Capitolo III

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Capitolo III

Materiali e Metodi

I composti AM251, A967079, CID16020046, HC030031, O1602, celecoxib rofecoxib, indometacina e ionomicina sono stati ottenuti dalla Tocris Bioscience (Bristol, UK). Il composto LPI è stato acquistato dalla Sigma-Aldrich (Milano, Italia). Il forskolin è stato gentilmente donato dal laboratorio del Prof. Calderone.

Le sostanze lipofile testate sono state solubilizzate in DMSO e diluite in mezzo di coltura conl’1% di FBS fino all’ottenimento delle concentrazioni utilizzate nei saggi. La percentuale di DMSO utilizzata nella concentrazione massima testata non ha mai superato lo 0,5%, condizione fondamentale per evitare l’interferenza del solvente nei test di citotossicità.

Composti Profilo farmacologico

AM251 Antagonista CB1 selettivo

Agonista GPR55

A967079 Antagonista selettivo TRPA1

Antagonista selettivo GPR55

HC030031 Antagonista selettivo TRPA1 CID16020046 Antagonista selettivo GPR55

LPI Agonista endogeno GPR55

O1602 Antagonista selettivo GPR55 Indometacina Inibitore COX1/COX2

Rofecoxib Inibitore selettivo COX2 Celecoxib Inibitore selettivo COX3

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AM251 A967079

CID16020046

HC030031

27 Rofecoxib Indometacina Ionomicina LPI Forskolin

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A375

Il modello sperimentale usato è costituito dalla linea di cellule di melanoma cutaneo umano A375 (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville; MA, USA) caratterizzate da un tempo di duplicazione di circa 30 ore e da una forma allungata (Fig.9). Crescono in adesione in incubatori a 37°C con il 5% di CO2, in un terreno costituito dal mezzo base Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI), ricostituito con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina (50 UI/ml) e streptomicina (50 µg/ml).

Figura 9. Cellule A375 a basso (sinistra) e alto (destra) tasso di crescita

HDFa

Le cellule utilizzate come controllo sono i fibroblasti dermici umani primari (HDFa), isolati da derma adulto (Fig.10). Tali cellule sono caratterizzate da una forma allungata, fusiforme e da un tempo di duplicazione di circa 50 ore. Crescono in adesione a 37°C con il 5% di CO2, in un terreno costituito dal mezzo base Dulbecco's Modified Medium (DMEM, Sigma-Aldrich, Milano) ricostituito con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina (50 UI/ml) e streptomicina (50 µg/ml).

29 Figura 10. Cellule HDFa a basso (sinistra), medio (centro) e alto (destra) tasso

di crescita

RPMI

Il Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI, Sigma Aldrich, Milano) è il terreno di coltura usato per consentire la crescita e la proliferazione delle cellule A375. Contiene amminoacidi, vitamine, sali, glucosio, glutammina e, come indicatore di pH, il rosso fenolo. Per valori di pH intorno a 7.4, in cui le cellule crescono bene, presenta un colore rosso-arancio che vira al giallo quando, in seguito a proliferazione cellulare, si ha acidificazione del mezzo per produzione della CO2 proveniente dal metabolismo cellulare. Assume, invece, una colorazione violacea in presenza di pH alcalino indicando che le cellule non sono metabolicamente attive o che la regolazione della CO2 è alterata.

DMEM

Il Dulbecco's Modified Medium (DMEM) è il terreno di coltura usato per consentire la crescita e la proliferazione delle cellule HDFa. Il DMEM presenta le stesse caratteristiche di RPMI descritte nel precedente paragrafo.

FBS

Il fetal bovine serum (FBS, Sigma-Aldarich, Milano) è costituito da fattori di crescita e proteine che hanno il compito di facilitare la sopravvivenza, la crescita e la divisione cellulare e per questo viene addizionato al mezzo.

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Penicillina/Streptomicina

La miscela 1:1 degli antibiotici penicillina (50 UI/ml) e streptomicina (50 µg/ml) (Sigma-Aldarich, Milano, Italia) viene usata per evitare la proliferazione batterica all'interno delle colture cellulari.

Tripsina

La tripsina-EDTA (Trypsin-Versene (EDTA) Mix 1X, Sigma Aldarich, Milano, Italia) è una soluzione contenente una proteasi, la tripsina, capace di apportare tagli proteolitici a livello del legame tra l'arginina (membrana cellulare) e la lisina (supporto trattato) permettendo il distacco delle cellule. Tale funzione è sfruttata per degradare le proteine della matrice su cui le cellule sono state fatte crescere in adesione. Nella soluzione è presente anche l'EDTA, un agente chelante, che viene aggiunto per migliorare l'attività proteolitica della tripsina poiché, legando cationi come il calcio e il magnesio presenti nell'ambiente extra-cellulare, gli impedisce di nascondere i legami peptidici su cui agisce la tripsina.

PBS

Il phosfate saline buffer (PBS, Sigma-Aldarich, Milano) è un tampone costituito da una soluzione salina acquosa contenente cloruro di sodio, cloruro di potassio e fosfato di sodio. La sua funzione è quella di mantenere i valori di pH costanti, isotonici. Non essendo tossico per le cellule, viene usato per i lavaggi delle colture cellulari allo scopo di eliminare i detriti.

