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Materiali e metodi
Colture cellulari
Le colture dei ceppi L-2D, Vieste e POR7 sono state mantenute alla temperatura ottimale di 20-22 °C e cibate con l’alga verde Dunaliella tertiolecta allevata in acqua di mare naturale sterilizzata e arricchita con la soluzione di Walne. Prima di essere usate, le colture sono state mantenute in assenza di cibo per circa 2-3 giorni e risospese per 6-12 ore in sola acqua di mare alla concentrazione di circa 104 cellule/ml.
Estrazione e purificazione dei feromoni dal sopranatante delle colture cellulari
Le preparazioni di sopranatante sono state ottenute rimuovendo le cellule in sospensione nelle colture mediante filtrazione su filtri di carta e il sopranatante “cell-free” così ottenuto è stato successivamente filtrato su cartucce con porosità di 0.2 µm per eliminare tutto il materiale particolato in sospensione. Le proteine in soluzione nel sopranatante sono state adsorbite su cartucce a fase inversa Sep-Pak C18 (due litri di sopranatante per ogni cartuccia) e queste
eluite con 2 ml di 30% (v/v) di 2-propanolo. Il pool di eluati è stato poi frazionato mediante cromatografia su gel filtrazione utilizzando una colonna Superdex-Peptide (Pharmacia Biotech) con 50 mM Tris-HCl, pH 7.8, contenente NaCl 0.5 M, ad un flusso costante di 0.25 ml/min. Le frazioni contenenti proteine con massa molecolare compresa tra 4 e 12 KDa sono state raccolte e di nuovo frazionate mediante passaggio su una colonna a scambio ionico Mono-Q HR 5/5 (Pharmacia Biotech), con un gradiente lineare di 0-0.4 M NaCl in Tris-HCl 20 mM a pH 7.8, a flusso costante pari a 0.5 ml/min. Successivamente è stata effettuata la spettrometria di massa MALDI-TOF.
Estrazione di DNA e RNA
Le preparazioni di DNA sono state ottenute partendo da colture di circa 2 litri di cellule, centrifugate a 2500 rpm per 5 minuti. I pellet cellulari sono stati risospesi in un uguale volume della soluzione di lisi contenente Tris-HCl 10 mM pH 9.5, EDTA 0.5 M, 1% SDS e 0.2 mg/ml di proteinasi K, e incubati a 50 °C per 16 ore. Il DNA è stato poi estratto dai lisati cellulari due volte con una miscela (1:1) di fenolo e cloroformio e una volta con cloroformio, ed è stato infine precipitato con due volumi di etanolo assoluto. Il DNA così ottenuto è stato risospeso in 500 μl di tampone TE (Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM), incubato con RNasi A per un’ora a 37 °C al fine di eliminare l’RNA presente, sottoposto ad una estrazione con miscela di fenolo e cloroformio, e in ultimo nuovamente precipitato con metà volume di una soluzione contenente PEG al 40% e MgCl
230 mM. Il pellet finale è stato risospeso in
acqua e la concentrazione di DNA presente nella soluzione quantizzata allo spettrofotometro. Per lo studio dell’RNA le cellule sono state centrifugate a 2500 rpm per 5 min e i pellet cellulari ottenuti sono stati risospesi in 1 ml del reagente TRIzol (Invitrogen). Questi pellet sono stati incubati per 5 min a temperatura ambiente per ottenere una completa lisi cellulare. L’RNA contenuto nel lisato cellulare è stato estratto con cloroformio, precipitato con isopropanolo, lavato in etanolo al 75% e risospeso in 20 µl di acqua “RNase free” per essere poi quantizzato allo spettrofotometro secondo la formula che prevede: concentrazione (μg/μl) = (A
260 x 40 x 500)/1000. Per eliminare eventuali tracce di DNA, la soluzione acquosa
contenente RNA è stata incubata con l’enzima DNasi I alla concentrazione di 1 unità per μg di RNA per circa 1 ora a 37 °C, in presenza di inibitore dell’RNasi (RNasi RiboBlock inhibitor). L’RNA messaggero è stato infine purificato dal totale su una colonnina fornita nel kit “Illustra QuickPrep Micro mRNA purification” della GE Healthcare.
RLM-RACE
Le procedure utilizzate per l’analisi degli mRNA sono quelle del kit FirstChoise® RLM-RACE fornito dall’Ambion. Questa tecnica, denominata RLM-RLM-RACE da “RNA Ligase Mediated Rapid Amplification of cDNA Ends”, si divide in due parti: la prima è specifica per identificare le terminazioni 5’ degli mRNA, la seconda specifica per le terminazioni 3’ (Figura 24).
Figura 24. Schema della procedura 3’ e 5’ RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) utilizzata per amplificare gli RNA messaggeri relativi ai geni dei feromoni.
Nella 5’ RACE, l’RNA è stato trattato con l’enzima fosfatasi alcalina di vitello (CIP, da “Calf Intestine Alkaline Phosphatase”) per rimuovere (senza intaccare la struttura del 5’ “cap” presente negli mRNA integri) il 5’-fosfato da molecole di rRNA, mRNA frammentato, tRNA e DNA genomico eventualmente presenti come contaminanti nella preparazione di RNA. L’RNA è stato poi trattato con la pirofosfatasi acida di tabacco (TAP, da “Tobacco Acid Pyrophosphatase”) per rimuovere il cap dagli mRNA e lasciare un 5’-monofosfato. All’RNA così trattato, con l’enzima T4 ligasi è stato aggiunto un oligonucleotide adattatore di
RNA di 45 basi alla regione 5’ (Quest’ultima reazione non può avvenire negli RNA defosforilati, quindi negli mRNA non integri a cui viene rimosso il 5’-fosfato attraverso l’azione dell’enzima CIP). In questo modo l’adattatore è stato legato solo a molecole di mRNA non degradate. Queste molecole di mRNA sono state poi trattate con l’enzima trascrittasi inversa per la sintesi di DNA complementare. Il cDNA è poi usato direttamente come templato in reazioni di amplificazione, che hanno sfruttato la sequenza nota dell’adattatore come sito specifico per due oligonucleotidi utilizzati come “forward primer”.
