6. PARTE SPERIMENTALE

6. PARTE SPERIMENTALE

L’ argomento che è stato oggetto del mio lavoro, è la ricerca e l’identificazione di composti flavonoici e fenilpropanoidici in Pulsatilla montana (Hoppe) Rchb. subsp. balcana. Questa è una specie endemica della regione balcanica dove cresce in spazi aperti, nelle boscaglie, in territori paludosi.

Il materiale vegetale proviene da raccolta spontanea effettuata nelle campagne a nord della regione di Sofia (Bulgaria) durante la fioritura nelle annate 2006-2007. Il materiale vegetale, costituito dalle parti aeree di Pulsatilla montana subsp. balcana_{, è stato seccato a temperatura ambiente, all'ombra, fino a peso costante.} Successivamente la droga è stata tagliata grossolonamente e poi macinata per mezzo di un molino a martelli.

Il materiale così ottenuto è stato sottoposto ad estrazione esauriente con solventi a polarità crescente.

6.1.

F

razionamento dell’estratto metanolico delle parti aeree

Il materiale vegetale macinato di Pulsatilla montana è stato estratto in apparecchio Soxhlet con n-esano, cloroformio e metanolo in successione.

Circa 200 g del residuo dell'estratto metanolico viene fatto liofilizzare. Esso, essendo molto ricco di clorofilla, viene ripreso con un volume di MeOH e H2O.

Per un problema di carico massimo di colonna, il residuo dell’estratto metanolico viene suddiviso in due porzioni: la porzione 1 (32,06 g) e la porzione 2 (55 g). La porzione 1 è purificata mediante cromatografia ad esclusione molecolare su colonna Sephadex LH-20 eluendo con miscela CH3OH- H2O 7:3. E' stata utilizzata

una colonna in vetro SPECTRA/CHROM™ LC COLUMN ID 5.0 cm • volume 19.6 ml/ cm costituita al suo interno da un polimero di silice. La colonna, prima di iniziare il processo di purificazione dell’estratto, viene prima lavata con metanolo per circa due ore e poi condizionata per circa 4 ore con la miscela CH3OH - H2O 7:3.

Il flusso dell’eluente viene impostato a 0.50 ml/min.

Alla base della colonna viene posto l'autocampionatore per raccogliere 273 frazioni. La miscela eluente è stata modificata utilizzando CH3OH-H2O 9:1

Le frazioni raccolte sono state poi analizzate mediante cromatografia su strato sottile (TLC) usando varie miscele eluenti, in fase inversa e in fase diretta . Gli eluenti utilizzati sono stati:

-CH3OH

-CH3OH- H2O 7:3

-CH3OH- H2O 4:6

le frazioni ottenute sono state confrontate con campioni standard di riferimento per le saponine triterpenoidiche e nello specifico sono stati utilizzati:

-α-AMIRINA -ACIDO URSOLICO -β-AMIRINA -ACIDO OLEANOLICO -LUPEOLO -β -SITOSTEROLO -BETULINA

oppure confrontati con campioni standard di riferimento per i flavonoidi:

−ACIDO CAFFEICO −ACIDO CLOROGENICO −ACIDO CAFTARICO −ACIDO CICORICO

−ESTERE METILICO DELL'ACIDO CLOROGENICO

Sulla base dell'analisi delle lastre TLC, dopo aver utilizzato reattivi spray, quale Komarowsky tipico per evidenziare sostanze triterpeniche (che producono macchie di colorazione bruna sulle TLC), mentre con reattivo spray NTS-PEG (per sostanze fenoliche) si osservano sulle TLC macchie di colorazione giallastra oppure ponendo poi le lastre alla lampada UV sia a 254 nm (le macchie sono di colorazione violacea) e a 366 nm (le macchie sono di colorazione azzurrina), sono state effettuate le seguenti riunioni:

Frazioni

Peso(mg)

Attraverso una TLC riassuntiva, utilizzando come miscela di CH3OH- H2O 4:6 in

fase inversa e CHCl3-CH3OH-H2O 6:4:1 in fase diretta come confronto,

-SEPHADEX LH-20 in MeOH-W 7:3 - TLC RP-18 in MeOH-W 4:6 SiO2 in CHCl3-MeOH-W 6:4:1

R8

R9

R2

R10

R3

R11

R4

R12

R5

R13

R6

R1

R7

R14

Ap2M

6.2. Purificazione della frazione R1

R1 (104.4 mg) viene sciolto in CH3OH e H2O e caricato sulla colonna a bassa

pressione (Lobar Chromatography). Utilizziamo come metodo la cromatografia liquida preparativa su colonna a bassa pressione (LPLC): la serie LOBAR™ _{è stata}

commercializzata dalla Merck KgaA (Darmstadt, Germany) e consiste di una colonna in vetro preimpaccata per LPLC, collegata a una pompa che opera in condizioni di pressione superiori a 2 bar (30 psi).