Primer

I primer sono oligonucleotidi sintetici che hanno il compito di innescare la sintesi del nuovo filamento di cDNA durante la fase di amplificazione della PCR. Per ogni sequenza bersaglio serve una coppia di primer, il reverse (complementare al filamento in direzione 5'-3') e il forward (complementare al filamento in direzione 3'-5').

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Le sequenze dei primer sono state analizzate con il programma Primer-Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) per valutare la specificità di ogni coppia per il targer e evitare la formazione di prodotti di amplificazione genica indesiderati.

Le sequenze dei primer usati, forniti dalla Sigma.Aldrich, Milano, sono riportate nella tabella 2. Per controllare la corretta esecuzione delle procedure abbiamo valutato la gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) e la β-actina, geni housekeeping presenti in tutti i tessuti. I geni housekeeping sono geni che vengono attivamente trascritti e tradotti a un livello elevato poiché generalmente codificano proteine e enzimi fondamentali per la vita della cellula; questo è il motivo per cui sono espressi in tutti i tessuti e per cui costituiscono un buon controllo.

Name Primer nucleotide sequences Ta

(°C) Amplicon lenght GAPDH 5'-GTGAAGGTCGGAGTCAACG- 3' (F) 5′GGTGAAGACGGCCAGTGGACT- 3' (R) 59 301 pb β-actin 5'- AACTGGAACGGTGAAGGTGAC -3' (F) 5'- GACTTCCTGTAACAACGCATCTC - 3' (R) 61 138 pb CB1 5'- 5′-CCACTCCCGCAGCCTCCG-3' (F) 5'- ATCAGGCAAAACGCCACCAC- 3' (R) 59 309 pb CB2 5'- GGTGACAGAGATAGCCAATG-3' (F) 5'- GCCAATGAACAGGTATGAGG - 3' (R) 59 309 pb GPR55 5'- ACAGTTTGCAGTCCACATCC -3' (F) 5'- ACGCTTCCGTACATGCTGAC- 3' (R) 59 309 pb TRPA1 5'- TCACCATGAGCTAGCAGACTATTT -3' (F) 5'- GAGAGCGTCCTTCAGAATCG - 3' (R) 55 74 pb Cox2 5'-GCAGCCAATCCTTGCTGTTC-3' (F) 5'-CGTTATTGCAGATGATGAGAGACTG- 3' (R) 55 309 pb Bax 5'-TCTGACGGCAACTTCAACTG-3' (F) 5'-TTGAGGAGTCTCACCCAACC- 3' (R) 56,6 188 pb Bcl-2 5'-TCCATGTCTTTGGACAACCA-3' (F) 5'-CTCCACCAGTGTTCCCATCT- 3' (R) 56,6 203 pb Survivin 5'- ACCAGGTGAGAAGTGAGGGA -3' (F) 5'- AACAGTAGAGGAGCCAGGGA - 3' (R) 59 309 pb

Tabella 2. Sequenze dei primer utilizzati; temperatura di anealing e lunghezza amplificato.

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Fluo 4 AM

Il Fluo 4 AM (Invitrogen, Molecular Probes, USA) è un indicatore del calcio che dopo legame con il calcio, presenta un aumento della fluorescenza. L’indicatore è stato direttamente somministrato nel disco Petri contenente le cellule in coltura e osservato con microscopio a fluorescenza Eclipse E600FN Nikon.

Ionomicina

La Ionomicina (Calbiochen, Canada) è uno ionoforo, prodotto dal batterio Streptomyces conglobatus, utilizzato per innalzare il livello di calcio intracellulare. La Ionomicina è stata impiegata come controllo della fluorescenza.

L15

L-15 Leibovits Medium (Sigma-Aldarich, Milano) è un mezzo per coltura cellulare costituito da L-glutammina ed è stato utilizzato per visualizzare le cellule in ambiente atmosferico senza che queste subissero modificazioni dovute ad alcalinizzazione del pH infatti è utilizzato in sistemi liberi da biossido di carbonio che richiedono supplemento di bicarbonato di sodio.

PLURONIC

Il Pluronic (Invitrogen, Molecular Probes, USA) è un tensioattivo non ionico utilizzato per sospendere la sonda e facilitarne la penetrazione all’interno delle cellule.

DAPI

Il DAPI (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) è un colorante fluorescente che lega fortemente le regioni ricche di A e T del DNA e viene impiegato per la marcatura del DNA presente nei nuclei delle cellule. Il complesso DAPI/DNA presenta una lunghezza di eccitazione a 358 nm e un'emissione massima a 461 nm (Fig. 11)

33 Figura 11. a) Struttura chimica del colorante DAPI b) Spettro di assorbimento

ed emissione del colorante DAPI (eccitazione 380 nm, emissione 510 nm)

Paraformaldeide

La paraformaldeide è usata come fissativo chimico per la sua capacità di formare legami crociati tra i gruppi amminici delle catene laterali delle proteine, stabilizzandole e preservandone la struttura.

Vectashield

Il Vectashield è un mezzo acquoso di montaggio a base di glicerolo ed è stato usato per prevenire la perdita di fluorescenza durante l'esame al microscopio.

Kit e reagenti

L'estrazione dell'RNA totale dalle cellule è stata eseguita con RNeasy Mini Kit (Quiagen, Milano) che comprende: RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes da 1,5 e 2 ml, acqua RNase-Free e buffer (buffer RLT, buffer RW1 e buffer RPE).