Nella 3’RACE, un oligonucleotide adattatore, contenente una sequenza ripetuta di 18 dT complementare alle code poly(A) degli mRNA, è stato utilizzato direttamente in reazioni di retrotrascrizione.
Condizioni standard di PCR
Tutte le reazioni di amplificazione sono state effettuate in un termociclatore “Mastercycler epgradient” (Eppendorf AG, Hamburg), usando come primer oligonucleotidi sintetizzati dalla ditta Invitrogen. Le denominazioni e le sequenze degli oligonucleotidi utilizzati nelle reazioni di PCR sono riportati nella Tabella 1. Ogni reazione di PCR è stata allestita in un volume finale di 50 μl, contenente 0.5 μg di DNA o cDNA come templato, KCl 50 Mm, Tris-HCl 20 mM a pH 8.4, MgCl
21.5 mM, 200 μM di ciascun deossiribonucleotide trifosfato, 0.2 μM di
ciascun primer, e 1 U di Taq Polymerase ad alta fedeltà (“High Fidelity Triple Master Taq polymerase” della ditta Eppendorf).
Come regola generale, ogni reazione ha comportato 35 cicli, ciascuno con una fase di denaturazione a 94 °C per 30 secondi, una di “annealing” per 40 secondi, e una di “elongation” a 72 °C di durata variabile da 30 secondi a 1 minuto, in base alla lunghezza attesa del frammento. La temperatura di “annealing” è stata fatta variare da 55 a 60 °C in base
alla coppia di primer utilizzati nella reazione. Alla fine dei 35 cicli, la reazione è stata incubata per ulteriori 7 min a 72 °C.
Nelle reazioni di RATE-PCR, il primer TEL corrispondente alla sequenza telomerica è stato aggiunto alla reazione al 20° ciclo, per aumentare l’amplificazione del gene d’interesse ed evitare la produzione di prodotti aspecifici. L’amplificato è stato corso su gel d’agarosio a 1,7 % per circa 1 ora ed a voltaggio costante (100 Volts) e poi colorato con una soluzione di bromuro di etidio che, intercalandosi tra le molecole di DNA, ne determina la fluorescenza agli UV visibile al trans-illuminatore.
Tabella 1. Primer usati nelle reazioni di PCR
Denominazione sequenza (5’ 3’) TEL(FW/RV) 5’- CCCCAAAACCCCAAAACCCC-3’ 5’ Outer 5’-GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3’ 5’ Adapter 5’- GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUU UGAUGAAA-3’ 5’ Inner 5’-CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3’ Oligo(dT)-linker 5′-GAG AGA GAG AGA GAG AGA GAA CTA GTC TCG ATG T (17)-3’ Primer specifici per il gene del feromone Ec-α:
FW1 5’- GATGATCATTGCCCAACWGAYGT-3’ RV1 5’- ACYTCYTCRTAATTTCCTTGATTATA-3’ FW2 5’- TATAACCAAGGAAATTAYGARGARGT-3’ RV2 5’- ACRTCWGTTGGACAATGATCATC-3’ FW3 5’- GGACTGTGAACACTAAGTTGAATAATTA-3’ RV3 5’- GAGTGTCAAAGATAATATTGATTTAATTTTTATTT-3’ EcFWA 5’-GATAGATGTGGCCATATGTGTG-3’ EcFWB 5’-GCCTCGAGTGGTATATAAAGTGAGAGT-3’
Primer specifici per il gene del feromone Ec-1: FW1 5’-GGATGYTTYGGATGYGCWCCWAC-3’ FW2 5’-CCAACYATYTGYCARTTYTGYGARGC-3’ RV1 5’-GCYTCRCARAAYTGRGARATWGTWGG-3’ RV2 5’-GTWGGWCRCATCCRAARCARCC-3’ FW3 5’-GCTCAACCTCACCTCCAA-3’ RV3 5’-AATCTGCAGCACTACTTGACGA-3’ EcFWA 1 5’-TATCAAGCCTCACGAGGAGC-3’ EcFWB 1 5’-TACCTTGACTTCTCGATGTCCTG-3’ EcRV 1 5’-GACAAATAGTAGGTGCACAGCCA-3’
Clonaggio e sequenziamento genico
I frammenti di DNA amplificato sono stati purificati con il kit “Jetquick PCR purification spin” (Genomed) e successivamente clonati nel vettore pCR 2.1 TOPO utilizzando il kit “TOPOTM TA Cloning” (Invitrogen). Per la trasformazione delle cellule competenti di E. coli (One Shot DH5αTM-T1R TOP10 F’chemical competent cells) è stato seguito il protocollo fornito dalla ditta. Le colonie batteriche trasformate sono state selezionate in terreno di coltura LB contenente ampicillina (100 μg/ml) e i cloni contenenti il frammento d’interesse sono stati evidenziati grazie alle differenti colorazioni bianco e blu. I plasmidi contenenti i frammenti genici d’interesse sono purificati con il kit “Jetquick Plasmid Miniprep Spin” e preparati per il sequenziamento, che è stato effettuato dalla ditta Bmr Genomics di Padova. Infine le sequenze ottenute sono state analizzate mediante software specifici come Chromas, Clustal W e BioEdit al fine di ottenere informazioni utili sulla sequenza degli mRNA trascritti dal gene di interesse.
