3.1 Costruzione, espressione e purificazione dei mutanti

3. Risultati

3.1 Costruzione, espressione e purificazione dei mutanti

Gli studi cristallografici condotti sulla 5’-nucleotidasi citosolica II hanno permesso di identificare due probabili siti effettori in corrispondenza dei quali è stato osservato il legame di molecole di adenosina e ioni solfato (Walldén et al., 2007). Poiché tra gli effettori (attivatori) della cN-II sono presenti i nucleotidi adenilici ATP e ADP e il dinucleotide tetrafosfato Ap

A, è stato ipotizzato che i due siti individuati con metodo cristallografico potessero essere i siti di legame di tali molecole effettrici. La verifica di questa ipotesi è stata condotta tramite la costruzione di mutanti sito-specifici e successiva valutazione dei parametri cinetici degli enzimi mutati così ottenuti, in modo da poter stabilire una correlazione tra la struttura del sito effettore e la risposta dell’enzima alla molecola attivatrice.

In questo lavoro vengono presentate le caratteristiche di due mutanti sito-specifici (M436W e F127E) che riguardano due residui aminoacidici che l'analisi cristallografica assegna al sito effettore 2 (figura 23). Entrambe le mutazioni introdotte sono non conservative: nel primo mutante analizzato infatti un residuo di metionina (M436) è stato sostituito con un triptofano, mentre nel secondo mutante il residuo fenilalanina 127 (F127) è stato sostituito con un residuo di acido glutammico.

Gli studi cristallografici hanno permesso di ipotizzare la presenza di due legami a idrogeno tra il gruppo amminico della base adenilica dell’effettore e il residuo di metionina 436: il primo legame a idrogeno sembrerebbe coinvolgere l’atomo di zolfo della catena laterale della metionina, mentre il secondo si formerebbe tra il gruppo carbonilico del residuo amminaocidico e il gruppo amminico dell’effettore: la mutazione della metionina 436 con il triptofano intende quindi eliminare sia l’interazione specifica tra la catena laterale del residuo e la base adenilica, sia inserire un gruppo con maggiore ingombro sterico in modo da impedire l’ingresso della base adenilica nella tasca di legame.

Figura 23 Immagine dell’adenosina legata nel sito effettore 2; si osserva che il motivo ribosidico è disordinato e la densità elettronica non può confermare la sua collocazione. Le molecole di acqua sono in rosso. Atomi polari: azoto, blu; ossigeno, rosso; zolfo, giallo. In colore sono evidenziati i residui sottoposti a mutagenesi: M436 (rosso) e F127 (rosa;

modificato da Walldén et al., 2007)

_________________________________________________________________________

Il residuo fenilalanina 127 compie invece un’interazione idrofobica con l’anello purinico della base adenilica: l’inserimento di un gruppo ionizzabile come il glutammato dovrebbe quindi eliminare tale interazione, andando così ad influenzare l’ingresso dell’effettore nella tasca di legame.

I mutanti sito-specifici sono stati ottenuti con il metodo della PCR mutagenica come descritto nel capitolo 2 (Materiali e metodi). Il sequenziamento ha confermato il buon esito della reazione: in entrambi i casi la mutazione è stata quindi inserita con successo all’interno della sequenza della cN-II wild type nella posizione desiderata. L’efficienza della trasformazione del plasmide mutato si è rivelata alta sia per quanto riguarda il ceppo di mantenimento (E. coli DH5α) sia per il ceppo di espressione (E. coli BL-21(DE3)), permettendo di ottenere diverse colonie tra le quali una per ogni mutante è stata scelta per ottenere degli stock (sia del ceppo di mantenimento che del ceppo di espressione). Anche il successivo passaggio di purificazione eseguito tramite cromatografia di affinità utilizzando la resina Ni-NTA (sfruttando la presenza di una sequenza His TAG artificialmente inserita nella proteina ricombinante; vedi il capitolo 2, Materiali e metodi) ha permesso di recuperare buone quantità di enzima mutato ricombinante. La concentrazione delle proteine recuperate in seguito alla purificazione, valutata con il metodo di Bradford, è risultata essere pari a 1,33 mg/ml per il mutante M436W e 1,6 mg/ml per il mutante F127E.