La retrotrascrizione è stata eseguita utilizzando il kit Quanti Tect Reverse Transcription Kit (Quiagen, Milano), comprendente Gdna Wipeout Buffer 7x, QuantiscriptR, Reverse Transcriptase, Quantiscript RT Buffer 5x, RT Primer Mix e acqua RNase-Free.

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La PCR è stata effettuata usando il kit HotStarTaq PCR (Qiagen, Milano). Il kit è costituito da PCR buffer 10x, HotStarTaq Master Mix, acqua RNase-Free.

La real-time PCR è stata effettuata usando la sonda SsoFastTM EvaGreenR Supermix (Bio-Rad, Hercules, USA).

Il gel per la corsa elettroforetica è stato ottenuto utilizzando agarosio all’1% (Sigma-Aldrich, Milano) e tampone TBE 0,5x contenente acido borico 0,9 M, EDTA 0,01 M, Tris 1 M (Sigma-Aldrich, Milano). L’intercalante (SafeView, Canada) è stato aggiunto alla soluzione 3 µl/20ml. Ladder 100pb e blu di bromofenolo-xilene sono stati forniti da Bio-Rad (Hercules, USA).

Il cAMP enzyme immunoassay kit (Sigma-Aldrich, Milano) è stato utilizzato per la determinazione quantitativa di AMP ciclico. Del kit fanno parte: il Goat Anti-Rabbit IgG; la cAMP Fosfatasi alcalina (una soluzione blu di fosfatasi alcalina coniugata con cAMP); il Camp EIA anticorpo di coniglio anti-cAMP; Acido Cloridrico; il reagente neutralizzante; Wash Buffer; una soluzione di AMP ciclico standard; una soluzione di p-Nitrofenil Fosfato in buffer; una Stop Solution (soluzione di fosfato trisodico in acqua); Trietilammina; Anidride Acetica.

Il Muse Cell Cycle Kit (Merck KgaA, Germany) consente la misurazione quantitativa della percentuale di cellule totali per ciascuna fase (G0/G1; S; G2/M). Del kit fanno parte il Muse Cell Reagent ed EtOH 70%.

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3.2 Metodi usati negli studi funzionali

3.2.1 Scongelamento della linea cellulare

Lo scongelamento è la procedura necessaria per riportare le cellule in uno stato metabolico attivo dopo che sono state conservate congelate in azoto liquido per un determinato periodo di tempo. Inizialmente, è necessario scongelare il criotubo con le cellule, dapprima in ghiaccio e poi a bagnomaria a 37°C fino al completo scongelamento.

Lavorando sotto cappa a flusso laminare, si procede aspirando il contenuto del criotubo e trasferendolo in una provetta da 15 ml sterile per poi aggiungere goccia a goccia 5-6 ml di mezzo di coltura ricostituito, precedentemente riscaldato anch'esso a 37°C a bagnomaria. Si risospende delicatamente la soluzione con il fine di equilibrare la sospensione cellulare con il mezzo e si lascia riposare a temperatura ambiente per qualche minuto.

La provetta viene, quindi, centrifugata a 1100 rpm (rotazioni per minuto) per 5 minuti per poi aspirare ed eliminare il surnatante. Quindi si risospende il pellet cellulare in 3-4 ml di mezzo completo e si pone all’interno di una fiasca nell’'incubatore (37°C, 5% di CO2).

3.2.2 Mantenimento in coltura

Le fiasche (Starsted, Verona, Italia), contenenti le cellule in fase di crescita esponenziale, devono essere conservate all'interno di un incubatore che mantiene la temperatura a 37°C con il 5% di CO2 ed essere controllate quotidianamente, sostituendo il mezzo consumato con del mezzo fresco per eliminare così i prodotti di scarto del metabolismo cellulare e fornire nuovamente le sostanze che consentono e favoriscono la proliferazione cellulare.

Quando le cellule sono quasi a confluenza (75-80% della superficie totale della fiasca), per evitare che continuino a replicarsi formando dei multistrati cellulari, è necessario staccarle.

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Il procedimento prevede di aspirare completamente il mezzo e lavare la superficie di crescita con 5-6 ml di PBS per eliminare i detriti cellulari. Quindi, aspirato il PBS, si aggiungono 2 ml di soluzione di tripsina/PBS in rapporto 1:1 in modo da staccare le cellule dalla superficie di crescita. Si colloca quindi la fiasca in incubatore (la catalisi della tripsina si attiva a 37°C) per 1 minuto, al termine del quale ci si accerta al microscopio che le cellule si siano effettivamente staccate.

A questo punto si procede aggiungendo 5-6 ml di mezzo completo per inattivare la proteolisi enzimatica e, dopo aver trasferito la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml, si centrifuga a 1100 rpm per 5 minuti. Alla fine di tale operazione, si aspira il surnatante e il pellet ottenuto viene delicatamente risospeso in mezzo di coltura completo. Le cellule sono quindi seminate in una nuova fiasca o congelate.

3.2.3 Congelamento cellule

Si ricorre al congelamento cellulare quando è necessario conservare le cellule in uno stato di inattività metabolica per un lungo periodo di tempo.

Il mezzo di congelamento usato con la linea cellulare A375 è preparato come segue:

 40% di RPMI non ricostituito, che fornisce un ambiente sierologico adatto per le cellule che devono rimanere quiescenti;

 50% di FBS, le cui proteine possono proteggere la membrana dai danni provocati dal congelamento.

