5. INTRODUZIONE ALLA PARTE SPERIMENTALE: METODI CROMATOGRAFICI

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5. INTRODUZIONE ALLA PARTE SPERIMENTALE:

METODI CROMATOGRAFICI

5.1.1. Cromatografia su strato sottile

LASTRE

Le cromatografie su strato sottile analitiche in fase diretta sono state effettuate con lastre (in alluminio ed vetro) di gel di silice 60 F254 della Merk.

Le cromatografie in fase inversa sono state effettuate con RP-8, RP-18 Merk stratificati su vetro.

Le cromatografie su strato sottile di tipo semipreparativo sono state eseguite su gel di silice Merk 60 F254 dello spessore di 0.25 mm per 40-80 mg di miscela o su gel di silice Merk 60 F254+366 dello spessore di 2 mm per 100-160 mg di miscela.

ELUENTI

I sistemi eluenti utilizzati per i diversi costituenti sia nella fase normale che inversa sono riportati nella parte sperimentale.

REATTIVI SPRAY [ Sthahl, E. (1967)]

Saponine

Reattivo di Komarowsky:

−Soluzione A: soluzione al 50% di Acido solforico.

−Soluzione B: soluzione metanolica al 2% di 4-idrossibenzaldeide

5 ml di soluzione A vengono mescolati a 50 ml di soluzione B poco prima dell'uso. Si spruzza il cromatogramma e si scalda per 4 minuti a 100° C. Si osservano macchie dal verde al viola.

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Flavonoidi

Reattivo NTS/PEG

NTS:

Estere-β-etil amminico dell'acido difenilborico in soluzione metanolica all'1%;

PEG:

Polietilenglicol 4000 in soluzione etanolica al 5%.

Si spruzza il cromatogramma prima con NTS e successivamente con PEG. I flavonoidi reagiscono immediatamente o dopo 15 minuti con intensa

fluorescenza alla luce UV (366 nm) e la colorazione è dipendente dalla struttura.

5.1.2. Cromatografia liquida a bassa pressione :

Questo tipo di cromatografia è stata effettuata utilizzando colonne Lobar (Merk) equipaggiate con pompa Duramat-80 (Chemie und Filter, Regendorf).

La pressione è stata di 1-3 bar con colonne 31 x 2.5 cm d.i. contenenti come fase stazionaria Lichroprep RP-18 (40-63 µm) (230-400 mesh ASTM).

5.1.3. Cromatografia ad esclusione molecolare (gel filtrazione):

Per la cromatografia ad esclusione molecolare è stato utilizzato come

riempimento il gel di Sephadex LH-20 (25-100 mm, Pharmacia. Fine Chemicals); la separazione è stata effettuata mediante una pompa peristaltica mod.-P1. E mod.P3 (Pharmacia, Fine Chemicals) eluendo ad un flusso che variava 0.5-0.8 ml/ min a seconda delle dimensioni delle colonne ed utilizzando una colonna 100 x 5 cm d.i. per quantità all'incirca di 10 g d estratto.

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5.2 METODI FISICI

5.2.1. Risonanza magnetica nucleare

Gli spettri 1_{H e}13_{C NMR sono stati registrati con uno strumento Bruker AC 250}

operante in trasformata di Fourier ed equipaggiato con un magnete da 4.7 Tesla, con radiofrequenza di 200.13 MHz per il protone e di 50.33 MHz per il 13_C.

Gli spettri mono e bidimensionali sono stati misurati in CD3OD, CDCl3, DMSO-d6.

I chemical shifts sono riportati in δ (ppm) rispetto al TMS, utilizzato come standard interno, e le costanti di accoppiamento sono date in Hz.

5.2.2. Spettri di massa

Gli spettri ad impatto elettronico sono stati eseguiti con uno strumento HP 5988 A (70 eV).

5.3 METODI ESTRATTIVI

5.3.1. Apparecchiatura Soxhlet

E' stato utilizzato un apparecchio Soxhlet in vetro convenzionale con camera di estrazione delle dimensioni di Ø= 10 cm h=30 cm, corredato da un pallone della capacità di 5L.