In seguito alla purificazione delle proteine ricombinanti è stato eseguito un primo dosaggio sia dell’attività nucleotidasica che dell’attività fosfotransferasica per avere indicazioni sull’attività dell’enzima e calcolare il rapporto tra attività nucleotidasica e attività fosfotransferasica. Per il mutante M436W la velocità della reazione fosfotransferasica è risultata essere pari a 18,34 U/ml, mentre la reazione nucleotidasica ha una velocità pari a 30,32 U/ml; le attività specifiche per le due reazioni sono invece pari a 13,81 U/mg e 22,8 U/mg, rispettivamente. La reazione fosfotransferasica catalizzata dal mutante F127E procede invece con una velocità pari a 11,5 U/ml, mentre la reazione nucleotidasica ha una velocità pari a 32,8 U/ml; le attività specifiche delle due reazioni sono risultate essere pari a 7,15 U/mg e 20,5 U/mg, rispettivamente.

Per valutare il grado di purezza delle proteine ricombinanti è stata eseguita un’analisi

elettroforetica in condizioni denaturanti (SDS-PAGE) utilizzando un gel di

poliacrilammide al 10%. In entrambi i casi, in seguito alla colorazione del gel con Blue

Coomassie, è stata individuata una banda in corrispondenza del peso molecolare di 59 kDa,

corrispondente al peso molecolare della singola subunità della cN-II (figura 24).

3.2 Valutazione dell’attività enzimatica con metodo radiochimico

Le caratteristiche cinetiche dei mutanti sono state valutate con metodo radiochimico misurando la velocità di formazione di prodotto radiomarcato formato a partire da un substrato marcato con

C. Dopo un primo dosaggio iniziale effettuato subito dopo la purificazione, eseguito per stimare l’attività del mutante e calcolare il rapporto tra attività nucleotidasica e attività fosfotransferasica, sono stati valutati i diversi parametri cinetici degli enzimi: sono stati misurati quindi i valori di K

per i substrati inosina (accettore della reazione fosfotransferasica) e IMP (substrato della reazione nucleotidasica) e i valori di K

per il cofattore Mg

e gli attivatori ATP, ADP, 2,3-BPG e Ap

A; è stata inoltre valutata la K

dell’inibitore P

(fosfato inorganico). I valori di K

e K

(per i substrati, gli attivatori e l’inibitore) sono stati valutati misurando la variazione della velocità enzimatica in funzione di concentrazioni crescenti di substrato, attivatore o inibitore; la costruzione del grafico dei doppi reciproci (o di Lineweaver-Burk) ha permesso di effettuare una stima più precisa dei valori di V

K

e K

.

Figura 24 Gel elettroforetici (SDS-PAGE 10%) dei mutanti M436W (sinistra) e F127E (destra). Corsia 1, standard di peso molecolare (range 19-180 kDa; banda rosa: 64,2 kDa); corsia 2, 10 µg enzima M436W;

corsia 3, 10 µg enzima F127E.

1 2 3

M436W F127E

_________________________________________________________________________

I parametri misurati sperimentalmente sono stati confrontati con i rispettivi valori relativi all’enzima wild type, in modo da stabilire se la mutazione inserita modificasse i parametri cinetici dell’enzima. Nella tabella 3 sono riportati i parametri cinetici misurati sperimentalmente per l’enzima wild type e per i due mutanti M436W e F127E:

Km Inosina

(mM)

Km IMP (mM)

Rapporto 5’N/PHT

K50 ATP (mM)

K50

ADP (mM)

K50

Ap4A (mM)

K50 2,3- BPG (mM)

K50

Mg²⁺

(mM)

K50 Pi

(mM)

cN-II wild type

1 0,1 1,8 2 3,8 0,125 0,4 2 2

cN-II

M436W 0,9 0,1 1,65

1,5 (curva sigmoide)

1,5 1 0,45 1,5 3

cN-II

F127E 1 0,14 2,85

1,5 (curva sigmoide)

2,5 0,2 0,67 0,9 2

Il mutante M436W non presenta variazioni significative dei parametri cinetici rispetto alla proteina wild type per tutti i substrati e gli effettori testati, tranne che per l’Ap

A: la K

della diadenosina tetrafosfato risulta infatti aumentata di circa 10 volte nel mutante rispetto a quanto osservato per l’enzima wild type. L’entità di attivazione dell’Ap

