INDICE
RIASSUNTO
...1
ABSTRACT
...3
INTRODUZIONE
... 5
1. LE CELLULE STAMINALI
...7
1.1 Le Cellule Staminali Embrionali (ESCs)
...7
1.2 Le Cellule Staminali Adulte (ASCs)
...9
1.2.1 La nicchia ...
12
2. LE CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI ... 20
2.1 Meccanismi di regolazione nell’adipogenesi
...27
2.1.2 L’adipogenesi ...
27
2.1.2 Regolazione della segnalazione cellulare ...
30
2.1.3 Regolazione dell’espressione genica ...
33
3. GLI OMEOGENI
...37
3.1 I geni Hox
...
39
3.2 I TALE
...
42
4. PREP1
...45
SCOPO DELLA TESI ... 52
MATERIALI E METODI
...54
1. BIOLOGIA CELLULARE
...54
1.1 Animali ... 54
1.3 Coltura della linea cellulare 3T3-L1
...55
1.4 Coltura delle HEK 293T
...56
1.5 Congelamento e scongelamento delle cellule ... 56
1.6 Differenziazione adipogenica delle mMSCs
...56
1.7 Colorazioni citochimiche
...57
2. BIOLOGIA MOLECOLARE
...58
2.1 Estrazione dell’RNA totale di mMSCs e 3T3-L1 ... 58
2.2 Retrotrascrizione dell’RNA ... 59
2.3 Real Time qPCR ... 59
2.4 Estrazione proteica di mMSCs ... 61
2.5 Western Blot ... 62
2.6 Infezione lentivirale di mMSCs ... 64
2.7 Clonaggio di mPrep1 in pHIV
...65
2.7.1 Il costrutto virale pHIV ...
66
2.7.2 Studio della mappa di restrizione e scelta degli enzimi di restrizione ...
66
2.7.3 Costruzione dell’inserto
... 67
2.7.4 Purificazione e digestione enzimatica ...
68
2.7.5 Elettroforesi in gel di agarosio ...
69
2.7.6 Ligazione ...
69
2.7.7 Amplificazione del vettore
... 69
2.7.8 Estrazione del DNA plasmidico ...
70
2.7.9 Digestioni diagnostiche ...
71
2.7.10 Packaging dei vettori virali ...
72
2.7.11 Infezione di mMSCs ...
73
2.8 Array per citochine
...73
1. Espressione della proteina mPrep1 in mMSCs wt e Prep1
i/i... 76
2.
Differenziazione adipogenica delle mMSCs wt e Prep1
i/iin vitro
...77
3. Espressione di marcatori adipogenici in mMSCs wt e v Prep1
i/i... 79
4
Analisi dell’espressione genica globale
...80
5.
Espressione proteica di citochine secrete nelle colture di mMSCs indifferenziate
...81
6
.Studi funzionali in vitro
...82
6.1 Downregolazione in vitro di mPrep1 in mMSCs
...82
6.2 Upregolazione in vitro di mPrep1 in mMSCs ... 83
6.2.1 Clonaggio di mPrep1 in pHIV ...
83
6.2.2 Trasfezione transiente in 3T3-L1 ...