 10% di DMSO (Sigma-Aldrich, Milano, Italia) per ridurre le dimensioni dei cristalli di ghiaccio che si possono formare all'interno delle cellule, comportandosi da crioconservatore.

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La procedura prevede innanzitutto di staccare e centrifugare le cellule a1100 rpm per 5 minuti così da eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 1.7 ml di mezzo di congelamento. La sospensione ottenuta è trasferita in un criotubo e conservata per 24 ore a - 80°C e poi introdotta in un dewar in azoto liquido.

3.2.4 Analisi della vitalità cellulare

La vitalità cellulare è stata valutata mediante saggio colorimetrico (Cell Proliferation Reagent WST-1, Roche, Mannheim, Germany), dove il reagente principale è un sale di tetrazolio, WST-1, che viene metabolizzato da enzimi mitocondriali in un sale di formazano solubile colorato (Fig.14).

A

(rossopallido) (rosso intenso) WST-1 FORMAZANO

B

1 2

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In particolare, le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti, considerando un numero di 5000 cellule per ciascun pozzetto. Dopo 24 ore dalla semina, tempo necessario per permettere l’adesione cellulare, il mezzo di coltura è stato rimosso e sostituito con 100 μl di soluzione contente i composti testati, in un range di concentrazioni 0,1-50 μM. Ogni campione è stato analizzato in quadruplicato per 3 volte, incluso il controllo e il non trattato. Il controllo contiene il solvente di solubilizzazione in percentuale corrispondente a quella riscontrata nei pozzetti relativi alla massima concentrazione testata. Negli esperimenti condotti con AM251, il trattamento con gli antagonisti TRPA1 (A967079 e HC030031) è stato condotto due ore prima del trattamento con AM251 in modo da consentire il blocco del recettore. Dopo il trattamento, sono stati aggiunti ad ogni pozzetto 10 μl di WST-1 per 100 μl di soluzione e le piastre sono posizionate in incubatore per circa 1 ora. Infine è stata misurata l’assorbanza lo spettrofotometro Nano Quant (TECAN, Austria) con il lettore di micropiastre ad una lunghezza d’onda di 450 nm.

Per ovviare all’assorbimento nel campo del visibile del mezzo di coltura e delle sostanze in esso solubilizzate, fenomeno che può falsare i valori reali di assorbanza, è stato utilizzato un bianco, ovvero un pozzetto contenente la stessa soluzione del trattato, senza cellule seminate al suo interno. Al valore dell’assorbanza di ogni campione è stato sottratto il valore dell’assorbanza del bianco corrispondente. L’inibizione della vitalità cellulare è stata quindi calcolata come percentuale di assorbanza delle cellule trattate (meno il bianco) verso i controlli (cellule con solo veicolo), e la concentrazione che determina il 50% di inibizione della crescita cellulare (IC50) è stata determinata sulla curva ottenuta dalla regressione non lineare dei dati (GraphPad Software, San Diego, USA).

Gli esperimenti sono stati condotti in quadruplicato e i valori di IC50, espressi come medie ± errore standard (SE), sono stati calcolati da tre esperimenti indipendenti (n=3).

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3.3 Metodi utilizzati negli studi di biologia molecolare

3.3.1 Estrazione dell'RNA totale

L’RNA totale viene estratto in condizioni e con materiali RF (RNase-Free) per limitare la degradazione dell’RNA da parte dell’enzima Rnase e le soluzione usate sono tutte RNase-Free. Il protocollo di estrazione si articola nelle seguenti fasi:

Staccare le cellule mediante tripsinizzazione, quindi centrifugare (1100rpm per 5 minuti).

Eliminare il sovranatante e risospendere il pellet ottenuto in mezzo di coltura completo, in volume variabile a seconda delle dimensioni del pellet.

Contare le cellule, dopodiché centrifugare (1100 rpm per 5 minuti).

Successivamente, eliminare il sovranatante ed aggiungere 1ml di PBS, quindi centrifugare (1100 rpm per 3 minuti).

Eliminare il sovranatante e risospendere il pellet in 1ml di PBS, quindi centrifugare (1100 rpm per 3 minuti).

Aspirare il sovranatante e aggiungere Buffer RLT ricostituito (10μl di beta-mercaptoetanolo per 1ml di Buffer RLT non ricostituito), per lisare le cellule. Il volume di RLT da utilizzare per la lisi dipende dal numero di cellule del nostro campione, secondo la proporzione fornita dall’RNeasy Mini Kit Handbook (Qiagen, Milano) e riportata sotto.

Numero di cellule (n) Volume RTL Dimensione del disco (cm) Volume RTL

n < 5 x 106 350 µl < 6 350 µl

5 x 106 n <1 x 106 600 µl 6 ÷ 10 600 µl

Tabella 3. Volume di tampone RTL da utilizzare in base al numero di cellule o al supporto utilizzato.

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Agitare la provetta con il buffer, in modo da lisare il pellet. Alla lisi cellulare corrisponde un aumento della viscosità della soluzione. Per evitare la formazione di grumi e filamenti, utilizzare una bacchetta di vetro in modo da omogeneizzare quanto più possibile il contenuto del lisato.

Trasferire il lisato in una eppendorf, quindi aggiungere un volume di etanolo RF 70%, pari a quello di Buffer RLT utilizzato, agitando continuamente per evitare la formazione di due fasi.

