3. MATERIALI
E
METODI
3.1 Soggetti sperimentali
Per gli esperimenti di questa tesi sono stati utilizzati ratti maschi albini, ceppo Wistar, dell’età di circa 70 giorni e di peso corporeo medio di 340 grammi.
Gli animali sono stati stabulati singolarmente in gabbie di acciaio inossidabile poste in una stanza nella quale l’illuminazione seguiva il normale ciclo luce-buio diurno, mantenuta ad una temperatura costante di 20 ± 1° C. I ratti avevano sempre accesso libero a cibo e acqua. Gli animali sono stati divisi in due gruppi: un primo gruppo di 7 ratti, ciascuno sottoposto a CFC (gruppo sperimentale) ed un secondo gruppo di animali, con le stesse caratteristiche di peso e di età, costituito da 7 animali mai entrati nell’apparato di condizionamento (gruppo di controllo o naïve).
3.2 Procedure
comportamentali
3.2.1 Apparecchiatura sperimentale
Per indurre le risposte di immobilità è stato impiegato un modello base di Skinner box (Modular operant cage,Coulborn Instrument Inc). Il soffitto e i 2 lati paralleli sono di alluminio, gli altri 2 lati, di cui uno apribile per consentire l’ingresso dell’animale, sono di plastica
trasparente. Il pavimento è composto di barrette d’acciaio inossidabile, connesse con un dispositivo atto a produrre scosse elettriche (Grid Floor Shocker,Coulborn Instrument Inc,Model E13-08). L’apparato di condizionamento è connesso ad un sistema per programmare gli stimoli (Scatola di comando Arco 2340 – U.Basile) e posto all’interno di una cabina acusticamente isolata (3,5 1.8 2.1 m), mantenuta a una temperatura costante di 20± 1 C°. L’intensità dell’illuminazione nella stanza è di 60 Lux .
Fig. 5: foto originale della Skinner box
3. 2. 2 Procedura di condizionamento al contesto
Il giorno 1 a partire dalle 11 a.m., ciascun animale del gruppo sperimentale è stato prelevato manualmente dalla propria gabbia di stabulazione, posto in un contenitore dalle pareti di plastica opache e
trasportato nella stanza acusticamente isolata. Il soggetto è stato inserito all’interno dell’apparato di condizionamento, che nel nostro caso rappresenta il CS e lasciati indisturbati per 3 minuti. Trascorso questo periodo di tempo, all’animale è stato somministrato uno stimolo US rappresentato da scosse elettriche (footshocks) di 0.5 mA della durata di un 1s. Questo stimolo è stato presentato 7 volte ad intervalli regolari di 30 s. Dopo 2 minuti dal termine delle presentazione degli stimoli, l’ animale è stato riportato nelle propria gabbia di stabulazione. Al termine della sessione di addestramento, quindi, ciascuno dei 7 soggetti sperimentali, è rimasto all’interno dell’apparato di condizionamento per un tempo complessivo di 8 minuti. Durante il condizionamento sono state osservate risposte di immobilità attraverso una telecamera a circuito chiuso da una stanza adiacente a quella del condizionamento.
3.3 Manipolazioni chirurgiche
Il giorno 3, dopo 48 h dal condizionamento, gli animali condizionati e i controlli (mai entrati nell’apparato di condizionamento) sono stati anestetizzati con etere e sacrificati tramite decapitazione. I loro cervelli sono stati isolati in condizioni sterili a bassa temperatura e rapidamente suddivisi in tre porzioni: frontale, medio-temporale e cerebello-bulbare (vedi Figura 6). Tutte le sezioni sono state inserite in crio-tube e immediatamente congelate in azoto liquido e conservate a –80 ° C.
