DEFINIZIONE DI ANTIBIOTICO
Per antibiotico si intende una
molecola naturale
,
metabolita secondario di Eubatteri, Actinomiceti e
Funghi
inferiori
,
prodotta
in
coincidenza
della
differenziazione di strutture cellulari specializzate
per
la sopravvivenza microbica quando il substrato è
esaurito
Servono nuovi antibiotici perche’:
- Sono aumentati i ceppi resistenti in circolazione (basti pensare ai ceppi
multiresistenti di Staphylococcus aureus!!).
- Numerosi antibiotici attualmente esistenti andrebbero migliorati in
termini di: maggiore attivita’, minore tossicita’; diminuzione degli
effetti collaterali; piu’ ampio spettro di azione; maggior selettivita’ nei
confronti di alcuni patogeni.
- Va inoltre ricordato che in alcuni settori non sono ancora disponibili
antibiotici adatti (alcune forme di micosi, alcuni virus e forme tumorali)
Antibiotici naturali
Antibiotici di
semisintesi (il caso di
numerose penicilline e
Actinomiceti produttori di antibiotici
Actinomicina Amfotericina Bleomicina Cloramfenicolo Eritromicina Kanamicina Josamicina Midecamicina Mitomicina Neomicina Nystatina Paromomicina Rifamicina Spiramicina Streptomicina Tetracicline Tobramicina Viomicina Adicillina* Cefamicina C** Nocardicina A Acido clavulanico Tienamicina CarpetimicinaStreptomiceti
Micromonospora
Gentamicina Ristocetina VancomicinaNocardia
Un batterio puo’ produrre anche piu’ di un composto, da un ceppo di
Micromonospora sono stati isolati ben 50 metaboliti secondari!!!
In natura perche
’
un batterio dovrebbe mai sovraprodurre un
metabolita secondario quale un antibiotico?
E’ stata l’azione sinergica tra l’approccio genetico e quello di ottimizzazione
delle condizioni di fermentazione ad aver decretato il successo di numerose
produzioni industriali di antibiotici!!
Fu Marvin Johnson (Wisconsin) ad esempio a scoprire che per stimolare
l’overproduzione di penicillina in P.chrysogenum il glucosio doveva
essere sostituito dal lattosio
Consideriamo il caso di Ashbya gossypii che oggi produce nella
fermentazione industriale 40,000 volte piu’ riboflavina di quanto richiesto
per la crescita o di Pseudomonas denitrificans che produce un eccesso di
Fonte di carbonio: utilizzo di galattosio per la produzione di
actinomicina, citrato per la bacitracina, saccarosio per la cefalosporina C. Glucosio al posto del citrato nel caso della fermentazione della
novobiocina.
Le modificazioni del terreno possono consentire l’ottimizzazione
del processo produttivo:
Fonte di azoto: interferenza dei sali di ammonio nella produzione di
cefalosporina C e penicillina G. Interferenza della lisina nelle
fermentazioni di penicillina e cefalosporina e della glutammina nella produzione di acido gibberellico. Utilizzo di asparagina, arginina e glutammato come fonti non interferenti.
L’utilizzo dell’antimetabolita azaleucina nei processi di produzione di bacitracina, un antibiotico la cui formazione e’ stimolata dalla leucina, ha consentito l’isolamento di un mutante in cui la transaminasi B e’derepressa (aumento del 400 % del titolo dell’antibiotico in soluzione).
Utilizzo di antimetaboliti
Nella produzione di monensina da
Streptomyces cinnamonensis, l ’ aggiunta
degli antimetaboliti 2-amino- 3-clorobutirrato e di norleucina consente di avere un rapporto tra le due forme di monensina A e B pari a 9:1 anziche’ 1:1.
Criteri generali per la produzione di antibiotici:
Coltura sommersa in bioreattori il cui design spesso si rivela cruciale per il
processo. La produzione di antibiotici e’ generalmente un processo a piu’
fasi
Sviluppo Biomassa
(stadio vegetativo)
trofofase
Sviluppo Biosintetica
(stadio di produzione)
idiofase
Miglioramento dei ceppi produttori di antibiotici
1) Mutagenesi
random
• uso di radiazioni ionizzanti o agenti mutageni • ottimizzazione dei protocolli di uso:
mortalità tra 60-90% coincide con la massima frequenza di mutazioni puntiformi
2) Approccio molecolare (gene-specifico)
• identificazione dei geni codificanti la via biosintetica • Identificazione degli steps lenti
• sovra-produzione degli E che catalizzano gli steps lenti o introduzione di nuovi catalizzatori
nuovi prodotti!
I ceppi industriali attuali risultato di circa 50 anni di miglioramenti
Le percentuali di miglioramento diminuiscono con gli anni!
L’applicazione della tecnica di mutazione e selezione al
problema della produzione di penicillina…
Penicillum notatum Penicillum chrysogenum
Ceppo Wisconsin
resa: 0.6-1.2 mg PenG/litro di coltura resa: 1-2 mg PenG/litro di coltura
Penicillum chrysogenum resa: 120 mg PenG/litro di coltura
Ceppi attuali in uso
Penicillum chrysogenum
resa: 10-50 g PenG/litro di coltura
Mutante spontaneoAddizione agenti mutageni
Selezione di mutanti superproducenti
Il caso della penicillina
Vanno sotto il nome di penicilline tutti quegli antibiotici che presentano la struttura chimica
generale (I) e , quindi, considerabili come N-acilderivati dell’acido 6-amminopenicillico (6-APA).
La penicillina agisce come antibiotico inibendo la sintesi della parete cellulare delle cellule batteriche
in fase di crescita. Infatti, essa interagisce con l’enzima transpeptidasi, responsabile della
Stadio vegetativo condotto in terreno ricco, per favorire lo sviluppo
microbico senza che vi sia produzione di antibiotico. Corn step liquor come fonte di N (contiene fattori di crescita e
precursori per la catena laterale).
Rischio di contaminazione a causa del terreno molto ricco
in questa prima fase!!
Stadio di produzione condotto in coltura fed-batch che permette tramite
l’aggiunta di piccole quantita’ di glucosio nel tempo, di evitare I fenomeni di inbizione da prodotto.
Rischio di formazione di schiuma con limitazione del
volume utile, necessita’ di ampio volume in testata.
Il bioreattore utilizzato deve garantire una buona ossigenazione ed una efficiente agitazione per garantire l’omogeneita’ colturale senza provocare danni al micelio.
Il pH deve essere accuratamente controllato altrimenti si rischia l’inattivazione della penicillina!
