CAPITOLO 5: DISCUSSIONE
La veicolazione di un acido nucleico in una cellula target specifica offre l’opportunità di trattare diverse patologie agendo direttamente sul genoma e sviluppando nuovi approcci terapeutici e vaccinali basati sull’espressione di opportuni geni eterologhi nelle cellule bersaglio.
Tra le diverse tecniche elaborate nel corso degli anni per migliorare l’efficacia e la stabilità del gene delivery, i vettori virali hanno riscosso un ampio successo grazie alla loro efficienza e specificità. I virus infatti, nel corso dell’evoluzione, hanno sviluppato un valido meccanismo per il rilascio e l’espressione del proprio acido nucleico all’interno di cellule target con un alto grado di selettività grazie alla specificità di legame tra il recettore cellulare e l’antirecettore virale. Virus opportunamente ingegnerizzati potrebbero, quindi, risultare un ottimo mezzo per la veicolazione e l’espressione di geni eterologhi in cellule di un tessuto specifico.
Tra le diverse famiglie di virus, i lentivirus sono quelli che hanno suscitato maggior interesse per la loro capacità di integrarsi nel genoma della cellula ospite garantendo un’espressione a lungo termine del transgene; inoltre, rispetto agli altri retrovirus, i lentivirus hanno evoluto un meccanismo attivo di trasporto del genoma al nucleo che garantisce loro la possibilità di infettare anche cellule quiescenti quali appunto le dendritiche.
I primi vettori lentivirali realizzati sono stati quelli basati su HIV (Naldini et
al., 1996) che si sono rilevati altamente efficienti sia in vitro che in vivo
(
Kordower et al., 2000; Consiglio et al., 2001; Baekelandt et al., 2002). Il vettore viene fornito alle cellule attraverso un sistema split component in cui le varie regioni del genoma virale sono suddivise in più plasmidi, in modo da ridurre al minimo la probabilità di ricombinazione e di formazione di una particella wild-type. Sono solitamente presenti un costrutto vettore che contiene il transgene e le sequenze cis agenti necessarie per la retrotrascrizione, l’integrazione e l’incapsidamento dell’RNA, un costrutto diper il ciclo vitale del virus vettore e un costrutto codificante per le glicoproteine dell’involucro virale.
Poiché FIV è un lentivirus molto simile ad HIV che infetta naturalmente il gatto inducendo una sindrome simile all’AIDS umana ma non infetta l’uomo, è stato deciso di sfruttare le sue caratteristiche per sviluppare un vettore FIV-derivato che unisce ai vantaggi funzionali di HIV, un maggior livello di sicurezza dovuto al suo tropismo specie specifico. FIV, infatti, infetta primariamente linfociti CD4+ e macrofagi felini (Elder et al., 1998) e non è mai stata riportata sieroconversione o malattia da FIV nell’uomo nonostante ripetute e documentate esposizioni al virus (Willett et al., 2003). Se da un lato il ristretto tropismo di FIV fornisce un ulteriore livello di sicurezza, dall’altro pone il problema di adattare un modello felino all’uomo.
Un primo passo per superare questo ostacolo è stato fatto utilizzando, nel sistema split-component, un plasmide codificante per un’envelope eterologa che facilita l’accesso a diversi istotipi cellulari. In particolare è stata utilizzata la proteina G del VSV, che legandosi ad un fosfolipide di membrana garantisce un ampio tropismo d’ospite.
Inoltre l’LTR all’estremità 5’ del costrutto di packaging e del costrutto vettore, che ha bassa attività in cellule umane, è stata sostituita con il promotore del CMV. Mentre nel costrutto di packaging l’LTR è stata sostituita interamente, nel costrutto vettore, che è l’unico che deve essere incapsidato, sono state mantenute le regioni R e U5 che contengono sequenze essenziali affinché possa avvenire la retrotrascrizione, l’integrazione e l’incapsidamento del vettore di trasferimento.
Al fine di ridurre al minimo le componenti virali presenti nel vettore, sono state eliminate tutte le porzioni di genoma non necessarie. Nel vettore di trasferimento sono stati, quindi, deleti i geni accessori vif ed ORF-A, non indispensabili per la produzione e la funzionalità del vettore (Johnston et al., 1999), e le ORF di gag, pol ed env, fornite in trans dal packaging.