Fig.6: Sezioni operate sul cervello dei ratti
3.4 Estrazione
dell’RNA
L’RNA totale è stato estratto dalla porzione medio-temporale del cervello degli animali condizionati e dei controlli. Questa sezione cerebrale contiene sedi neurali importanti nei processi di apprendimento e di memoria, ed in particolare nelle risposte apprese di paura al contesto come l’ippocampo, l’amigdala e la corteccia peririnale. L’RNA totale è stato isolato dal cervello degli animali condizionati e dei controlli, ottimizzando la metodologia descritta da Chirgwin (Chirgwin, Przybyla, MacDonald and Rutter; 1979), come descritto da Traina (Traina, Valleggi, Bernardi, Rizzo, Calvani,
Nicolai, Mosconi, Durante and Brunelli; 2004). Per minimizzare la contaminazione da RNAsi, sono state utilizzate soluzioni trattate con DEPC (dietilpirocarbonato). I campioni sono stati omogeneizzati con un omogenizzatore Ultra-Turrax, immediatamente dopo essere stati immersi nel tampone GITC. L’omogenato è stato caricato su un gradiente di CsCl 5,7M. Il gradiente è stato centrifugato in ultracentrifuga ( Beckman L8-70M, con rotore Kontron TY65) a 40.000 rpm a 20 °C per 25 ore. Il pellet è stato solubilizzato in H20DEPC e precipitato con 0,1 volumi di Sodio Acetato 3 M pH 6,4 e 2,2 volumi di Etanolo Assoluto per una notte a –20 °C. In seguito il campione è stato centrifugato a 13.000 rpm in centrifuga (con rotore Kontron A8.24) per 30 minuti e il pellet lavato con Etanolo al 70% per eliminare i sali residui. L’RNA è stato quindi solubilizzato in un opportuno volume H20DEPC. I campioni sono stati conservati a -80°C per le analisi successive.
SOLUZIONI UTILIZZATE: Tampone GITC guanidina tiocianato 4 M sodio citrato 25 mM pH 7,0 β-mercaptoetanolo 0,1 M N- lauril sarcosinato 0,5% (p/v) Cloruro di Cesio 5,7M cloruro di cesio 5,7 M sodio acetato 25 mM pH 6,4
3.5 Isolamento dell’mRNA poliA
+Per l'isolamento dell’mRNA poliA+ è stato usato il PolyATtract
mRNA Isolation Systems (Promega). Il sistema utilizza un primer
oligo(dT) biotinilato che ha la capacità di ibridare ad alta efficienza con la regione al 3' poliA+ presente nella maggior parte dei mRNA eucariotici maturi. Gli ibridi possono poi essere recuperati usando particelle paramagnetiche (PMP) associate a streptavidina (che ha la capacità di legarsi alla biotina) ed un supporto magnetico. Circa 1 mg di RNA totale in un volume di 500 µl di H2ODEPC è stato denaturato per 10 min a 65°C; sono stati aggiunti 3 µl di Biotinylated Oligo(dT)
Probe e 13 µl di SSC 20x (NaCl 3 M; Na-citrato 0,3 M); il tutto è stato incubato a temperatura ambiente fino a raffreddamento per permettere la reazione di appaiamento. Contemporaneamente le particelle PMP sono state lavate e risospese in SSC 0,5x ed aggiunte poi alla reazione di appaiamento lasciando incubare a temperatura ambiente per circa 10 min per permettere il legame tra la biotina e la streptavidina. Dopo che le particelle PMP sono state catturate e lavate con SSC 0,1x, gli mRNA sono stati eluiti risospendendo le particelle PMP in H2ODEPC e catturandole con il magnete.
La fase acquosa, contenente l’mRNA, è stata trasferita in una nuova provetta, precipitata e risospesa in 10 µl H2ODEPC.
3.6 Controllo della qualità dell’ mRNA poliA
+Gli mRNA poliA+ sono stati utilizzati per la costruzione delle librerie sottrattive di cDNA utilizzando la tecnica dell’ibridazione sottrattiva soppressiva (SSH). Al fine di rendere la sottrazione efficiente è necessario valutare il grado di contaminazione dell’mRNA da parte dell’rRNA (Sävenstrand, Broschè, Angehagen and Strid; 2000). Per valutare la contaminazione dell’mRNA è stata effettuata una retrotrascrizione reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) su una piccola quantità di ciascun mRNA poliA+, utilizzando 3 set di primers specifici per l’rDNA di ratto (5,8 S; 18 S e 28 S), le cui sequenze sono state trovate in banca dati (dati non mostrati).