La miscela eluente è stata CH3OH-H2O 7:3, il flusso è di 2 ml/min.

Sono state raccolte 100 frazioni che sono state poi analizzate mediante cromatografia su strato sottile (TLC) in fase inversa, usando miscela eluente CH3OH-H2O 4:6 e come reattivo spray l'NTS-PEG. Si osservano macchie di

colorazione giallastra oltre a macchie di colorazione violacea e fluorescenza azzurrina, ponendo le lastre alla lampada UV sia a 254 nm che a 366 nm.

La TLC riassuntiva in fase diretta eluita con CHCl3-CH3OH-H2O 6:4:1 ( reattivo

spray NTS-PEG e analisi UV a 254 nm e a 366 nm, si evidenzia 6 macchie denominate P1-P6:

Frazioni

Nome

Peso(mg)

12 P1 11.9 13 P2 6.1 14 P3 3.9 15-16 P4 4.6 17-19 P5 4.8 20 P6 0.4

Sulla base di una TLC riassuntiva di fase inversa RP-8 eluita con CH3OH-H2O 4:6 e

utilizzando reattivo spray NTS-PEG: è stato possibile realizzare l'Rf delle macchie che appaiono molto gialle e intense. Ponendo la lastra poi alla lampada UV a 254 nm non si osserva alcuna macchia mentre a 366 nm le macchie appaiono con fluorescenza azzurrina:

P1: 0.81

SEPHADEX LH-20

in

MeOH-W

7:3

- LOBAR RP-18

a bassa pressione in

MeOH-W

7:3

- TLC SiO2 in

CHCl3-MeOH-W

6:4:1

RP-8 in MeOH-W

4:6

P1

11,9mg

P2

6,1mg

P3

3,9mg

P4

4,6mg

P5

4,8mg

P6

0,4mg

R1

104,4mg

100 frazioni

Ap2M

(porzione 1)

6.3. Purificazione della frazione R10

R10 (465.3 mg) viene sciolto in CH3OH-H2O 5:5 e purificata tramite cromatografia

liquida preparativa su colonna (PCLC) a bassa pressione (LPLC) serie LOBAR, commercializzata dalla Merk KgaA, Darmstadt, Germany, eluita con una miscela CH3OH-H2O 4:6 alla velocità del flusso di 2 ml/min.

Alla frazione 22 si cambia la fase mobile, utilizzando una miscela CH3OH- H2O

7:3 sempre allo stesso flusso sono state raccolte 50 frazioni che sono state poi analizzate mediante cromatografia su strato sottile (TLC) in fase inversa usando miscele eluenti di CH3OH-H2O 4:6 utilizzando come reattivo spray l' NTS-PEG. Si

osservano macchie di colorazione giallastra che diventano di colorazione rispettivamente violacee e fluorescenze azzurrine, se poste alla lampada UV a 254 nm e a 366 nm; si ottengono così le seguenti frazioni riunite:

Frazioni

Nome

Peso(mg)

0-13 M1 2.1 14-15 M2 37.6 16-18 M3 29.3 19 M4 2.3 20-23 M5 8.8 24-25 M6 3.9 26-39 M7 13.5 40 M8 1.5 41-43 M9 34.4 44 M10 3.9 45 M11 6.1 46 M12 2.4 47-50 M13 11.9

Dalla TLC riassuntiva in fase inversa delle frazioni M2 , M3 , M6 , M8, M9, M10, M11, M12

e ponendo la lastra alla lampada UV a 254 nm e a 366 nm, si nota che:

-sia M2 che M3 presentano due macchie ciascuno alla lampada UV che possono

essere molto simili fra loro ma molto gialle spruzzandovi il reattivo NTS-PEG

-M6 presenta una sola macchia alla lampada UV

-M9 presenta 3 macchie alla lampada UV e si ripresentano anche in M10, M11, M12

69

70 SEPHADEX LH-20 in MeO H-W 7:3 - LO BAR RP-18 a bassa pressione in MeO H-W 4:6 7:3 - TLC RP-18 in MeOH-W 4:6 M1 2,1mg M8 1,5 mg M2 37,6mg M9 34,4mg M3 29,3mg M10 3,9mg M4 2,3mg M11 6,1mg M5 8,8mg M12 2,4mg M6 3,9mg M13 11,9mg M7 13,5mg R10 465,3mg 50 frazioni Ap2M (porzione 1)

- LOBAR RP-18 a bassa pressione in MeOH-W 4:6 7:3 - TLC RP-18 in MeOH-W 4:6

-

M2

37,6mg

M3

29,3mg

R10

465,3mg

6.3.1. P

URIFICAZIONE DELLE FRAZIONI

M

E

M

Sulla base di ciò, sono state analizzate, nuovamente e separatamente M2 da M3

utilizzando sempre la tecnica della cromatografia su strato sottile ma con due eluenti diversi:

-100 ml di CHCl3-CH3OH-H2O 6:4:1

-100 ml di BuOH-AcOH-H2O (BAW) 75:10:15

ponendo poi le lastre alla lampada UV a 254 nm e a 366 nm e con spray NTS-PEG. La corsa cromatografica effettuata con il BAW ha rilevato ancora che, sia per M2

che per M3, le macchie erano ancora sovrapposte dopo analisi alla luce UV e con

spray NTS-PEG appaiono,seppure colorate in giallo, molto intense (M2 ha Rf di 0.34

mentre M3 ha Rf di0.35); mentre le TLC in fase diretta con eluente CHCl3-CH3

OH-H2O 6:4:1 in fase diretta porta ad una buona separazione sia per M2 che per M3:

ottenendo per le due frazioni due macchie ciascuna aventi rispettivamente come Rf:

per M2: 2.2 e 0.29

per M₃ : 0.55 e 0.40

6.3.2 PURIFICAZIONE DELLA FRAZIONE M

Si utilizza la tecnica TLC preparativa in fase diretta SiO2 60 F254 20x20 e spesse

1.5 mm: sulla lastra viene depositato M2, precedentemente sciolto in una piccola

quantità di CH3OH. La lastra viene sviluppata con miscela eluente CHCl3-CH3

OH-H2O 6:4:1 e successivamente analizzata alla lampada UV a 254 nm e a 366 nm. In

tal modo sono state evidenziate le macchie presenti che mostravano colorazione marrognola e violacea rispettivamente. Spruzzando poi con reattivo NTS-PEG alle due estremità laterali della lastra, per mettere in evidenza il cammino del campione e la sua separazione, sono state ottenute le frazioni separate, che sono state estratte dalla silice rimuovendo direttamente le macchie colorate. L'estrazione è avvenuta con l'uso di CHCl3. Per evaporazione del solvente sono

state ottenute le seguenti sottofrazioni:

Nome

Peso(mg)

M’2A 1.7

M’2B 1.1

M'2A 1,7mg M'2B 1,1mg M'2C 4,7mg SEPHADEX LH-20 in MeOH-W 7:3 LOBAR RP-18 a bassa pressione in MeOH-W 4:6 7:3 TLC PREPARATIVA SiO2 60 F 254 20x20 in CHCl3-MeOH-W 6:4:1 M1 2,1mg M8 1,5 mg M2 37,6mg M9 34,4mg M3 29,3mg M10 3,9mg M4 2,3mg M11 6,1mg M5 8,8mg M12 2,4mg M6 3,9mg M13 11,9mg M7 13,5mg R10 465,3mg Ap2M (porzione 1)

74 TLC preparativa SiO2 60 F254 20x20 i n CHCl3-MeOH-W 6:4:1 TLC SiO2 in CHCl3-MeOH-W 6:4:1

M '2A

1,7mg

M '2B

1,1mg

M '2C

4,7mg

M2

37,6mg

Dopo analisi su TLC in fase diretta SiO2 (eluente CHCl3-CH3OH-H2O 6:4:1 come

reattivo spray l'NTS-PEG), si constata che solo la frazione M’2C presenta una sola

macchia molto gialla messa in evidenza dallo stesso reattivo. L'Rf della singola macchia di M’2C è di 0.72

6.3.3 PURIFICAZIONE DELLA FRAZIONE M

La frazione M3 è stata purificata seguendo lo stesso procedimento di M2

e ottenendo le seguenti sottofrazioni:

Nome

Peso(mg)

Dalla TLC riassuntiva di fase diretta SiO2 ( CHCl3-CH3OH-H2O 6:4:1 e reattivo

l'NTS-PEG), si evidenzia che solo le frazioni M’3A e M'3B presentano una sola

macchia colorata in giallo intenso.

