CAPITOLO 5
Capitolo 5
DISCUSSIONE
Negli ultimi anni, diversi studi hanno dimostrato che gli Anoplocefalidi possiedono una patogenicità non trascurabile, potendo determinare una serie di lesioni a carico del tratto intestinale del cavallo che possono evidenziarsi con quadri riferibili a colica spasmodica (Pearson et al., 1993; Proudman et al., 1998).
Questo dato ha suscitato l’interesse per effettuare una ricerca in Italia, dove sono stati pochi gli studi dedicati a questa parassitosi del cavallo.
Queste infestazioni sono probabilmente sottostimate in quanto attualmente manca ancora un test caratterizzato da una sensibilità elevata per la diagnosi sia di A. perfoliata che delle altre specie di cestodi Anoplocefalidi che interessano il cavallo (Meana et al.,1998).
Esiste quindi la necessità di mettere appunto un test diagnostico con una sensibilità maggiore. Pertanto, in questo studio è stato fatta una ricerca volta a valutare la presenza di questi parassiti nel territorio toscano, cercando inoltre di comprendere se l’esistenza di tale infestazione fosse di origine locale oppure dovuta all’importazione di animali già infetti. Complessivamente, la prevalenza osservata in questo studio per gli Anoplocefalidi del cavallo risulta essere del 20,53 %, inferiore a quella riportata in altri paesi Europei (Collobert et al., 1997; Nilsson et al., 1995; Meana, 2005) dove il metodo diagnostico utilizzato è stato però l’esame post-mortem.
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tasso di prevalenza del 65% all’esame post-mortem, corrisponde per gli stessi animali un tasso di prevalenza del 23% utilizzando un esame copro-diagnostico (Nilsson et al., 1995). Pertanto, la prevalenza osservata nel presente studio risulta paragonabile a quella di altri paesi Europei quando viene utilizzato il metodo copro-diagnostico. Il valore di 20,53% riportato nel nostro studio coincide anche con la prevalenza osservata per A. perfoliata. Sulla base dei risultati ottenuti con la stessa tecnica coprodiagnostica utilizzata nella nostra ricerca, in un precedente studio epidemiologico effettuato in Sardegna, la prevalenza di A. perfoliata è risultata del 14,4% (Scala A. et al., 2001), un dato inferiore a quello riportato
in questo studio.
Per quanto riguarda Anoplocephalides (Paranoplocephala)mamillana, un solo campione è risultato positivo nel primo campionamento (novembre-dicembre 2004).
Lo stesso animale, è risultato positivo sia ad A. perfoliata che ad A. mammillana. La prevalenza di questa specie risulta pertanto molto bassa (0,45%) essendo risultata di un campione positivo su 224 campioni analizzati.
Nonostante in precedenti studi (Ricci e Sabatini, 1992; Scala e Canceda, 1996), tutte e tre le specie di Anoplocefalidi che interessano il cavallo siano risultate presenti in Italia, la presenza di Anoplocephalides (Paranoplocephala) mamillana in un solo campione fecale risultato positivo, conferma i dati bibliografici riguardanti la maggiore prevalenza di A. perfoliata rispetto alle altre specie (Gasser et al, 2005).
Considerando che il cavallo risultato positivo per Anoplocephalides (Paranoplocephala) mamillana era stato appena importato dall’Inghilterra, si può pensare che l’infestazione
causata da questo parassita non sia legata ad un’infezione locale ma alla importazione di animali già infetti.
Al contrario, i risultati ottenuti evidenziano, la presenza di A. perfoliata nelle aree e negli allevamenti esaminati.
Infatti, la positività riscontrata nell’Allevamento 2 che alleva cavalli nati in luogo e mai spostati dall’allevamento dopo la nascita, indica la presenza del parassita nell’area considerata.
Lo stesso si può dire per gli animali degli Allevamenti 1 e 2 risultati negativi al primo campionamento e che si sono in seguito positivizzati.