3.7 Costruzione delle librerie sottrattive
Per ottenere sequenze di cDNA differenzialmente espresse è stato utilizzato il metodo della ibridazione soppressiva sottrattiva (suppression subtractive hybridization, SSH), la cui attuazione è stata resa possibile dall’impiego del PCR-Select
cDNA Subtraction Kit
(BD Biosciences). Questa metodologia permette di comparare due campioni di mRNA e ottenere librerie di cDNA arricchite di trascritti presenti soltanto in uno dei due campioni (Diatchenko, Lau, Campbell, Chenchik, Moqadam, Huang, Lukyanov, Lukyanov, Gurskaya, Sverdlov and Siebert; 1996) e presenta la peculiarità di riuscire ad isolare anche sequenze poco espresse (Gurskaya, Diatchenko, Chenchik, Siebert, Khasperov, Lukyanov, Vagner,Ermolaeva, Lukyanov and Sverdlov; 1996). La tecnica della SSH comprende due ibridazioni sottrattive, seguite da due reazioni di PCR. Nella figura 3 è rappresentato in modo schematico il processo della SSH : ci riferiamo con il termine tester al cDNA ottenuto dall’mRNA isolato dal cervello di ratto condizionato e con il termine driver all’cDNA ottenuto dall’mRNA del controllo. Il cDNA è stato sintetizzato a partire da 2 µg di mRNA di entrambi i campioni ed è stato digerito con l’enzima di restrizione Rsa I, per ottenere frammenti
blunt-end. Il cDNA del tester è stato suddiviso in due aliquote ed a
ciascuna è stato legato un diverso adattatore: 1 e 2R. Gli adattatori, mancando del gruppo fosfato al 5’, si legano solo all’estremità 5’ del cDNA e non possono associarsi tra loro. Sono seguite due ibridazioni sottrattive successive. Tester A Tester B Ligation con adattatore 1 Ligation con adattatore 2R Tester I IBRIDAZIONE I IBRIDAZIONE Driver denaturato in eccesso II IBRIDAZIONE d d c c b b a a Driver in eccesso
a, b, c, d, + e Amplificazioni utilizzando i primers e (II PCR) Amplificazioni utilizzando il primer (I PCR)
Fig.7: Rappresentazione schematica della tecnica della SSH. Per la legenda vedere tabella n.
La prima è stata effettuata aggiungendo a ciascun tester denaturato,
driver denaturato in eccesso. Durante questa fase la maggior parte dei
Amplificazione esponenziale E A Nessuna amplificazione o Amplificazione lineare B C D Effetto Soppressivo Nessuna amplificazione
trascritti del tester non differenziali, si lega al driver e la rimanente frazione del tester, che rimane a singolo filamento risulta arricchita di sequenze differenzialmente espresse. Inoltre in questo passaggio la concentrazione delle sequenze poco e molto espresse viene normalizzata, perché, essendo la cinetica di ibridazione di secondo ordine, la riassociazione delle molecole più concentrate è più veloce. La seconda ibridazione è stata effettuata unendo, senza denaturare, i prodotti della prima ibridazione e aggiungendo driver denaturato in eccesso. Durante questo passaggio, oltre ad arricchirsi di sequenze differenzialmente espresse, la frazione a singolo filamento del tester 1 ibriderà con la stessa frazione nel tester 2R, formando una popolazione di sequenze differenzialmente espresse a doppio filamento caratterizzate dal fatto di essere asimmetricamente fiancheggiate dai due adattatori. Questo, insieme all’effetto soppressivo, rende possibile la loro amplificazione selettiva tramite due PCR successive utilizzando come primers sequenze complementari ai due adattatori.
primer sequenza Legenda figura
PCR 1 5’–CTAATACGACTCACTATAGGGC- 3’ NESTED 1 5’ –TCGAGCGGCCGCCCGGCAGGT- 3’
NESTED 2R 5’ –AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT- 3’
Tab.1: Sequenze primer utilizzati per la costruzione delle librerie.
