4. Risultati
4.1. Estrazione del DNA e gel test
Il DNA è stato estratto ottenendo risultati soddisfacenti in tutti i 99 campioni analizzati. I risultati di un gel test sono riportati in Fig. 3 dove su un gel di agarosio sono stati fatti correre 15 campioni e due marker di riferimento:
DNA del fago λ alla concentrazione di 50 e 100 ng.
Grazie al confronto con lo standard è stato possibile valutare la quantità di DNA presente nei vari campioni ed effettuare le opportune diluizioni prima degli esperimenti di amplificazione.
Fig.3. Gel elettroforesi sul quale sono stati fatti correre i campioni di DNA di 15 miceli sterili.
A: λ-DNA 50 ng, B: λ-DNA 100 ng.
A B
4.2. Amplificazione del DNA mediante PCR con il primer M13
L’amplificazione del DNA estratto con il primer M13 è stata ottenuta con successo da tutti i campioni analizzati. I prodotti amplificati fatti correre su gel di agarosio 1,2% hanno dato risultati soddisfacenti in quanto, tutti i 99 campioni hanno mostrato fingerprinting chiari, ripetibili e ben confrontabili tra loro. In ogni esperimento di amplificazione è stato aggiunto un controllo senza DNA per verificare che non vi fossero contaminazioni con DNA estraneo, controllo che è sempre risultato negativo.
I fingerprinting ottenuti hanno mostrato un numero di bande compreso tra 4 e 9, negli isolati campionati dal terreno sabbioso, e tra 4 e 13, negli isolati provenienti dal terreno argilloso. Tutti i campioni sono stati amplificati almeno due volte, ottenendo sempre gli stessi risultati.
Gli isolati provenienti dal terreno sabbioso e dal terreno argilloso sono stati analizzati separatamente, confrontando i fingerprinting ottenuti da ciascun isolato, e già da un confronto visivo dei vari bandeggi è stato possibile individuare isolati che mostravano fingerprinting identici.
L’analisi dei gel elettroforetici, per ogni terreno, è stata effettuata
riportando i fingerprinting, ottenuti per ogni individuo, dopo opportuno
confronto con il marker, su carta millimetrata, questo ha permesso la costruzione
della matrice binaria (0 = assenza della banda; 1 = presenza della banda) con la
4.3. Dereplicazione dei miceli sterili isolati dal terreno sabbioso
Nelle Figure 4 e 5 sono riportati alcuni esempi di fingerprinting ottenuti a seguito dell’amplificazione del DNA con il primer M13 di alcuni isolati provenienti dal terreno sabbioso. Nella Fig. 4 tutti i fingerprinting sono risultati diversi tra loro mentre nella Fig. 5 si possono osservare alcuni fingerprinting identici che corrispondono ad isolati dereplicati.
Tutte le bande ottenute dai fingerprinting dei 42 campioni provenienti dal terreno sabbioso, sono state numerate da 1 a 29, in base al loro peso molecolare, rispettivamente dalla più pesante alla più leggera e dalla matrice binaria è stata ottenuta la matrice di somiglianza utilizzando il coefficiente di Jaccard.
L’analisi della matrice ha dato risultati molto simili a quelli ipotizzati dall’analisi dei gel e dei fingerprinting ottenuti, riportati su carta millimetrata;
infatti laddove gli isolati si sono mostrati repliche del medesimo individuo, i coefficienti di similarità presentavano percentuali pari a 100 (i valori della matrice di somiglianza vanno da 0,00 a 1,00, che corrispondono allo 0% e al 100% di similarità).
L’analisi del dendrogramma ottenuto con il metodo UPGMA, riportato
in Fig. 6, ha reso più semplice l’individuazione delle repliche degli isolati
provenienti dal terreno sabbioso. Sono stati ottenuti tre gruppi composti da 2
isolati (S C3 3A-S C3 26A; S C2 7A-S D2 8A; S D3 17A-S D3 26A), due gruppi
composti da 3 isolati (S C2 5A-S C1 3A- S D2 6A; S C2 24A-S C2 29A-S C2
30B), e un gruppo composto da 5 isolati (S C1 15A-S C1 17A-S C1 19A-S C1 19B-S C3 4A). Per ogni nodo, che raggruppa i vari individui in cluster, è possibile individuare la percentuale di somiglianza tra gli isolati.