A è inoltre aumentata di circa 3 volte nella proteina mutante: l’enzima wild type viene infatti attivato circa 12 volte dalla diadenosina tetrafosfato, mentre per il mutante si osserva un valore di entità di attivazione pari a 37. Un’altra differenza osservata nella proteina mutante riguarda l’interazione con l’ATP: in questo caso la mutazione non influenza l’affinità dell’enzima per l’effettore, come dimostrato dal valore della K

(1,5 mM) che è paragonabile a quello della proteina wild type, ma viene modificato il tipo di interazione tra l’enzima e l’effettore. Nella proteina mutata infatti il grafico della velocità della reazione enzimatica in funzione della concentrazione di ATP presenta un andamento sigmoide, suggerendo quindi che la mutazione abbia alterato la conformazione del sito specifico dell’ATP. Anche nel caso dell’ATP si osserva inoltre che il mutante ha un’entità di attivazione doppia

Tabella 3 Parametri cinetici della cN-II wild type e dei mutanti M436W e F127E

rispetto all’enzima wild type: quest’ultimo infatti viene attivato circa 8,5 volte dall’ATP (Pesi et al., 1994), mentre il mutante risulta attivato 21 volte dall’ATP.

La sostituzione della fenilalanina 127 con glutammato non altera significativamente i parametri cinetici dell’enzima con nessuno dei substrati o degli effettori testati; anche in questo caso si osserva però un andamento sigmoide della curva della velocità della reazione enzimatica in funzione della concentrazione di ATP. Analogamente a quanto osservato per il mutante M436W, quindi, possiamo affermare che la sostituzione della fenilalanina con un glutammato in posizione 127 non altera l’affinità dell’enzima per l’effettore ATP, ma modifica il tipo di interazione tra effettore e proteina (la sigmoidicità della curva suggerisce infatti un’interazione di tipo allosterico tra ATP ed enzima).

Di seguito sono riportati i grafici utilizzati per la determinazione dei parametri cinetici dei

due mutanti M436W e F127E.

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3.2.1 Grafici per la determinazione dei parametri cinetici del mutante M436W

K

Inosina

1.

2.

Grafico I: 1, velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di [8-¹⁴C] inosina per il mutante M436W; 2, grafico dei doppi reciproci o Lineweaver- Burk raffigurante l’andamento di 1/v in funzione di 1/[Ino]; l’intercetta sull’asse delle ordinate è 1/Vmax e l’intercetta sull’asse delle ascisse è -1/Km

[Ino] (mM)

v (U/ml)

1/[Ino]

1/v

K

IMP

1.

2.

K

Mg

K

Mg

Grafico II: 1, velocità della reazione nucleotidasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di [8-¹⁴C] IMP per il mutante M436W; 2, grafico dei doppi reciproci o Lineweaver-Burk raffigurante l’andamento di 1/v in funzione di 1/[IMP]; l’intercetta sull’asse delle ordinate è 1/Vmax e l’intercetta sull’asse delle ascisse è -1/Km

[IMP] (mM)

v (U/ml)

1/[IMP]

1/v

_________________________________________________________________________

K

Mg

1.

2.

Grafico III: 1, velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di Mg²⁺ per il mutante M436W; 2, grafico dei doppi reciproci o Lineweaver-Burk raffigurante l’andamento di 1/v in funzione di 1/[Mg²⁺]; l’intercetta sull’asse delle ordinate è 1/Vmax e l’intercetta sull’asse delle ascisse è -1/K50

[Mg²⁺] (mM)

v (U/ml)

1/[Mg²⁺]

1/v

K

ATP

v (U/ml)

[ATP] (mM)

Grafico IV: Velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di ATP per il mutante M436W. Si osserva che la curva ottenuta è in questo caso sigmoide e non iperbolica. I dati riportati sono il risultato di due prove indipendenti.

_________________________________________________________________________

K

ADP

1.

2.

Grafico V: 1, velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di ADP per il mutante M436W; 2, grafico dei doppi reciproci o Lineweaver-Burk raffigurante l’andamento di 1/v in funzione di 1/[ADP]; l’intercetta sull’asse delle ordinate è 1/Vmax e l’intercetta sull’asse delle ascisse è -1/K50

[ADP] (mM)

v (U/ml)

1/[ADP]

1/v

K

2,3-BPG

1.

2.