E’ stato, invece, mantenuto il sistema Rev/RRE necessario per esportare l’RNA virale dal nucleo al citoplasma e produrre alti titoli virali (Johnston et
trasferimento è stata conservata la sequenza RRE, mentre la proteina Rev viene fornita solamente dal packaging.
Nel costrutto vettore è stato poi inserito un polylinker che ha favorito il successivo clonaggio della cassetta d’espressione CMV-GFP, il cui gene
reporter (GFP) è stato utilizzato per determinare l’efficienza del vettore.
A ulteriore garanzia di sicurezza, il costrutto vettore è stato reso
self-inactivating attraverso la delezione di una regione regolatoria interna di 130
bp nell’U3 del 3’LTR. Con il processo di retrotrascrizione la delezione è stata trasferita anche al 5’ e questo implica che il vettore integrato nel genoma delle cellule trasdotte è in grado di esprimere solo il gene sotto controllo del promotore interno. Questo fatto è di notevole rilevanza perché permette di mantenere costante l’espressione del transgene pur eliminando l’attività virale e le possibili interazioni con il genoma della cellula ospite.
La soppressione dell’attività trascrizionale dell’LTR, infatti, non solo previene la sintesi di un RNA full length contribuendo a ridurre al minimo la possibilità di formazione di un virus replicazione-competente, ma riduce anche il rischio di mutagenesi inserzionale a seguito dell’attivazione dell’espressione dei geni cellulari nelle regioni localizzate immediatamente a valle del 3’LTR.
Al fine di ottimizzare il sistema, è stato realizzato un secondo costrutto vettore contenente il cPPT. Questa regione è stata identificata e caratterizzata in HIV (Charneau et al., 1994) e interviene nel processo di retrotrascrizione. Il cPPT è anche coinvolto nel trasporto attivo al nucleo del complesso di pre-integrazione, aumentando il numero di molecole in grado di passare attraverso la membrana nucleare e di integrarsi nel genoma dell’ospite. Poiché è stato dimostrato che vettori HIV-derivati contenenti il cPPT manifestano livelli di trasduzione maggiori rispetto a quelli che ne sono privi (VandenDriessche et al., 2002), si è pensato di introdurre un’analoga sequenza, identificata recentemente anche in FIV (Whitwam et al., 2001), nel costrutto vettore realizzato nel nostro laboratorio, nel tentativo di aumentare l’efficienza di trasduzione.
Entrambi i costrutti sono stati caratterizzati in vitro ed è stata analizzata l’efficienza di trasfezione e trasduzione su diversi istotipi cellulari.
Il primo costrutto caratterizzato è stato quello privo del cPPT con il quale sono state trasfettate CrFK e 293T. L’efficienza di trasfezione è stata misurata in base alla quantità di cellule GFP positive rilevata mediante analisi al FACS e alla quantità di proteina capsidica (p25) prodotta, attraverso il test ELISA.
Le 293T sono un tipo cellulare ampiamente utilizzato in questo settore perché altamente trasfettabili, infatti la percentuale di cellule GFP positive, analizzata a 2 giorni dalla trasfezione, si è sempre dimostrata 3-4 volte più alta rispetto a quella ottenuta su CrFK. Tuttavia la quantità di p25 prodotta è risultata sempre maggiore su CrFK che su 293T, ad indicare che l’espressione delle proteine strutturali è stata più efficiente nelle cellule feline. La spiegazione di questo risultato è probabilmente attribuibile alla più bassa efficienza del sistema Rev/RRE in cellule eterologhe.
Questo sistema è necessario per il trasporto intraplasmatico degli mRNA virali che presentano, nella loro sequenza, regioni inibitorie che non consentono l’uso del normale pathway cellulare.
I dati della p25 trovano conferma nella percentuale di trasduzione analizzata a 4 giorni, in cui le cellule che hanno fornito il risultato migliore sono state le CrFK trasdotte con il surnatante prelevato dalle CrFK trasfettate, mentre la percentuale minore di cellule GFP positve è stata misurata sulle 293T trasdotte con il surnatante delle 293T trasfettate. Risultati intermedi sono stati ottenuti nei casi in cui CrFK sono state trasdotte con il surnatante delle 293T e viceversa. Questi dati suggeriscono che il sistema funziona bene sulle cellule feline, in cui le percentuali di trasduzione sono risultate piuttosto elevate, ma che il vettore FIV-derivato è anche in grado di trasdurre cellule eterologhe, sebbene a livelli subottimali rispetto a quelli rilevati su cellule specie-specifiche.