Caricare una quantità massima di 700 μl di lisato cellulare per ogni spin column, quindi inserire la colonna in un collection tube da 2ml e centrifugare per 1 minuto a velocità maggiore di 10 000 rpm ed eliminare l’eluato. Aggiungere 500 μl di Buffer RPE e centrifugare per 15 secondi a velocità maggiore di 10 000 rpm.

Eliminare l’eluato; caricare altri 500 μl di Buffer RPE e centrifugare per 2 minuti a velocità maggiore di 10 000rpm. Successivamente, senza aggiungere il buffer, centrifugare per 1 minuto a velocità maggiore di 10 000 rpm.

Eliminare il tubo collettore, utilizzare un nuovo tubo da 1,5ml ed aggiungere 40μl di acqua RNase Free sulla membrana, lasciando idratare la membrana per qualche minuto. Infine centrifugare per 1 minuto a velocità maggiore di 10 000 rpm. L’eluato ottenuto contiene l’RNA, per cui eliminare la colonna e alloggiare il collection tube in ghiaccio

.

Per determinare la concentrazione e la purezza dei campioni ottenuti sono state effettuate misurazioni spettrofotometriche nell’ultravioletto, a due lunghezze d’onda: 260 nm e 280 nm. La stima della purezza del campione è data dal rapporto fra l’assorbanza a 260 nm e quella a 280 nm. Il valore ottenuto deve essere compreso tra 1,8 e 2: quanto più il valore si avvicina a 2, tanto maggiore è la purezza dell’RNA estratto.

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L’integrità dell’acido nucleico viene valutata mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio all’1%, effettuata necessariamente con materiali RNase Free, 120V per 20 minuti.

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3.3.2 Retrotrascrizione

La metodica consente di retrotrascrivere l’RNA in cDNA, utilizzato come stampo per la successiva reazione di amplificazione. La retrotrascrizione viene effettuata seguendo la procedura descritta dal QuantiTect® Reverse Transcription Handbook (Qiagen, Milano), riportata di seguito:

Scongelare l’RNA e i componenti del kit (gDNA Wipeout Buffer, QuantiScript Reverse Transcriptase, QuantiScript RT Buffer, RT Primer Mix, RNase Free Water) in ghiaccio. Centrifugare brevemente e posizionare in ghiaccio.

Successivamente, preparare la reazione di eliminazione del DNA genomico: 2 μl di gDNA Wipeout Buffer 7x, 1 μg di RNA totale, RNase Free Water q.b. 14 μl. Centrifugare e posizionare in ghiaccio.

A questo punto, incubare la reazione di eliminazione del DNA genomico nel termociclizzatorea 42°C. Preparare la Reverse Transcription Master Mix: 1μl di QuantiScript Reverse Transcriptase, 4 μl di QuantiScript RT Buffer 5x, 1μl di RT Primer Mix. Aggiungere l’RNA totale privo di DNA genomico (14 μl), alla Reverse Transcription Master Mix, per un volume totale di 20 μl.

Centrifugare, posizionare in ghiaccio ed incubare nel termociclizzatore con il protocollo specifico per la retrotrascrizione, che prevede: 30 minuti a 42°C, 3 minuti a 95°C per attivare l’enzima QuantiScript Reverse Transcriptase.

Il cDNA ottenuto è stato poi utilizzato per le reazioni di RT-PCR, Real-time PCR e conservato in congelatore a -20°C.

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3.3.3 PCR (Polymerase Chain Reaction)

La procedura di PCR è stata eseguita utilizzando HotStarTaq Master Mix (Qiagen, Milano), il cui protocollo di esecuzione è il medesimo: Scongelare le soluzioni dei primer (25 μM), quindi centrifugarle prima dell’uso. Centrifugare la HotStarTaq Master Mix e prelevarne 6,25 μl da trasferire in una eppendorf da PCR.

Aggiungere 0,2 μl di primer Forward e di primer Reverse. Alla mix ottenuta aggiungere 3,85 μl di acqua contenuta nel kit, quindi centrifugare brevemente. Aggiungere 2 μl di cDNA ottenuti tramite retrotrascrizione, quindi centrifugare brevemente e trasferire il campione nel termociclizzatore, impostando l’opportuno protocollo. La mix di reazione misura un volume finale di 12,5 μl per campione.

I protocolli di PCR eseguiti dal termociclizzatore si compongono delle seguenti fasi:

- 95º per 15 minuti: attivazione della HotStarTaq DNA Polymerase;

- 3 step ripetuti per un numero di cicli variabile a seconda del gene valutato e del grado di espressione dello stesso.

 95º per 1 minuto: fase di denaturazione;

 T annealing per 1 minuto;

 72º per 1 minuto: fase di estensione; - 72º per 10 minuti: fase di estensione finale.

I campioni ottenuti possono essere utilizzati immediatamente per la corsa elettroforetica o conservati a -20ºC.