Grafico VI: 1, velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di 2,3-BPG per il mutante M436W; 2, grafico dei doppi reciproci o Lineweaver-Burk raffigurante l’andamento di 1/v in funzione di 1/[2,3-BPG]; l’intercetta sull’asse delle ordinate è 1/Vmax e l’intercetta sull’asse delle ascisse è -1/K50

[2,3-BPG] (mM)

v (U/ml)

1/[2,3-BPG]

1/v

_________________________________________________________________________

K

Ap

A

1.

2.

Grafico VII: 1, velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di Ap4A per il mutante M436W; 2, grafico dei doppi reciproci o Lineweaver-Burk raffigurante l’andamento di 1/v in funzione di 1/[Ap4A]; l’intercetta sull’asse delle ordinate è 1/Vmax e l’intercetta sull’asse delle ascisse è -1/K50

v (U/ml)

[Ap4A] (mM)

1/v

1/[Ap4A]

K

fosfato inorganico (P

)

v (U/ml)

[Pi] (mM)

Grafico VIII: Velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di Pi per il mutante M436W

_________________________________________________________________________

3.2.2 Grafici per la determinazione dei parametri cinetici del mutante F127E

K

Inosina

1.

2.

Grafico IX: 1, velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di [8-¹⁴C] inosina per il mutante F127E; 2, grafico dei doppi reciproci o Lineweaver- Burk raffigurante l’andamento di 1/v in funzione di 1/[Ino]; l’intercetta sull’asse delle ordinate è 1/Vmax e l’intercetta sull’asse delle ascisse è -1/Km

[Ino] (mM)

v (U/ml)

1/[Ino]

1/v

K

IMP

1.

2.

Grafico X: 1, velocità della reazione nucleotidasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di [8-¹⁴C] IMP per il mutante F127E; 2, grafico dei doppi reciproci o Lineweaver- Burk raffigurante l’andamento di 1/v in funzione di 1/[IMP]; l’intercetta sull’asse delle ordinate è 1/Vmax e l’intercetta sull’asse delle ascisse è -1/Km

[IMP] (mM)

v (U/ml)

1/[IMP]

1/v

_________________________________________________________________________

K

Mg

1.

2.

Grafico XI: 1, velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di Mg²⁺ per il mutante F127E; 2, grafico dei doppi reciproci o Lineweaver-Burk raffigurante l’andamento di 1/v in funzione di 1/[Mg²⁺]; l’intercetta sull’asse delle ordinate è 1/Vmax e l’intercetta sull’asse delle ascisse è -1/K50

[Mg²⁺] (mM)

v (U/ml)

1/[Mg²⁺]

1/v

K

ATP

Grafico XII: Velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di ATP per il mutante F127E. Si osserva che la curva ottenuta è in questo caso sigmoide e non iperbolica.

[ATP] (mM)

v (U/ml)

_________________________________________________________________________

K

ADP

1.

2.

Grafico XIII: 1, velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di ADP per il mutante F127E; 2, grafico dei doppi reciproci o Lineweaver-Burk raffigurante l’andamento di 1/v in funzione di 1/[ADP]; l’intercetta sull’asse delle ordinate è 1/Vmax e l’intercetta sull’asse delle ascisse è -1/K50

[ADP] (mM)

v (U/ml)

1/[ADP]

1/v

K

2,3-BPG

1.

2.

Grafico XIV: 1, velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di 2,3-BPG per il mutante F127E; 2, grafico dei doppi reciproci o Lineweaver-Burk raffigurante l’andamento di 1/v in funzione di 1/[2,3-BPG]; l’intercetta sull’asse delle ordinate è 1/Vmax e l’intercetta sull’asse delle ascisse è -1/K50

v (U/ml)

[2,3-BPG] (mM)

1/v

1/[2,3-BPG]

_________________________________________________________________________

K

Ap

A

1.

2.

v (U/ml)

[Ap4A] (mM)

1/v

1/[Ap4A]

Grafico XV: 1, velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di Ap4A per il mutante F127E; 2, grafico dei doppi reciproci o Lineweaver-Burk raffigurante l’andamento di 1/v in funzione di 1/[Ap4A]; l’intercetta sull’asse delle ordinate è 1/Vmax e l’intercetta sull’asse delle ascisse è -1/K50

K

fosfato inorganico (P

)

v (U/ml)

[Pi] (mM)

Grafico XVI: Velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di Pi per il mutante F127E