Questa tecnica ha, quindi, permesso la costruzione di due librerie sottrattive:
Libreria Forward
:
ottenuta utilizzando come tester il cDNA del condizionato e come driver il cDNA controlloLibreria Reverse:
ottenuta utilizzando come tester il cDNA controllo e come driver il cDNA del condizionatoLa libreria forward contiene i prodotti dei geni che sono attivati o modulati positivamente dal condizionamento alla paura al contesto, mentre la libreria reverse contiene i prodotti dei geni inibiti o modulati negativamente in questa forma di apprendimento. L’efficienza di sottrazione è stata valutata mediante PCR con primer della gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (G3PDH), gene costitutivo, come suggerito dal protocollo del PCR-Select
cDNA Subtraction Kit (BD
Biosciences).
I prodotti ottenuti dalla seconda amplificazione (seconda PCR) sono stati inseriti nel vettore di clonaggio PCR® II-TOPO vector (TOPO
TA Cloning® kit, Invitrogen).
I cloni sono stati recuperati in microtetraplates da 96 pozzetti contenenti 65 µl di LB A+, sono stati messi a crescere per una notte in agitazione orizzontale a 37°C e, dopo l’aggiunta di 50 µl glicerolo, sono stati conservati a –20°C.
3.8 Screening primario delle librerie
(colony pcr screening)
3.8.1 Amplificazione delle sequenze differenziali
1 µl di colonia è stato messo a crescere per 2 ore in 50 µl di LB A+ liquido a 37°C su agitatore orizzontale. La coltura è stata amplificata mediante PCR utilizzando EuroTaq (EuroClone), in un volume di 25 µl usando le seguenti condizioni: 1 µl della coltura è stato utilizzato come stampo, poi sono stati aggiunti 2,5 µl di tampone 10x PCR
EuroClone; 0,25 µl di dNTP Mix 10 mM; 0,25 µl di Primer M13F 10 µM; 0,25µl di Primer M13R 10 µM; 2,5 µl di soluzione 25 mM di MgCl2; 0,25 µl di EuroTaq DNA Polymerase, 5U/µl; H2O sterile a volume. La reazione così composta è stata posta nel termociclizzatore (Applied Biosciences GeneAmp PCR System 2700) ed è stata iniziata l’amplificazione con la denaturazione dello stampo a 94°C per 10 min seguita da 30 cicli così composti: 94°C per 30 sec, 55°C per 30 sec, 72°C per 90 sec; al termine dei cicli è stata fatta seguire una estensione finale a 72°C per 10 min.
I prodotti di PCR sono stati analizzati su gel di agarosio al 2% (vedi fig.5 par 4.1).
Primer M13 sequenze
M13 L 5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’
M13 R 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’ Tab. 2: Sequenze dei primer M13
3.8.2 Spot Blot del prodotto di PCR
1 µl del prodotto di PCR di ciascun clone è stato denaturato (95oC per 1 min) e trasferito su membrana Hybond N+ (Amersham Biosciences). Le membrane così ottenute sono state fissate mediante Hoefer™ UVC 500 cross-linker (Amersham Biosciences).
Lo screening primario, mediante la tecnica degli Spot Blot, ha permesso di eliminare i cloni falsi positivi, interpretando i risultati secondo il protocollo descritto nel PCR Select Differential Screening kit User Manual (BD Biosciences). In seguito è stato isolato il DNA plasmidico ed è stato realizzato il sequenziamento tramite sequenziatore automatico.
3.8.3 Marcatura delle sonde
Le membrane sono state ibridate utilizzando come sonde i cDNA che costituiscono le liberie forward (sonda T-C) e reverse (sonda C-T) marcate con marcatura non radioattiva, utilizzando DIG DNA
Labelling Kit (ROCHE).
Per la marcatura del cDNA circa 0,1-1µg del prodotto della seconda PCR sono stati digeriti con Rsa I per eliminare gli adattatori 1 e 2R da ogni sequenza di cDNA .
Per la marcatura del cDNA sono stati denaturati circa 0,1-1 µg di cDNA digerito in 15 µl di H2O (100°C) e dopo averli raffreddati in ghiaccio sono stati aggiunti:
2 µl di esanucleotidi, 2 µl di dNTP, 1 µl di Klenow. Dopo una incubazione per tutta la notte a 37°C, la reazione polimerasica è stata interrotta aggiungendo 2 µl di Na2EDTA 0,2 M (pH 8,0).