Il coefficiente cofenetico è risultato pari a 0,92; tale valore, molto elevato sta a indicare una buona correlazione tra i dati della matrice e il dendrogramma.
Dall’analisi dei gel elettroforetici dei 42 campioni provenienti dal terreno sabbioso, è stato possibile individuare, inoltre, un cluster di 11 campioni (S C1 15A, S C1 17A, S C3 4A, S C1 19A, S C1 19B, S C1 4B, S C1 5B, S C1 3A, S C2 5A, S D2 6A, S C2 2A) che hanno mostrato fingerprinting molto simili tra loro. Dall’analisi della matrice di somiglianza e del dendrogramma, è stato osservato che la similarità tra questi 11 campioni era dell’80%. Il cluster è composto da due gruppi di isolati dereplicati e da individui non dereplicati ma che presentano percentuali di somiglianza elevate con gli altri campioni.
Nello schema di Fig. 7 sono evidenziati i bandeggi degli 11 isolati: è possibile osservare come sia alta la similarità tra i diversi campioni, differiscono infatti tra loro per la presenza o l’assenza di poche bande. Ad ogni numero corrisponde una banda.
I restanti isolati analizzati si raggruppano in cluster con percentuali di
similarità pari o inferiori al 60%.
Fig.4. Gel di elettroforesi di campioni di DNA amplificati con il primer M13 di alcuni isolati provenienti dal terreno sabbioso. In questo gel ciascun isolato ha mostrato un fingerprinting diverso. M: marker 1 kb DNA ladder, C: controllo, A: S C1 7A, B: S C1 21A, D: S C1 22A, E: S C1 25A, F: S D1 27A, G: S C3 5A.
C M
A B D E F G
3000 2500 2000
1500
1000
750
500
Fig.5 Gel elettroforesi di campioni di DNA amplificati con il primer M13 di alcuni isolati provenienti dal terreno sabbioso. In questo gel sono presenti tre isolati diversi che mostrano lo stesso fingerprinting (A,F,G). M: marker 1 kb DNA ladder, C: controllo, A: A D2 8A, B: A C3 5A, D: A C3 21A, E: A C3 23A, F: A D1 26A, G: A C2 12A..
A B D E F G
3000 2500 2000
1500
1000
750
500
C M
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
S C1 27A S C2 3A S C2 16A S C3 3A S C3 26A S C2 7A S D2 8B S D3 2A
S C3 24A S D3 30A S C2 9C S D3 5A S C1 15A S C1 17A S C1 19A S C1 19B
S C2 2A S C2 5A S C1 3A S D2 6A S C1 4B S C1 5B S D1 27A S C2 20A S C2 24A S C2 29A S C2 30B S C2 10A S D3 6A S C2 11B S D3 15A S D3 14A S C1 21A S C1 7A S D3 16A S C2 30A S C1 25 A S C3 5A S C1 22A Similarità
Fig.6. Analisi cluster degli isolati provenienti dal terreno sabbioso. Il dedrogramma è stato ottenuto utilizzando il metodo UPGMA e il coefficiente di similarità Jaccard. Ogni nodo sta ad indicare la percentuale di similarità tra i diversi miceli sterili appartenenti a un cluster.
Coefficiente cofenetico = 0,92. In fucsia sono evidenziati i gruppi di isolati dereplicati.
S C3 4A S D3 17A S D3 26A
Concludendo, i campioni che presentavano una similarità del 100% e che dunque rappresentavano il medesimo individuo sono risultati:
S C3 3A-S C3 26A S C2 7A-S D2 8A S D3 17A-S D3 26A
S C2 5A-S C1 3A- S D2 6A S C2 24A-S C2 29A-S C2 30B S C1 15A-S C1 17A-S C1 19A S C1 19B-S C3 4A
Generalmente gli isolati che mostrano fingerprinting identici, provengono da paglia trattata con Deossinivalenolo (D), o da paglia non trattata (C). Tuttavia due gruppi sono costituiti da miceli sterili isolati da paglia in presenza e in assenza di DON.
Dei 42 campioni analizzati ne sono stati dereplicati 11, possiamo dire quindi che il campione di isolati proveniente dal terreno sabbioso è costituito da 31 miceli sterili diversi, che tra loro presentano, in alcuni casi, percentuali di somiglianza elevate, ma non pari a 100. Dall’analisi dei campioni provenienti dal terreno sabbioso la percentuale di dereplicazione è stata del 26%.