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3.3.4 Elettroforesi su gel di agarosio

L’integrità dell’RNA totale estratto e il risultato delle amplificazioni sono stati valutati mediante corsa elettroforetica sottomarina su gel di agarosio all’1%. Il gel è stato preparato con tampone TBE 0,5x, ottenuto per diluizione della soluzione madre TBE 10x la quale contiene: acido borico 0,9M, EDTA 0,01M e Tris 1M a pH 8,4. Gli esperimenti sono stati effettuati in apparati orizzontali, con voltaggio costante di 90-100V, usando TBE 0,5x come tampone di corsa. I prodotti di PCR sono stati caricati addizionado a 5 μl 1μl di blu di bromofenolo-xilene e 6 μl di Ladder 100pb per la visualizzazione della lunghezza dell’amplificato di PCR. La presenza dell’acido nucleico, in entrambi i casi, è stata messa in evidenza su gel di agarosio tramite trans-illuminatore in quanto è stato addizionato al gel un intercalante del DNA in grado di diventare rilevabile in presenza degli amplificati.

3.3.5 Real-time PCR

La procedura di real-time PCR è stata eseguita per quantificare l'espressione genica di survivina, Bcl-2 e Bax. In base al protocollo suggerito dal produttore, si è proceduto nel seguente modo.

I primer Forward e reverse, l’acqua, i cDNA e la sonda vengono sono stati scongelati preventivamente in ghiaccio. In particolare i primer utilizzati sono specifici per la survivina, Bcl-2 e Bax e per i geni housekeeping GAPDH e β-actina.

In ogni well della piastra per real-time si addizionano:

10 µl sonda (che va aggiunta per ultima poiché fotosensibile); 400 nM µl di primer Forward;

400 nM µl di primer Reverse;

20 ng di cDNA ottenuto dalla retrotrascrizione dell'RNA estratto; q.b. di acqua per un volume finale pari a 20 µl.

I protocolli di real-time PCR eseguiti si compongono delle seguenti fasi (Tabella. 4):

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Temperatura Tempo Cicli

Attivazione polimerasi 95°C 30 sec 1

Denaturazione 95°C 1 - 5 sec 40

Appaiameneto/Estensione 65 - 95 °C 1 - 5 sec

Curva di melt 56 - 60 °C 5 sec 1 < n < 5 x 106

Tabella 4. Protocollo di real-time PCR

La temperatura di annealing utilizzata per la GAPDH e la survivina è di 59°C, per la β-actina è di 61°C, mentre per Bcl-2 e Bax è di 56,6º.

La PCR, Polymerase Chain Reaction, reazione a catena della polimerasi, è una tecnica mirata alla produzione di un gran numero di copie di DNA a partire anche da una sola singola molecola. La Real-Time PCR è una tecnica che si basa sull’utilizzo di una molecola fluorescente, la quale aumenta la propria fluorescenza man mano che si forma l’amplificato ed è eseguita con strumenti che, oltre a fungere da termociclizzatori, eccitano i fluorocromi presenti nei campioni e convogliano quindi la fluorescenza emessa ad uno spettrografo;

La fluoresecenza è proporzionale al prodotto amplificato ad ogni ciclo, con una conseguente maggiore precisione e riduzione del tempo dell’esperimento.

La molecola più comunemente usata per la real-time PCR è la sonda SYBR Green, noi abbiamo utilizzato la sonda EvaGreen che ha proprietà spettrali e un meccanismo analogo. La SYBER Green I è un composto organico aromatico (formula molecolare CHNS) facente parte del gruppo delle cianine asimmetriche, molecole dotate di attività fluorofora, ed è utilizzato in biologia molecolare quale colorante di acidi nucleici poiché ha la capacità di intercalarsi nella doppia elica di DNA (dsDNA) e di legarvisi in modo non specifico. La sonda emette poca fluorescenza quando è libera in soluzione ma aumenta fino a 1.000 volte, quando si lega al dsDNA; pertanto il segnale complessivo fluorescente è proporzionale alla quantità di dsDNA prodotto (Fig. 14).

46 Figura 14. Meccanismo d’azione della sonda EvaGreen Sso7d

Il principale svantaggio dei coloranti che legano il DNA è la loro mancanza di specificità, cioè si legano a qualsiasi desossiribonucleotidetrifosfato, incluso i dimeri dei primers. Di conseguenza, la presenza di prodotti non specifici nella reazione di real-time PCR può contribuire alla fluorescenza generale ed influire sulla precisione di quantificazione. Un’altra conseguenza è che i coloranti che legano il DNA non possono essere utilizzati per le reazioni in multiplex (ovvero reazioni di real-time PCR in cui si ottengono prodotti di amplificazione diversi), poiché i segnali fluorescenti generati in questo caso non possono essere distinti. La reazione di real-time PCR prevede l’utilizzo di una miscela di componenti: cDNA, desossiribonucleotiditrifosfato, ioni magnesio, primer e Taq-polimerasi e si articola in più fasi.

La denaturazione (94-99°C) promuove la separazione dei due filamenti della molecola stampo, rendendo così accessibile la regione da amplificare.

L’appaiamento o annealing (50-60°C) è la fase che favorisce il legame dei primer alla sequenza complementare dei filamenti denaturati, dando così inizio alla sintesi del cDNA e garantendo la specifica ibridazione di primer e sonde alle regioni del DNA bersaglio ad essi complementari. La temperatura di annealing è scelta 4-5 °C sopra la temperatura di Melting (TM, la temperatura alla quale vengono separati il 50% delle coppie di basi di DNA a

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doppio filamento). La temperatura di Melting è calcolata tenendo conto della lunghezza dei primer e del legame delle loro basi.