Ciò riguarda in particolare l’Allevamento 1 che alleva cavalli Purosangue Inglese importandoli dall’Irlanda e che si positivizzano dopo il periodo di permanenza nell’allevamento.
Infatti, soprattutto nel secondo anno di osservazione la prevalenza passa in questo allevamento dallo 0 % a inizio stagione (nov-dic anno 2005) al 25 % dopo 6 mesi di permanenza nell’azienda.
Al contrario, l’Allevamento 3 sembra importare nell’allevamento animali che si sono già infestati e solo dopo il trattamento degli animali risultati infetti, la prevalenza negli animali si abbassa al controllo del semestre successivo.
Nell’Allevamento 2 che alleva una popolazione stanziale di cavalli Tiro Pesante Rapido (TPR) allo stato brado in regime di agricoltura biologica si è avuta la prevalenza minore (13,63%).
La minor prevalenza di A. perfoliata dell’Allevamento 2 in cui i cavalli sono allevati all’aperto e non trattati con farmaci fa ipotizzare, in accordo con altri autori (Gasser et al., 2005) che in un regime di mancato trattamento antielmintico, altre popolazioni parassitarie, soprattutto gli Strongili gastrointestinali, possano esercitare un’azione
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competitiva nei confronti dei cestodi.
Sulla base di alcune ricerche è stato dimostrato possibile, che l’ospite intermedio rappresentato da varie specie di acari Oribatidi, non riesca a trovare un habitat favorevole in un terreno sabbioso e soprattutto con elevata salinità come quello che caratterizza questo allevamento.
Condizioni climatiche particolarmente sfavorevoli per l’ospite intermedio, soprattutto riguardanti la scarsa piovosità sia nel periodo autunnale sia in quello invernale dell’anno 2005, possono anch’esse determinare la diminuzione di cestodi nei cavalli analizzati l’anno successivo.
Sulla base di quanto osservato fino ad ora si può già consigliare il controllo coprologico dei nuovi animali introdotti in azienda, il loro tempestivo trattamento, al fine di limitare la diffusione nell’allevamento degli Anoplocefalidi.
Negli animali allevati in zone ad alto rischio per questa parassitosi alcuni autori recentemente raccomandano il trattamento contro i cestodi ogni sei mesi (Proudman e Matthews, 2000). È anche vero però, che l’infestazione da cestodi del cavallo in alcuni paesi è stagionale, pertanto in queste regioni, soprattutto se la popolazione equina è stanziale, non sembra così necessario eseguire due trattamenti l’anno.
Infatti, sulla base dei dati ottenuti in Svezia e in Spagna (Hoglund et al., 1998; Meana, 2005) è emerso che conviene trattare i cavalli con il farmaco cestodicida, durante l’inverno/primavera quando la maggior parte dei parassiti ha raggiunto la maturità.
Con tutta probabilità, queste valutazioni possono essere valide anche per il nostro paese. È doveroso ricordare che un’eccessiva intensità di trattamenti può favorire lo sviluppo di farmaco resistenza, fattore che risulterebbe grave considerato che le molecole con azione
cestodicida sono limitate.
Oltre alle analisi parassitologiche e al trattamento farmacologico possono essere messe in atto altre strategie utili, per il controllo dei cestodi Anoplocefalidi, che includono soprattutto la buona gestione e la pulizia dei pascoli destinati al soggiorno dei cavalli. Gli acari sono piuttosto rari nei pascoli che vengono spesso arati e non lasciati incolti per lunghi periodi (Bain e Kelly 1977; Bello et al.,1982).
Il trattamento antielmintico del cavallo, associato ad efficaci pratiche di profilassi igienico ambientale può rappresentare uno strumento fondamentale per il controllo delle infestazioni parassitarie e dovrebbe essere eseguito secondo protocolli basati su dati epidemiologici in grado di indicare l’entità e la specificità del rischio.
Va sottolineato anche che la presenza sporadica di uova di cestodi sia comunque un dato sufficiente per confermare il rischio di infestazione, che può diventare elevato in mancanza di un efficace controllo di questi parassiti (Rinaldi et al., 2004).