Per le altre frazioni non compare colorazione né con il reattivo né alla lampada UV.

L'Rf delle due macchie è di 0.78 e 0.65

Da una prima analisi con spettroscopia NMR si è potuto constatare che la frazione M’2C e le frazioni M’3A e M’3B presentavano spettri molto simili. Per questo motivo

si è riunito le tre frazioni in una unica frazione: M’3A+M’3B+ M’2C avente peso di

76 M'3A 3 ,8mg M '3B 2 ,5mg M '3C 1 ,2mg M'3D 0 ,8mg M'3E 1 ,3mg M'3F 0 ,4mg SEPHADEX LH-2 0 in Me OH-W 7 :3 LO BAR RP -18 a bassa pressione in MeO H-W 4:6 7:3 TLC preparativa S iO 2 60 F254 20x20 in CHCl3-MeO H-W 6:4:1 M1 2 ,1mg M8 1 ,5 mg M2 3 7 ,6 mg M9 3 4 ,4 mg M3 2 9 ,3 mg M10 3 ,9mg M4 2 ,3mg M11 6 ,1mg M5 8 ,8mg M12 2 ,4mg M6 3 ,9mg M13 1 1 ,9 mg M7 1 3 ,5 mg R10 4 6 5,3 mg Ap2M (p o rzio n e 1)

TLC preparativa SiO2 60 F254 in CHCl3-MeOH-W 6:4:1 TLC SiO2 in CHCl3-MeOH-W 6:4:1 M '3A 3,8mg M '3B 2,5mg M '3C 1,2mg M '3D 0,8mg M '3E 1,3mg M '3F 0,4mg M3 29,3mg

SEPHADEX LH-20 in MeOH-W 7:3 LOBAR RP-18 a bassa pressione in MeOH-W 4:6 7:3 TLC preparativa SiO2 60 F254 20x20 in CHCl3-MeOH-W 6:4:1 TLC preparativa SiO2 60 F254 20X20 in CHCl-MeOH-W 6:4:1 SPETTROSCOPIA NMR SPETTROSCOPIA NMR M'2A 1,7mg M'2B 1,1mg

M'2A+M'3A+M'3B

10,9mg

6.3.4 PURIFICAZIONE DELLA FRAZIONE M

Analogamente a quanto già effettuato per le frazioni M2 e M3 anche per M9 è stato

seguito lo stesso procedimento ottenendo le seguenti sottofrazioni:

Nome

Peso(mg)

Rf

L'analisi spettroscopica non ha portato a risultati soddisfacenti tali da permettere una corretta identificazione del composto in esame.

M'9C 6,5mg M'9D 9,9mg M'9E 5,7mg M'9A 2,9mg M'9B 2,8mg SEPHADEX LH-20 in MeOH-W 7:3 L OBAR RP-18 a b assa pression e in MeOH-W 4:6 7:3 TL C prep arativa SiO2 60 F 254 20x20 in CHCl3-MeO H-W 6:4:1 M1 2,1mg M8 1,5 mg M2 37,6mg M9 34,4mg M3 29,3mg M10 3,9mg M4 2,3mg M11 6,1mg M5 8,8mg M12 2,4mg M6 3,9mg M13 11,9mg M7 13,5mg R10 465,3mg Ap2M (porzione 1)

TLC preparative SiO2 60 F254 in CHCl3-MeOH-W 6:4:1 TLC SiO2 in CHCl3-MeOH-W 6:4:1 M'9A 2,9mg M'9B 2,8mg M'9C 6,5mg M'9D 9,9mg M'9E 5,7mg M9 34,4mg

6.4 Purificazione della frazione R11

R11(225.2 mg) viene sciolto in una miscela di CH3OH e H2O 5:5 e caricato sulla

colonna a bassa pressione (Lobar Chromatography), che viene eluita con CH3

OH-H2O 4:6 al flusso di 4 ml/min.