Il cDNA è stato precipitato con 2,5 µl di LiCl 4 M, 75 µl di Etanolo Assoluto freddo; questa reazione è stata lasciata per 1 ora a -80°C. Successivamente il cDNA è stato centrifugato a 12.000 g per 40 min a 4°C ed il pellet è stato lavato 2 volte con etanolo al 70%. Dopo i lavaggi il pellet, asciugato all'aria, è stato solubilizzato in 50 µl di H2O sterile.
3.8.4 Ibridazione su filtro
La membrana è stata preibridata per circa 3 ore nell'apposito termostato (20 ml di soluzione di preibridazione per circa 100 cm2 di membrana) alla temperatura di 68°C.
La sonda marcata è stata denaturata in H2O a 100°C per 10 minuti e poi posta immediatamente in ghiaccio. Successivamente è stata preparata la soluzione di ibridazione aggiungendo la sonda marcata (25 ng/ml) a una nuova soluzione di preibridazione. Si è proceduto quindi con l’ibridazione.
Nella soluzione di preibridazione e in quella di ibridazione sono stati aggiunti come “competitori”, gli stessi primers e oligonucleotidi con sequenza ad essi complementare, precedentemente utilizzati per la costruzione delle librerie sottrattive (vedi fig.3) ad una concentrazione finale pari a 0,1 µM. Mediante questo procedimento è stato possibile eliminare i falsi positivi, evitando ibridazioni tra eventuali adattatori rimasti nelle sonde T-C e C-T ed il cDNA in esame.
La sonda è stata recuperata e le membrane sono state sottoposte ad una serie di lavaggi a diversa stringenza, in dipendenza dell'omologia della sonda e della sua composizione (% in G+C).
La membrana è stata lavata due volte in SSC 2x/SDS 0,1% per 20 min a temperatura ambiente, in agitatore orizzontale.
Poi, aumentando la stringenza, è stata lavata due volte in SSC 0,1x/SDS 0,1% per 20 min a 68°C, in agitatore orizzontale. Quindi è stata equilibrata per 5 min con il tampone 1 e incubata per 1 h in lenta agitazione con il tampone 2. Successivamente è stata posta per 30 min in lenta agitazione in una soluzione contenente l'anticorpo anti-digossigenina, diluito 1:10.000 nel tampone 2. In seguito sono stati effettuati, 2 lavaggi di 20 min nel tampone 1 a cui è stato aggiunto
Tween 20 ad una concentrazione finale pari allo 0,3%; quindi la
membrana è stata equilibrata per 5 min con il tampone 3.
Utilizzando il metodo della visualizzazione chemioluminescente si è proceduto in camera oscura cospargendo la membrana, adagiata in una pellicola trasparente, con Lumigen CPD* (ROCHE) diluito 1:100 nel tampone 3 (circa 1 ml per membrane di 100 cm2).
Il tutto è stato lasciato al buio per 5 min a temperatura ambiente, quindi è stata tolta la soluzione in eccesso. Sulla membrana è stata posta una lastra radiografica Hyperfilm
β-max (Amersham
Biosciences). Questa è stata lasciata in esposizione per circa 20
minuti. Successivamente la lastra radiografica è stata sviluppata e fissata con le soluzioni Kodak (seguendo le istruzioni fornite dalla ditta).
SOLUZIONI UTILIZZATE
:
Tampone 1
NaCl 0,15M
Acido maleico 0,1M
Portare a pH 7,5 con NaOH e autoclavare Blocking stock solution
Sciogliere il Blocking reagent fornito dalla ditta nel tampone 1 Conservare a –20°C Soluzione di preibridazione SSC 5x Blocking reagent 1% SLS 0,1% SDS 0,02% Tampone 2
Blocking Stock Solution, diluita 1:10 nel tampone 1 Tampone 3 Tris-HCl 100 mM, pH=9,5 NaCl 100 mM SSC 20x NaCl 3 M Na-Citrato 0,3 M
Portare a pH 7,0 con acido citrico e autoclavare SDS 10%
3.9 Preparazione del DNA plasmidico su piccola scala
(miniprep)
Il DNA plasmidico è stato estratto e purificato utilizzando Wizard
PLUS SV Minipreps DNA Purification System.