Tra gli obiettivi del presente lavoro figura anche lo studio compararativo tra alcune metodiche diagnostiche per la ricerca di A. perfoliata in cavalli naturalmente infetti; comprendenti le tecniche classiche quali l’esame coprologico e sierologico e una tecnica innovativa quale la nested-PCR.
I metodi utilizzati fino ad oggi a scopi diagnostici (esame coprologico e sierologico) hanno indubbiamente punti di forza ma anche di debolezza che dovrebbero essere sempre presi in considerazione nella diagnosi di questa parassitosi.
La tecnica coprologica per l'individuazione delle uova di cestodi Anoplocefalidi nelle feci di cavalli infetti, è facile da eseguire, poco costosa e non richiede attrezzature sofisticate o reagenti particolari; tuttavia, come riferito anche in letteratura (Proudman e Edwards,
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1992; Matthews et al., 2004), essa è una metodica che richiede un tempo notevole per essere eseguita e, soprattutto ha una bassa sensibilità.
Il test (ELISA) su siero è una metodica impiegata anche per scopi clinici per stabilire la relazione tra l’infezione e la possibilità di sviluppareforme cliniche gravi e, ha l’obiettivo di individuare i soggetti che più potrebbero beneficiare del trattamento farmacologico; si è inoltre dimostrato utile ai fini epidemiologici in diverse regioni del mondo (Matthews et al., 2004). La sua sensibilità può essere compromessa a causa della variabilità individuale
nella risposta anticorpale nei confronti dell’infezione da A. perfoliata. Infatti, come è possibile osservare dalla Tabella 4.5 e 4.5 a dei risutati, anche nel presente studio il test ELISA non è stato in grado di discriminare tra veri e falsi positivi (Hoglund et al., 1995; Proudman e Trees, 1996b).
In due cavalli (n 10 e 12) risultati negativi al coprologico (Tabella 4.5), è stato riscontrato un titolo anticorpale alto, sebbene l’esame molecolare abbia confermato la negatività dei campioni.
Analogamente, il siero di un cavallo (n 17) risultato negativo al coprologico ma positivo alla PCR (Tabella 4.5) presenta un titolo anticorpale moderato e corrispondente ai titoli osservati in quattro dei nove campioni risultati negativi all’esame coprologico. Per quanto riguarda gli animali trattati, dai dati ottenuti sembra che un titolo anticorpale alto persista anche dopo tre mesi dal trattamento nel 50% dei campioni di siero testati. Infatti, l’esame sierologico ha individuato come positivi questi campioni riportando un titolo anticorpale corrispondente un’infestazione di grado elevato, mentre gli stessi cavalli sono risultati negativi alle altre due tecniche.
inaffidabilità soprattutto quando ci si trova di fronte a cambiamenti dello stato parassitario degli animali come per esempio dopo il trattamento farmacologico.
Quindi l’esame sierologico (ELISA) per la ricerca di anticorpi verso antigeni escretori/secretori di A. perfoliata sembra non risultare molto attendibile per la valutazione del livello di infestazione del singolo animale, confermando le perplessità degli stessi autori che lo hanno messo a punto (Proudman e Edwards, 1992).
La variabilità della risposta anticorpale all’infestazione di questo parassita, il tasso di decadenza del livello anticorpale in cavalli post-trattamento con farmaci antiparassitari e le variazioni del sistema immunitario dell’ospite, infatti sono tutti fattori che possono alterare la sensibilità e la specificità di questo approccio diagnostico (Proudman e Edwards, 1992). Dai risultati dell’esame sierologico degli animali da noi esaminati è emerso che più della metà è ad alto rischio di forme cliniche gravi, sebbene durante questo studio nessuno dei cavalli inclusi nella ricerca abbia mai presentato segni clinici riferibili a colica.