Sono state raccolte 18 frazioni e successivamente la fase mobile è stata cambiata in CH3OH-H2O 7:3 inducendo il flusso a 2 ml/min; sono state raccolte 31 frazioni

che sono state analizzate mediante cromatografia su strato sottile in fase inversa (TLC) usando miscela eluente CH3OH-H2O 4:6 ed reattivo spray NTS-PEG. Si

ottengono macchie di colorazione giallastra, che analizzate alla lampada UV a 254 nm e a 366 nm si mostrano colorazioni rispettivamente marrognole-violacee e fluorescenze azzurrine.

Si ottengono le seguenti riunioni:

Frazioni

Nome

Peso(mg)

0-10 S1 9.3 11 S2 1.4 12-13 S3 16.8 14 S4 1.5 15-19 S5 1.6 20-22 S6 2.4 23-24 S7 0.9 25-26 S8 1.4 27-31 S9 1.5

Dalla TLC riassuntiva in fase inversa RP-18 eluita con CH3OH-H2O 4:6 di tutte le

frazioni e con reattivo NTS-PEG, si osservano singole macchie gialle molto intense per le frazioni S3 e S4; mentre alla lampada UV a 254 nm appaiono singole

macchie con colorazione marrognola per la frazione S6 e S8.

Per tutte le altre frazioni non appare nessuna colorazione.

S3 , S4, S6 e S8 sono tutte singole macchie aventi rispettivamente Rf: 0.90, 0.89,

SEPHADEX LH-20

in

MeOH-W

7:3

-

LOBAR RP-18

a bassa

pressione in MeOH-W

4:6

7:3

- TLC RP-18 in MeOH-W

4:6

S1

9,3mg

S2

1,4mg

S3

16,8mg

S4

1,5mg

S5

1,6mg

S6

2,4mg

S7

0,9MG

S8

1,4mg

S9

1,5mg

R11

225,2mg

31 frazioni

Ap2M

(porzione 1)

6.5 Purificazione della frazione R13

R13 (515.0 mg) viene sciolto in CH3OH e H2O 5:5 e caricato sulla colonna a bassa

pressione (Lobar Chromatography) per la successiva purificazione.

Utilizziamo come metodo la cromatografia liquida preparativa su colonna (PCLC) a bassa pressione (LPLC).

La separazione avviene tramite l'utilizzo di una fase mobile CH3OH-H2O 4:6 e di un

flusso di 4 ml/min.

Si ottengono 31 frazioni, dopo di che si cambia la fase mobile, utilizzando una miscela di CH3OH-H2O 7:3 riducendo il flusso di tale eluente a 2 ml/min. Si

raccolgono 45 frazioni che sono state poi analizzate mediante cromatografia su strato sottile in fase inversa, usando miscele eluenti di CH3OH-H2O 4:6 ed il

reattivo spray NTS-PEG. Le macchie così evidenziate presentano una colorazione giallastra. Ponendo poi le lastre sotto la lampada UV a 254 nm e a 366 nm si ottengono rispettivamente colorazioni marrognole-violacee e fluorescenze azzurre.

Le frazioni sono le seguenti:

Frazioni

Nome

Peso(mg)

0-14 Q1 1.3 15 Q2 1.7 16 Q3 4.1 17 Q4 1.8 27 Q5 1.1 28 Q6 3.6 29-31 Q7 10.2 32 Q8 1.2 33-34 Q9 2.2 35-45 Q10 3.7

Dalla TLC riassuntiva in fase inversa RP-8 eluita con CH3OH-H2O 4:6 e evidenziata

con reattivo NTS-PEG, abbiamo potuto osservare macchie gialle molto intense per le frazioni Q2, Q3, Q4, Q6, Q7, Q8 ,Q9.

Q2, Q3 e Q4 sono singole macchie aventi Rf 0.83, 0.86, 0.80

Q6 è una singola macchia avente Rf 0.81

Q7 è una singola macchia avente Rf 0.58

Q8 è una singola macchia avente Rf 0.46

Q9 è una singola macchia avente Rf 0.39

SEPHADEX LH-20 in MeOH-W 7:3 - LOBAR RP-18 a bassa pression e in MeOH-W 4:6 7:3 - TLC RP-18 in MeOH-W 4:6

Q1

1,3 mg

Q6

3,6mg

Q2

1,7mg

Q7

10,2mg

Q3

4,1mg

Q8

1,2mg

Q4

1,8mg

Q9

2,2mg

Q5

1,1mg

Q10

3,7mg

- LOBAR RP-18 a bassa pressione in MeOH-W 4:6 7:3 - TLC RP-18 in MeOH-W 4:6 TLC RP-8 in MeOH-W 4:6 Q1 1,3mg Q2 1,7mg Q3 4,1mg Q4 1,8mg Q5 1,1mg Q6 3,6mg Q7 10,2mg Q8 1,2mg Q9 2,2mg Q10 3,7mg R13 515,0mg

6.6 Purificazione della frazione R14

La frazione R14 (584.7 mg) è stata divisa in due frazioni A e B per l’elevato

quantitativo e purificata tramite cromatografia liquida preparativa su colonna (PCLC) a bassa pressione (LPLC) eluita con CH3OH-H2O 4:6 ad un flusso di 4

ml/min.