I cloni sono stati inoculati in grainer contenenti 10 ml di LB liquido e ampicillina alla concentrazione di 50 µg/ml e fatti crescere a 37°C su agitatore rotante per una notte. Per ogni clone, 5 ml di coltura sono stati centrifugati a 10000 rpm per 5 minuti, in centrifuga da tavolo ALC 4226 in un rotore ALC 5531 (questo tipo di centrifuga viene utilizzato per tutta la preparazione). Successivamente le cellule sono state risospese delicatamente in 250 µl di Cell Suspension Solution, fornito nel kit. Sono stati poi aggiunti 250 µl di Cell Lising Solution, fornito nel kit; il campione è stato delicatamente mescolato per inversione, e lasciato a temperatura ambiente per 5 min. Sono stati aggiunti 10 µl di Alcaline Protease Solution e il campione è stato delicatamente mescolato per inversione e lasciato a temperatura ambiente per 5 min.
La Alcaline Protease inattiva le endonucleasi e altre proteine rilasciate durante la lisi delle cellule batteriche che potrebbero danneggiare la qualità del DNA isolato. Al campione sono poi stati aggiunti 350 µl di
Wizard Plus SV Neutralization solution ed immediatamente il
campione è stato mescolato delicatamente per inversione. Il tutto è stato centrifugato a 14.000 g per 1 min. Il surnatante così ottenuto è stato posto delicatamente sulle colonnine fornite nel kit e centrifugato a 14.000 g per 1 min. Sono stati aggiunti 750 µl di Column Wash
solution, fornito nel kit, e centrifugato a 14.000 g per 1 min. La
procedura di lavaggio è stata ripetuta utilizzando 250 µl di Column
Wash solution e centrifugando le colonnine a 14.000 g per 2 min. Le
colonnine sono state poste in provette sterili e si è proceduto all’eluizione del DNA con 75 µl di H2O sterile. L’operazione è stata ripetuta una seconda volta Si è proceduto alla quantizzazione del materiale allo spettrofotometro e su gel di agarosio.
SOLUZIONI UTILIZZATE
:
Ampicillina
soluzione stock 10mg/ml solubilizzata in Etanolo 70% LB (Luria-Bertani) liquido Triptone 1,0% Yeast extract 0,5% NaCl 1,0% pH 7,0 con NaOH
3.10 Analisi delle sequenze
Le sequenze nucleotidiche dei cloni selezionati sono state analizzate mediante comparazione in banca dati (GenBank) con i programmi disponibili in rete: • FASTA: (http://www.ebi.ac.uk/fasta33/) • BLAST: (http://www.ch.embnet.org/software/aBLAST.html) • ADVANCEDBLAST: (http://www.ch.embnet.org/software/aBLAST.html)
3.11 Analisi di espressione tramite RT-PCR relativa
La retrotrascrizione con la successiva PCR (RT-PCR) permette l’amplificazione di mRNA cellulare: vista l’elevata sensibilità, l’RT-PCR permette di valutare anche cambiamenti piccoli ma fisiologicamente rilevanti nell’espressione genica (Gause and Adamovicz; 1995).
L’ RT-PCR relativa consente di comparare la quantità di un trascritto tra più campioni mediante la coamplificazione della sequenza di interesse e di un controllo interno al fine di normalizzare le differenze tra i vari campioni dovute alla qualità dell’ RNA totale, alla variabilità
dell’efficienza dell’RT o ad una quantizzazione non accurata (Gause & Adamovicz; 1995). Per questo tipo di PCR semi-quantitativa è necessario che i primers per l’amplificato del gene di interesse (target) e quelli per il controllo interno siano compatibili e che i pesi molecolari del target e del controllo interno siano simili ma tali da permettere la distinzione degli amplificati su gel d’agarosio. Per questo tipo di analisi è necessario che la reazione di PCR venga analizzata durante la fase lineare dell’amplificazione prima che entrambi i prodotti di amplificazione raggiungano la fase di plateau ossia di saturazione (Prediger; 2001)
La retrotrascrizione è stata eseguita con il kit SuperScript™ II RNase
H- Reverse Transcriptase (Invitrogen) e con l’ Oligo(dT)12-18 Primer
(Invitrogen) seguendo le istruzioni fornite dalla ditta, partendo
da RNA totale (2µg) isolato dal cervello di ratto condizionato e dal controllo. Al fine di evitare errori di quantificazione dovuti ad una diversa concentrazione di RT o errori di pipettamento, è stato opportuno utilizzare un controllo interno, che viene coamplificato con il gene in esame. Come controllo interno è stata utilizzata la G3PDH che, essendo un gene costitutivo, presenta un’uguale espressione nel condizionato e nel controllo. Per amplificare le sequenze dei cloni in esame sono stati utilizzati primers gene-specifici; le cui sequenze dei sono riportate nella tabella X. I
primers sono stati scelti in modo da amplificare un frammento di peso
molecolare di 452 pb per la G3PDH, di 263 pb per 1VH5, 275 pb per 1VB9 e 251pb per 1VA6.
