatina, ed in altri organismi è
69 stato visto che RbAp48 e il fattore E2F-1 sono fisicamente associati in presenza di Rb e HDAC, suggerendo che RbAp48 potrebbe essere coinvolto nella repressione trascrizionale dei geni regolati da E2F (Nicolas et al., 2000).
Tuttavia, le funzioni di RbAp46 e RbAp48 nei complessi di rimodellamento della cromatina non sono ancora state del tutto chiarite.
Il ruolo ipotizzato per DjRbAp48 nel commitment/differenziamento dei neoblasti richiama la funzione, dimostrata nel topo, del complesso PRC2, di cui RbAp48 fa parte, coinvolto nel differenziamento e mantenimento della multipotenza delle cellule progenitrici tardive, (Cao et al., 2002; Kuzmichev et al., 2002; Czermin et al., 2002; Chamberlain et al., 2008).
Sebbene non si conosca ancora la funzione esatta di DjRbAp48 in planaria e a quale livello potrebbe influire sul metabolismo della cromatina, questo lavoro di Tesi fornisce la prima evidenza che un fattore associato al retinoblastoma è coinvolto nella biologia in vivo delle cellule staminali adulte.