Dopo 60 frazioni la fase mobile è stata sostituita con una miscela di CH3OH-H2O

7:3 ad un flusso di 2 ml/min si ottengono 100 frazioni che sono state poi analizzate mediante cromatografia su strato sottile in fase inversa usando miscele eluenti di CH3OH-H2O 4:6 ed il reattivo spray NTS-PEG, ottenendo macchie di

colore giallastro (alla luce UV a 254 nm e a 366 nm diventano macchie di colore marrognole-violacee e con fluorescenza azzurrina rispettivamente).

Sulla base di ciò, le 100 frazioni sono state riunite in 3 frazioni. Lo stesso procedimento si è potuto ripetere per la frazione B

Da questa separazione sono state ottenute le seguenti riunioni: 9 frazioni dalla seconda porzione di R14 .

Dalle TLC riassuntive in fase inversa di queste 12 frazioni totali (CH3OH-H2O 4:6)

e in fase diretta (CHCl3-CH3OH-H2O 6:4:1) si è potuto effettuare le seguenti

riunioni:

Frazioni

Nome

Peso(mg)

86-100 (A) R’1 11.6 66-68 (B) 69-71 (B) 72-100 (B) R’2 36.2 0-76 (A) 77-85 (A) 52-57 (B) R’3 57 58 (B) 59-63 (B) R’4 16.9 64-65 (B) R’ 25

88

SEPHADEX LH-20 in

MeOH-W 7:3

- LOBAR RP-18 a bassa pression e in MeOH-W

4:6 7:3

- TLC RP-18 in MeOH-W 4:6

0-76(A) 77-85(A) 86-100(A) PORZIONE A 100 frazioni 0-50(B) 64-65(B) 51(B) 66-68(B) 52-57(B) 69-71(B) 58(B) 72-100(B) 59-63(B) PORZIONE B 100 frazioni R14 584,7mg Ap2M (porzione 1)

SEPHADEX LH-20 in MeOH-W 7:3

- LOBAR RP-18 a bassa pressione in MeOH-W 4:6 7:3 - TLC RP-18 in MeOH-W e SiO2 in CHCl3-MeOH-W 4:6 6:4:1 TLC RP-18 in MeOH-W 4:6 R'1 11,6 mg 86-100(A) R'2 36,2mg 66-68(B),69-71(B),72-100(B) R'3 57mg 0-76(A),77-85(A)52-57(B) R'4 16,9mg 58(B),59-63(B) R'5 25mg 64-65(B) R'6 10,7mg 0-50(B) R'7 2,7mg 51(B) R14 584,7mg Ap2M (porzione1)

Dalla TLC riassuntiva di fase inversa (CH3OH-H2O 4:6 e reattivo spray NTS-PEG)

accoppiato all'analisi alla luce UV a 254 nm e a 366 nm, abbiamo potuto riscontrare che le frazioni:

-R’1, R’2 e R’3 presentavano 4 macchie giallognole con il reattivo NTS-PEG

rispettivamente aventi Rf: 0.90, 0.58, 0.43 (che nella R’2 e nella R’3 sono molto

intense di colore giallo e arancione) e 0.35.

-R’4 presenta 4 macchie meno intense e aventi gli stessi Rf delle precedenti.

-R’5 presenta 4 macchie meno intense e aventi gli stessi Rf delle precedenti.

-R’6 e R’7 presentano ciascuno 1 sola macchia con Rf rispettivamente:0.82 e

0.55.

Sulla base di ciò, R’6 e R’7 sono stati sottoposti ad analisi spettroscopica NMR

mentre sono state analizzate separatamente R’1, R’2 e R’3 utilizzando sempre la

tecnica della cromatografia su strato sottile ma con due eluenti diversi:

-CHCl3-CH3OH-H2O 6:4:1

-BuOH-AcOH-H2O (BAW) 75:10:15

Visualizzando il cromatogramma ottenuto alla lampada UV a 254 nm e a 366 nm o con reattivo NTS-PEG.