Il calcolo dellaTM è eseguito nel seguente modo:

 Oligonucleotide inferiore a 20 nucleotidi 2 × (𝐴 + 𝑇) + 4 × (𝐺 + 𝐶) = 𝑇𝑀 (°𝐶)

 Oligonucleotide superiore 20 nucleotidi

[2 ×(𝐴 + 𝑇)+ 4 ×(𝐺 + 𝐶)]×[1 +(𝑁 − 20)

20 = 𝑇𝑀 (°𝐶)] L’allungamento o extension (65-72 °C) ottimizza la capacità della Taq-polimerasi di promuovere l’allungamento dei primer, utilizzando come stampo il singolo filamento di DNA.

Completata l'amplificazione, lo strumento aumenta gradualmente la temperatura e genera una curva di fusione (o curva di melting) mentre il segnale fluorescente è tenuto sotto controllo grazie alla formazione di un gradiente di temperatura. Tale curva, costruita in funzione della temperatura, può essere usata per l'identificazione di prodotti di reazione diversi in quanto su di essa si traccia la derivata prima negativa della variazione di fluorescenza. Questo fa sì che un picco caratteristico alla temperatura di fusione di un dato prodotto di amplificazione possa essere distinto da altri prodotti.

Il segnale fluorescente della sonda, invece, durante i primi cicli di amplificazione rimane a livelli di fondo per divenire rilevabile solo quando il prodotto risulta sufficientemente amplificato. Il ciclo nel quale ciò si verifica è chiamato ciclo di soglia, o CT (ciclo threshold). In particolare, il valore CT è misurato durante la fase esponenziale di amplificazione ed è dipendente principalmente dalla quantità di DNA stampo presente all'inizio della reazione (Fig. 15).

48 Figura 15. Grafico del segnale di amplificazione ottenuto dopo real time PCR

Infatti maggiore è la quantità di campione presente inizialmente, minore sarà il numero di cicli necessari per accumulare abbastanza prodotto e ottenere un segnale fluorescente rilevabile, quindi minore sarà il valore del CT. Esiste pertanto una relazione lineare tra il Log10 della quantità iniziale del DNA stampo e il suo CT durante la real-time PCR (Fig.16).

Figura 16. Retta che indica la relazione tra la quantità di campione e il CT

Tale relazione consente, usando quantità note di acido nucleico iniziale, di costruire una curva standard di riferimento con la quale si potrà risalire al numero di copie di DNA stampo di partenza del campione da indagare, confrontando solo il valore di fluorescenza ottenuto dalla real-time PCR.

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bersaglio rispetto ad un gene housekeeping. Nello specifico, per determinare la differente espressione del gene bersaglio in diversi campioni si procede nel seguente modo:

-normalizzare il CT del gene bersaglio (test) con quello del gene housekeeping (standard)

ΔCT(test) = CT (target, test) – CT (rif, test)

ΔCT(standard) = CT (target, standard) – CT (rif, standard) normalizzare il ΔCT del campione al ΔCT dello standard ΔΔCT = ΔCT(test) - ΔCT(standard)

-calcolare il rapporto di espressione

2(-ΔΔCT) = rapporto espressione normalizzato.

Il risultato ottenuto rappresenta il numero delle volte di aumento o diminuizione del gene bersaglio rispetto al gene housekeeping, a cui viene dato il valore di uno.

3.4 Rilevazione di calcio intracellulare

Seminare 200000 cellule A375 in dischi Petri da 35 mm. Successivamente procedere caricando le cellule con sonda Fluo 4: Mescolare 1,5 µl di Fluo 4 (già aliquotato, a -20º) con 0,7 µl di Pluronic in 2 ml di mezzo RPMI 0,5 % FBS in una falcon; vortexare e sostituire questa soluzione al mezzo contenuto nella piastra.

È importante togliere il mezzo senza aspirazione, in modo tale da mantenere in parte la presenza di FBS.

Successivamente, inserire la piastra in incubatore per 30 minuti; lavare con 1 ml di mezzo L15 no FCS; inserire 2 ml di mezzo L15 no FCS; posizionare il disco con le cellule sotto al microscopio a fluorescenza con sistema di perfusione; perfondere con AM251 a concentrazioni crescenti da 0,1 µM a 100 µM e acquisire le immagini dopo ogni somministrazione; perfondere con inomicina 5 µM, utilizzata come controllo positivo.

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3.5 Analisi ciclo cellulare

Il Muse Cell Cycle Kit consente misurazioni quantitative della percentuale di cellule nelle fasi G0/G1, S e G2/M del ciclo cellulare attraverso il Muse Cell Analyzer.

Preparazione campioni:

Seminare cellule A375, trattare le cellule con AM251 5 µM e il controllo per 48 ore.

Fissaggio dei campioni:

preparare EtOH 70% utilizzando 7 ml di EtOH e 3 ml di acqua milliQ; riporre l’etanolo preparato in ghiaccio; procedere a staccare le cellule e trasferire la sospensione cellulare in una provetta; centrifugare a 1200 rpm per 5 minuti; rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet situato sul fondo della provetta; successivamente aggiungere un volume appropriato di PBS in ciascuna provetta (1 ml di PBS per ogni 106 cellule) risospendendo il pellet; centrifugare nuovamente a 1200 rpm per 5 minuti; aspirare il surnatante e risospendere il pellet in PBS; effettuare la conta delle cellule e prelevare il quantitativo di sospensione calcolato; vortexare a velocità molto bassa mentre si aggiunge la sospensione cellulare goccia a goccia. Stoccare i campioni a -20°C per 12 ore; spinnare e aspirare l’EtOH. Sospendere in 100 µl di PBS e 100 µl di fluorocromo. Infine incubare per 30 min al buio ed in seguito effettuare la lettura allo strumento.