In uno studio epidemiologico effettuato in Sardegna, in cui è stato fatto un confronto con la tecnica coprologica di Proudman ed Edwards (1992) e il test ELISA (Proudman e Tress, 1996), è stata evidenziata, una maggiore sensibilità del test siero-diagnostico rispetto al test copro-diagnostico, anche se non statisticamente significativa, ed una difficoltà di interpretazione in caso di cavalli negativi al test sierologico e positivi a quello coprologico, (Scala A. et al., 2001), questa evenienza non è stata riscontrata nel presente studio
Comunque, fino ad ora il test sierodiagnostico (ELISA) è stato l’ unico strumento diagnostico disponibile per individuare i cavalli con un’alta intensità di infezione (Hoglund et al., 1995; Proudman e Trees, 1996b) e, di conseguenza a rischio di colica.
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stata utilizzata la diagnosi molecolare mediante nested-PCR in campioni fecali di cavallo per la ricerca del DNA di A. perfoliata. Questa metodica si è rivelata promettentein cavalli naturalmente infetti. Infatti, i risultati ottenuti indicano che la nested PCR sviluppata da Drogemuller e collaboratori (Drogemuller et al, 2004) per l’amplificazione del DNA di A. perfoliata in campioni fecali di cavallo artificialmente addizionati di campioni di tessuto
del parassita, può rappresentare una valida metodica per la diagnosi molecolare specifica dell’infestazione da A. perfoliata nel cavallo.
In particolare, la specificità del set primer AP-ITS-2-3F/AP-ITS-2-2R, precedentemente valutato da Drogemuller et al. (2004) per l’ amplificazione diagnostica solo del DNA di A. perfoliata, è stata confermata nel presente lavoro verso una serie di diversi campioni di
DNA, di Ossiuridi, Ciatostomini, Habronema, Draschia e Gasterophilus spp.
Poiché il set primer interno non è stato valutato per il DNA di Anoplocephala magna (Drogemuller et al., 2004), i risultati positivi di PCR non specifici non possono essere esclusi. Tuttavia, le condizioni di alta stringenza del protocollo molecolare e le caratteristiche della distanza nucleotidica del DNA ribosomiale del parassita (Drogemuller et al., 2004), permette di considerare il test di nested-PCR con il set di primer S18/L3T e
AP-ITS-2-3F/AP-ITS-2-2R il più potente approccio specie-specifico per la diagnosi dell’infezione di A. perfoliata nei cavalli.
Tutti i campioni fecali risultati positivi all’esame coprologico, sono risultati positivi anche alla PCR, inoltre i dati risultati da questo studio sembrano indicare una più bassa sensibilità del test coprologico.
Infatti, un campione risultato negativo all’analisi coprologica è invece risultato positivo alla nested PCR
Riguardo l’efficacia del trattamento farmacologico, i risultati negativi ottenuti sia con l’esame coprologico sia con la nested-PCR su alcuni campioni fecali di animali trattati con Equimax® (VIRBAC), indicano la sua efficacia.
Il controllo di alcuni campioni con l’esame coprologico ha evidenziato la persistenza di negatività dei soggetti fino ad un mese dalla somministrazione del farmaco.
Solo 4 /41 campioni sono risultati positivi all’esame coprologico dopo il trattamento; in questi casi, però, la raccolta del campione dopo il trattamento aveva superato il mese di attesa previsto dallo studio. Non si può escludere anche la possibilità di una non corretta somministrazione del farmaco; infatti la contemporanea positività per gli Strongili gastrointestinali, oltre che di uova A. perfoliata, e l’appartenenza di tutti questi campioni risultati positivi dopo il trattamento ad animali dello stesso allevamento, fa presupporre una non corretta somministrazione del farmaco o di un errato dosaggio.
La negatività riscontrata sia con l’analisi coprologica che con la nested PCR dei campioni fecali di altri cavalli trattati con Equimax®, prelevati dopo 15 giorni dal trattamento, sembra invece confermare l’efficacia di questo farmaco per il trattamento delle infestazioni da A. perfoliata nel cavallo.