- LO BAR RP-1 8 a bassa pressione in MeO H-W 4:6 7:3 - TLC RP-18 in MeO H-W 4:6 SiO2 in CHCl3-MeO H-W 6:4:1 TLC SiO 2 in CHCl3-MeO H-W 6:4:1 TLC SiO2 in BAW 75:10:15

R'1

11,6mg

R'2

36,2mg

R'3

57mg

R14

584,7mg

Dal confronto di queste TLC si evidenzia che, la migliore separazione delle macchie viene ottenuta con CHCl3-CH3OH-H2O 6:4:1 in fase diretta pertanto:

_R’1 (11.6 mg) viene ridisciolto in poco metanolo e separato tramite TLC in

fase diretta F254 20x20 (1.5 mm) e sviluppando con eluente CHCl3-CH3OH- H2O

6:4:1, (visualizzazione tramite UV a 254 nm e a 366 nm, si tracciano le macchie presenti: mostrano colorazione rispettivamente marrognola e violacea) e spruzzando poi reattivo NTS-PEG alle due estremità laterali della lastra, per mettere in evidenza il cammino del campione e la sua separazione. Le frazioni ottenute per estrazione del campione dalla silice hanno portato queste subfrazioni:

Nome

Peso(mg)

Rf

Dalla TLC riassuntiva in fase diretta SiO2 con CHCl3-CH3OH 6:4 e reattivo

NTS-PEG.

Con lo stesso procedimento è stata effettuata la purificazione della seconda metà del campione R'1.

Portando a secco con evaporatore rotante abbiamo ottenuto:

Nome

Peso(mg)

Rf

R”*1A 13.2 0.17

R”*1B 16.5 0.78

dalla TLC riassuntiva in fase diretta SiO2 con CHCl3-CH3OH 6:4 e reattivo

NTS-PEG.

R”1A è stato caratterizzato con spettroscopia NMR.

SEPHADEX LH-20 in

MeOH-W 7:3 - LOBAR RP-18 a bassa pressione in

MeOH-W 4:6 7:3 - TLC SiO2 in CHCl3-MeOH-W 6:4:1 RP-18 in MeOH-W 4:6 1° TLC preparativa SiO2 60 F254 20x20 con CHCl3-MeOH 6:4

R''1A

7mg

R''1B

3,6mg

R''1C

2,3mg

R'1

11,6mg

R14

584,7mg

Ap2M

(porzione 1)

SEPHADEX LH-20 in M eOH-W 7:3 2° TLC preparativa SiO2 F254 20x20 con CHCl3-MeOH 6:4

- LOBAR RP-18 a bassa pressione in MeOH-W 4:6 7:3 - TLC SiO2 in CHCl3-MeOH-W 6:4:1 RP-18 in MeOH-W 4:6 R''*1A 13,2mg R''*1B 16,5mg R'1 11,6mg R14 584,7mg Ap2M (porzione 1)

R’2 (36.2 mg) è stato purificato tramite TLC analitiche in fase diretta F254

20x20 (1.5 mm).

Usando come eluente CHCl3-CH3OH 7:3 e con reattivo NTS-PEG spruzzato

alle due estremità laterali della lastra, per mettere in evidenza il cammino del campione e la sua separazione.

La separazione ha portato ai seguenti risultati: 1° TLC

Nome

Peso(mg)

Rf

Dalla TLC riassuntiva in fase diretta SiO2 con CHCl3-CH3OH 7:3 e reattivo

NTS-PEG 2° TLC

Nome

Peso(mg)

Rf

Da TLC riassuntiva di fase diretta SiO2 con condizioni di CHCl3-CH3OH 6:4

spruzzando come reattivo l'NTS-PEG.

Le frazione R”*2A e R”°2A sono state riunite sulla base delle macchie

evidenziate. Il peso totale è di 5.4 mg. Dall'analisi spettroscopica di quest'ultima frazione, non ha portato a risultati soddisfacenti tali da permettere una corretta identificazione del composto in esame.