3.6 Studi di apoptosi

La determinazione della morfologia nucleare è stata effettuata trattando le cellule con il colorante fluorescente DAPI. Nello specifico, sono state seminate 10 000 cellule in ogni camera della chamberslide e, dopo l’adesione, vengono sono state trattate per lo studio. Al termine delle 48 ore di trattamento, sono stati effettuati

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due lavaggi con PBS e poi le cellula sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 15 minuti. Si procede quindi con il seguente protocollo: si lavano i campioni con PBS per poi aggiungere, ricoprendo completamente le cellule, 300 µl di una soluzione diluita di DAPI 300 nM per chamber, precedentemente preparata diluendo la soluzione madre di DAPI con PBS. Si incuba per 5 minuti, dopo i quali si procede lavando più volte con PBS per eliminare il DAPI non legato. Dopo aver allontanato completamente il tampone, si procede al montaggio del vetrino con l’ausilio del Vectaschield Mounting Medium e infine si procede all’analisi al microscopio a fluorescenza Eclipse E600FN Nikon. I campioni vanno conservati al buio a 4°C

3.7 Valutazione AMP-ciclico

Il cAMP enzyme immunoassay kit (Sigma-Aldrich, Milano, Italia) è stato utilizzato per la determinazione quantitativa di AMP ciclico. Preparazione reagenti:

Preparazione “Acetylation Reagent”: aggiungere 0.5 ml di acido acetico per 1 ml di trietilammina. Utilizzare il reagente preparato entro 60 minuti dalla preparazione.

Preparazione “Campioni Standard”: preparare 5 provette di vetro (numerandole). Aggiungere 990 µl di HCl 0.1 M nella provetta 1. aggiungere 750 µl di HCl 0.1 M nelle provette 2-5. Aggiungere 10 µl di Standard cAMP alla provetta 1 e vortexare accuratamente. In seguito aggiungere 250 µl di Standard cAMP dalla provetta 1 alla provetta 2 e proseguire da 3 a 5. La concentrazione di cAMP nelle

provette sarà 20; 5; 1,25; 0,312 e 0,078 pmol/ml, rispettivamente.

Etichettare 2 provette con Zero Standard e NSB e inserirvi all’interno 1 ml di HCl 0.1 M.

Acetilazione campioni standard: aggiungere 10 µl di reagente di acetilazione per ogni 200 µl di standard e vortexare per 2 secondi.

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Aggiungere 50 µl di reagente di acetilazione alle provette Zero Standard (B0) e NSB.

Preparazione Wash Buffer diluito: diluire 10 ml di Wash Buffer concentrato in 45 ml di acqua milliQ.

Preparazione campioni:

Seminare cellule A375 (5000 cellule per well) in piastra da 24 pozzetti.

Trattare le cellule, una volta adese, con AM251 (48 ore) a concentrazioni crescenti (1; 3 e 5 µM) e controllo. Includere nella piastra il controllo.

Aspirare completamente la soluzione e lisare le cellule mediante l’aggiunta di 300 µl di HCl 0,1 M. Inserire la piastra in incubatore e attendere 10 minuti per il compimento della lisi.

Trascorsi 10 minuti, controllare al microscopio il livello di lisi. Se non risulta soddisfacente, prolungare la lisi per altri 10 minuti.

Prelevare il contenuto di ogni pozzetto e scaricarlo nell’apposita eppendorf.

Centrifugare le eppendorf a 2700 rpm per 10 minuti.

Procedura saggio:

Caricamento pozzetti: caricare 50 µl di Neutralizing Reagent in tutti i pozzetti, tranne nel TA e nel Bianco; aggiungere 100 µl di di HCl 0,1 M in NSB e 100 µl in B0; caricare 100 µl di Standard e dei campioni negli appositi pozzetti; aggiungere 50 µl di cAMP-Alkaline Phosphatase Conjugate in ogni pozzetto ad eccezione del TA e del Blank.

Aggiungere 50 µl di cAMP-EIA Antibody in ogni pozzetto ad eccezione del TA,del NSB e Blank.

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Incubare la piastra a temperatura ambiente per 2 ore su un agitatore di piastra.

Svuotare il contenuto dei pozzetti ed effettuare 3 lavaggi con 200 µl di Wash Buffer diluito.

Aggiungere 5 µl di cAMP-Alkaline Phosphatase Conjugate al pozzetto TA.

Aggiungere 200 µl di p-Nitrophenil Phosphate Substrate Solution in tutti i pozzetti.

Incubare a temperatura ambiente per 1 ora, senza scecherare.

Aggiungere 50 µl di Stop Solution ad ogni pozzetto.

Leggere la piastra a 405 nm

Analisi dei dati

Per l’analisi dei dati e per le presentazioni grafiche è stato utilizzato il programma Graph-Pad Prism 5 (Graph-Pad Tutti i dati rappresentano la media ± della deviazione standard di dati ottenuti da tre distinti esperimenti condotti in quadruplicato. Per verificare se i dati ottenuti fossero significativamente diversi, abbiamo utilizzato il test statistico Student t-test e ANOVA con post-test Bonferroni.