Le cellule trasdotte sono state mantenute in coltura per circa un mese e periodicamente è stata analizzata la quantità di cellule GFP positive e la produzione di p25. La fluorescenza osservata a 4 giorni dalla trasduzione, infatti, potrebbe essere dovuta ad un erroneo incapsidamento della proteina durante la formazione della particella vettore (pseudo-trasduzione). L’analisi periodica delle cellule GFP positive, effettuata ad intervalli regolari, ha
invece evidenziato una percentuale di trasduzione costante nel tempo, suggerendo che il vettore si è integrato nel genoma della cellula ospite e che vi è un’espressione a lungo termine di GFP.
Parallelamente è stata misurata la produzione di p25 che è sempre risultata uguale a zero, segnale che non è avvenuta ricombinazione con formazione di particelle virioniche e che il vettore è effettivamente replicazione-difettivo. Questo dato è confermato dalla periodica osservazione al microscopio delle CrFK in cui non è mai stata rilevata la presenza di sincizi cellulari.
In seguito CrFK e 293T sono state trasdotte con entrambi i costrutti SIN CMV-GFP e SIN cPPT per paragonare l’efficacia dei due costrutti e vedere se l’inserimento del cPPT comportava un incremento dell’efficienza di trasduzione del vettore. In questo esperimento i vettori sono stati prodotti solo su 293T. Infatti, al fine di utilizzare il vettore come strumento di vaccinazione nell’uomo, è preferibile che l’envelope virale contenga glicoproteine di membrana umane, in modo da ridurre possibili attacchi da parte del sistema immunitario. I due vettori sono stati utilizzati per trasdurre CrFK e 293T e la percentuale di trasduzione è stata analizzata a 4 giorni mediante analisi al citofluorimetro.
Ancora una volta, la percentuale di cellule GFP-positive è risultata più elevata su CrFK che su 293T per entrambi i costrutti. Sorprendentemente, il vettore privo del cPPT si è rivelato nettamente più efficiente del SIN cPPT riportando percentuali di trasduzione circa 3 volte maggiori sia su CrFK che su 293T, ad indicare che l’inserimento di questa sequenza riduce l’efficienza di trasduzione del vettore, al contrario di quello che accade in HIV.
Possibili spiegazioni di questo risultato possono essere ottenute analizzando la p25 prodotta dai due costrutti a 2 giorni dalla trasfezione. Infatti, nonostante la percentuale di trasfezione, misurata in base alle cellule GFP-positive, sia apparsa pressoché identica per i due costrutti, la produzione di p25 nel vettore senza il cPPT è risultata circa il doppio di quella ottenuta dal SIN cPPT.
E’ quindi possibile che questa sequenza interferisca, in qualche modo, con la produzione del capside virale o con l’incapsidamento del RNA, ma è anche verosimile che il cPPT di FIV non svolga lo stesso ruolo cha ha in HIV.
Il cPPT di FIV, infatti, ha una sequenza diversa rispetto alla sua controparte nell’U3, mentre sia in HIV che in Visna virus queste due sequenze sono identiche; questa divergenza potrebbe indicare che forse il cPPT di FIV non è coinvolto nel complesso di pre-integrazione o non è implicato nella retrotrascrizione come invece avviene per HIV.
Tuttavia, l’assenza di una specifica caratterizzazione della sequenza cPPT in FIV permette solo di fare delle ipotesi sulla sua possibile funzione.
Dati i risultati insoddisfacenti del costrutto contenente il cPPT, per i successivi esperimenti è stato utilizzato solo il costrutto privo di questa sequenza.
L’efficienza del vettore è in fase di valutazione su altre cellule eterologhe quali le NIH 3T3 e le SRC. Sono state scelte cellule murine e di coniglio in previsione di utilizzare questi animali come possibili modelli per le applicazioni in vivo del vettore.