Per ogni reazione di amplificazione da 25 µl sono stati utilizzati 1 µl di retrotrascritto come stampo; 2,5 µl del tampone di reazione 10x; 0,625 µl di soluzione di MgCl2 50mM; 0,5 µl di dNTP Mix 10mM;
1,25 µl di ogni primer 10µM, 0,25 µl Euro Taq (EuroClone) 5U/µl, H2O sterile a volume. La reazione così composta è stata posta nel termociclizzatore ed è stata iniziata l’amplificazione con la denaturazione dello stampo a 94°C per 4 min seguito da cicli così composti: 94°C per 30 sec, 60°C per 30 sec, 72°C per 30 sec per un campione di cDNA trattato e un campione di cDNA controllo; al termine dei cicli è stata fatta seguire una estensione a 72°C per 7 min a tutti i campioni.
Per conoscere il punto di saturazione, ovvero il punto in cui l’aumento del prodotto di amplificazione non è più proporzionale alla quantità di stampo iniziale, è stata effettuata una PCR dalla quale sono state sottratte aliquote di campione al termine di cicli successivi; le aliquote sono state immediatamente trasferite in un termociclizzatore adiacente dove hanno subito la fase di estensione finale di 7 min a 72°C. In questo modo è stato possibile stabilire il numero di cicli appropriato per una valutazione quantitativa relativa mediante questa tecnica. Per ogni gene in analisi sono state fatte prove multiple di RT-PCR relativa utilizzando come stampo cDNA ottenuti sia da retrotrascrizioni diverse sia da estrazioni diverse (in particolare per il clone 1VA6 sono state fatte 4 prove; per il clone 1VH5 7 prove e per il clone 1VB9 6 prove).
I prodotti di PCR sono stati analizzati su gel di agarosio 3% colorato con Etidio Bromuro. Gli amplificati sono stati quantizzati mediante scansione diretta del gel di agarosio al 3% mediante il programma di acquisizione per immagini Quantity One-4.4.1 (basic) BioRad.
Tab. 3: Sequenze dei primers utilizzati nella RT-PCR relative.
Primer sequenze
G3PDH L 5’- ACCACAGTCCCATGCCATCAC-3’ G3PDH R 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’ 1VH5 L 5'-5’-GAAATGAGCAGTGGGTGCTT-3’ 1VH5 R 5'-AAGGGACTCCAAGTGTGTCG-3’ 1VB9 L 5'-AAACATTGCATTTACATTTGAGC-3’ 1VB9 R 5'-CAGGCAGGACTAGGGAGACTT-3’ 1VA6 L 5'-CCTCTTTCATTACCCCCACA-3’ 1VA6 R 5'-ATGGGGAAGAAGCCCTAGAA-3’ 3.11.1 Analisi statistichePer normalizzare i campioni relativamente alla quantità di RNA totale utilizzato e alla efficienza della sintesi di cDNA, è stato fatto il rapporto tra le intensità delle bande di amplificazione dei vari campioni e la media dei prodotti di amplificazione della G3PDH. Questo rapporto è stato calcolato per un minimo di 4 esperimenti indipendenti. E’ stata effettuata poi l’analisi statistica con il Mann-Whitney test (clone 1VA6) e T-test (clone 1VH5 e 1VB9).