1 individuo 1 individuo
1 individuo
1 individuo
1 individuo
1 individuo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
Fig.7. Bandeggio ottenuto amplificando i campioni con il minisatellite M13. 1: S C1 15A, 2: S C1 17A, 3: A C1 19A, 4: S C1 19B, 5: S C3 4A, 6: S C2 5A, 7: S D2 6A, 8: S C1 3A, 9: S C2 2A, 10: S C1 4A, 11:
S C1 5B. Sono apprezzabili i due gruppi di isolati identici (N.1-5 e N. 6-8), gli individui con fingerprinting unici (N. 9-11) e la somiglianza dei bandeggi ottenuti in seguito a corsa elettroforetica. Le bande fucsia rappresentano il bandeggio comune a tutti i campioni.
4.4. Dereplicazione dei miceli sterili isolati dal terreno argilloso
Nella Figura 8 sono riportati alcuni esempi di fingerprinting ottenuti a seguito dell’amplificazione del DNA con il primer M13 di alcuni isolati provenienti dal terreno argilloso. Si possono osservare alcuni fingerprinting identici che corrispondono ad isolati dereplicati (A e B), isolati con fingerprinting molto simili (F e G) e isolati con fingerprinting unici (C, D e E).
Dall’analisi della matrice di somiglianza infatti, è emerso che il primo gruppo è realmente costituito da individui che presentano il medesimo fingerprinting, il secondo invece, è costituito da due individui distinti tra loro, ma con una percentuale di similarità alta (80%).
Tutte le bande ottenute dai fingerprinting dei 57 campioni provenienti dal terreno sabbioso, sono state numerate da 1 a 39, in base al loro peso molecolare, rispettivamente dalla più pesante alla più leggera e dalla matrice binaria è stata ottenuta la matrice di somiglianza utilizzando il coefficiente di Jaccard.
Anche in questo caso l’analisi della matrice ha dato risultati molto
simili a quelli ipotizzati dall’analisi dei gel e dei fingerprinting ottenuti, riportati
su carta millimetrata; infatti laddove gli isolati si sono mostrati repliche del
medesimo individuo, i coefficienti di similarità presentavano percentuali pari a
100, (i valori della matrice di somiglianza vanno da 0,00 a 1,00, che
L’analisi del dendrogramma ottenuto con il metodo UPGMA, riportato in Fig. 8, ha reso più semplice l’individuazione delle repliche degli isolati provenienti dal terreno argilloso. Sono stati ottenuti 9 gruppi composti da 2 isolati (A D1 13A-A D1 20A, A D1 10A-A D1 12A, A C3 29A-A C3 30A, A D3 14A-A D3 17A, A D2 26A-A D2 29A, A C1 29A-A C1 23A, A D1 15A-A D122B, A C1 16A-A C1 30A, A C3 4A-A C3 17A), 3 gruppi composti da 3 isolati (A C1 7A-A C1 9B-A C1 21A, A C1 22A-A C128 A-A D3 4A, A D2 12A-A D2 13A-A D2 15A), e 1 gruppo composto da 4 isolati (A C2 12A-A C2 13A-A C2 15A-A D1 26A). Per ogni nodo che raggruppa i vari individui in cluster, è possibile individuare la percentuale di somiglianza tra gli isolati.
Il coefficiente cofenetico è risultato pari a 0,92; tale valore, molto elevato sta a indicare, una buona correlazione tra i dati della matrice e il dendrogramma.
Dall’analisi dei gel elettroforetici dei 57 campioni provenienti dal
terreno argilloso, è stato possibile individuare, inoltre, due cluster
rispettivamente di 5 (A C2 12A, A C2 13A, A C2 15A, A D1 26A, A D2 8A) e 6
isolati (A C1 7A, A C1 9B, A C1 21A, A D2 12A, A D2 13A, A D2 15A) con
fingerprinting molto simili e percentuali di similarità pari a 88 e 75.