SEPHADEX LH-20

in

MeOH-W

7:3

MeOH-W 4:6 7:3 - TLC RP-18 in MeOH-W 4:6 SiO2 in CHCl3-MeOH-W 6:4:1

1° TLC preparativa SiO2 60 F254 20x20

con

CHCl3-MeOH

7:3

R''*2A

3,5mg

R''*2B

1,6mg

R''*2C

1,8mg

R'2

36,2mg

R14

584,7mg

Ap2M

(porzione 1)

SEPHADEX LH-20 in

MeOH-W 7:3

- LOBAR RP-18 a vbassa pressione in MeOH-W 4:6 7:3 - TLC SiO2 in CHCl3-MeOH-W 6:4:1 RP-18 in MeOH-W 4:6 2° TLC preparativa SiO2 60 20x20 con CHCl3-MeOH 6:4

R''°2A

3,3mg

R''°2B

1,4mg

R''°2C

1,4mg

R''°2D

1mg

Ap2M

R’3 (57 mg) viene purificato tramite 2 TLC preparative in gel di silice 60

F254+366 20x20 senza indicatore di fluorescenza e spesse 2 mm.

(eluente CHCl3-CH3OH 6:4 e con reattivo NTS-PEG).

Questa frazione si scioglie ottimamente in metanolo ma non bene in cloroformio. Abbiamo poi portato a secco ottenendo:

1° TLC

Nome

Peso(mg)

Nome

Peso(mg)

6.6.1 P

urificazione mediante

SPE

della frazione

R''

Il campione è stato sciolto nella minima quantità di acqua e caricato su una colonna SPE (Solid Phase Extraction, RP-18, 1g/6ml) precedentemente condizionata con MeOH e acqua in successione. 3 diverse frazioni sono state ottenute eluendo con MeOH-acqua (6:4) e successivamente MeOH-acqua (9:1).

Nome Peso (mg) Rf

R''3A1 30,3 0.81

R''3A2 11,8 0.57

R''3A3 6,3 0.41

Mediante TLC su fase inversa RP-8 (in MeOH-W 6:4 e reattivo spray NTS-PEG) è stato verificata la purezza delle diverse frazioni ottenute e successivamente il composto R''3A1( 30,3 mg) è stato sottoposto a analisi spettroscopica NMR

SEPHADEX LH-20 in

MeOH-W 7:3

- LOBAR RP-18 a bassa pression e in MeOH-W 4:6 7:3 - TLC RP-18 in MeOH-W 4:6 SiO2 in CHCl3-MeOH-W 6:4:1 1° TLC preparativa SiO2 60 F254 20x20 in CHCl3-M eOH 6:4

R"3A

53,1mg

R'3

R14

Ap2M

SEPHADEX LH-20 in

MeOH-W 7:3

- LOBAR RP-18 a bassa pressione in MeOH-W 4:6 7:3 -TLC RP-18 in MeOH-W 4:6 SiO2 in CHCl3-MeOH-W 6:4:1 2° TLC preparativa SiO2 60 F254 20x20 in CHCl3-MeOH 6:4

R"*3A

16,2mg

R'3

R14

Ap2M

SEPHADEX LH-20 in

MeOH-W 7:3

- LOBAR RP-18 a bassa pressione in MeOH-W 4:6 7:3 - TLC RP-18 in MeOH-W 4:6 SiO2 in CHCl3-MeOH-W 6:4:1 2° TLC preparativa SiO2 60 F254 20x20 in CHCl3-MeOH 6:4

- colonna SPE RP-18 in MeOH-W 6:4 9:1 - TLC RP-8 in MeOH-W 6:4

R"3A1

30,3mg

R"3A2

11,8mg

R"3A3

6,3mg

R"*3 A

16,2mg

R'3

R14

Ap2M

Tab. 6. Indagine preliminare mediante spettrometria di massa (ioni quasi molecolari e corrispondenti

frammenti tipici) per l'identificazione di alcuni composti isolati dall’estratto metanolico di Pulsatilla

montata _{(Hoppe) Rchb.}

Codice composto [M+H]+ _[M-H]- _{Frammenti tipici (positivo) Frammenti tipici}

(negativo)

Q6

519.2

517.2

508.9,319.7,323.8,309.9,

194.4

193.5

Q7

684.3

682.8

669.2, 654.3, 610.0

503.2, 341.1,

387.3, 193.3,

179.9

R’7

180.7

-

-

-M’2C

473.3

471.1

311.4, 293.3, 219.0,149.0

292.0, 191.9

R”3A1

365.1

-

203.0, 184.9

-P2

547.5

-

465.2, 448.9, 409.2, 383.1