Fig.8. Gel di elettroforesi di campioni di DNA amplificati con il primer M13 di alcuni isolati provenienti dal terreno argilloso. In questo gel sono presenti due isolati che mostrano lo stesso fingerprinting (A e B) due isolati che mostrano un fingerprinting molto simile (F e G) e tre
A B C D E F G M
2500
1500
1000
750
500 3000
2000
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Similarità
A C2 12A A C2 13A A C2 15A A D1 26A A D2 8A A D2 1A A D1 2A A D3 7A A C3 4A A C3 17A A C3 29A A C3 30A A D2 30A A D1 10A A D1 12A A C1 9A A C1 23A A D2 5B A D2 10A A D3 14A A D3 17A A C1 17A A C1 25A A C1 30A A C2 16A A C2 23A A C2 30A A C3 3A A C1 6A A C1 7A A C1 9B A C1 12A A D2 12A A D2 13A A D2 23A A C1 22A A C1 28A A D3 4A A D1 13A A D1 20A A C3 11A A C3 16A A C1 4A A C3 19A A C3 23A A D1 15A A D1 22B A D2 3A A C1 19A A D3 5B A C1 20A A C1 2A A D2 26A A D2 29A A C2 3A A C3 5A A C3 21A
Fig.9. Analisi cluster degli isolati provenienti dal terreno argilloso. Il dedrogramma è stato ottenuto utilizzando il metodo UPGMA e il coefficiente di similarità Jaccard. Ogni nodo sta ad indicare la percentuale di similarità tra i diversi miceli sterili appartenenti a un cluster. Coefficiente cofenetico = 0,92. In celeste sono evidenziati i gruppi di isolati dereplicati.
Il cluster di 5 isolati è composto da un gruppo di isolati dereplicati e da 1 individuo non dereplicato che presenta, tuttavia, una percentuale di somiglianza elevata con gli altri campioni. Il cluster di 6 isolati è composto da due gruppi di isolati dereplicati con una percentuale di somiglianza elevata tra i campioni.
I rimanenti isolati si sono raggruppati in numerosi cluster con una somiglianza inferiore al 60%.
Concludendo, i campioni che presentavano una similarità del 100% e che dunque rappresentavano il medesimo individuo sono risultati:
A D1 13A-A D1 20A A D1 10A-A D1 12A A C3 29A-A C3 30A A D3 14A-A D3 17A A D2 26A-A D2 29A A C1 29A-A C1 23A A D1 15A-A D122B A C1 16A-A C1 30A A C3 4A-A C3 17A
A C1 7A-A C1 9B-A C1 21A A C1 22A-A C128 A-A D3 4A
1 individuo 1 individuo 1 individuo 1 individuo 1 individuo 1 individuo 1 individuo
1 individuo 1 individuo 1 individuo
1 individuo
Anche in questo caso gli isolati che mostrano fingerprinting identici, generalmente, provengono da paglia trattata con Deossinivalenolo (D), o da paglia non trattata (C). Tuttavia due gruppi sono costituiti da miceli sterili isolati da paglia in presenza e in assenza di DON.
Dei 57 campioni analizzati ne sono stati dereplicati 20, possiamo dire quindi che il campione di isolati proveniente dal terreno argilloso è costituito da 37 miceli diversi, che tra loro presentano, in alcuni casi, percentuali di somiglianza elevate, ma non pari a 100. Dall’analisi dei campioni provenienti dal terreno sabbioso la percentuale di dereplicazione è stata del 35%.
4.5. Analisi degli isolati di specie note
E’ stato possibile confrontare i fingerprinting ottenuti dall’amplificazione del DNA estratto dagli isolati di specie note utilizzate come controllo interno. Anche per questi sono stati ottenuti risultati soddisfacenti in quanto essi hanno presentato fingerprinting chiari, ripetibili e diversi tra loro (similarità inferiori al 50%).
Sebbene il numero di specie prese in esame sia piuttosto limitato, i
risultati ottenuti possono essere considerati attendibili, visto che le tre specie di
Fusarium analizzate hanno evidenziato i valori di similarità più elevati, compresi
tra 30 e 50% (Fig. 10).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Similarità
F. equiseti
F. basilici
Pythium sp.
Mucor sp.
Fig.10 Analisi cluster degli isolati di specie note impiegate come controllo. Il dedrogramma è stato ottenuto utilizzando il metodo UPGMA e il coefficiente di similarità Jaccard. Ogni nodo sta ad indicare la percentuale di similarità tra i diversi isolati appartenenti a un cluster. Coefficiente cofenetico = 0,92.
F. graminearum Rhizoctonia solani
