Indice
2. MATERIALI E METODI... 52
1. Preparazione, trattamento e conservazione del materiale vegetale ... 53
1.1 Coltivazione delle piante... 53
1.2 Esposizione all’ozono ... 53
2. Isolamento degli acidi nucleici ... 54
2.1 Isolamento del DNA genomico dalle piante ... 54
2.2 Corsa elettroforetica su gel di agarosio ... 55
2.3 Isolamento dell’RNA totale ... 55
2.4 Corsa elettroforetica su gel di agarosio in condizioni denaturanti... 56
3. Reazione a catena della polimerasi (PCR) ... 56
4. Retrotrascrizione del mRNA (RT)... 57
5. RT-PCR Relativa ... 58
6. Clonaggio ... 59
6.1 Ligation... 59
6.2 Trasformazione di cellule di Escherichia coli con DNA plasmidico ... 59
7. Screening dei cloni (colony PCR)... 60
8. Isolamento del plasmide da cellule batteriche per mini preparazioni... 60
9. Digestione del DNA mediante enzimi di restrizione ... 61
10. Preparazione delle sonde... 61
10.1 Marcatura di un frammento di dna con metodo non radioattivo ... 62
11. Tecniche di trasferimento del DNA su membrana: Southern blotting ... 63
12. Ibridazione e lavaggi delle membrane ... 63
13. Rivelazione del segnale (Detection) ... 64
14. Stripping di una membrana: rimozione della sonda ... 65
15. Isolamento della sequenza promotrice del gene Ft32C-WAK H nel clone I-214 ... 65
16. Analisi delle sequenze... 66
17. Soluzioni utilizzate... 69
2. MATERIALI E METODI
1. Preparazione, trattamento e conservazione del materiale vegetale
1.1 Coltivazione delle piante
Talee di due cloni ibridi di pioppo (Populus deltoides x maximowiczii, clone Eridano, O3- sensibile, e P. x euramericana, clone I-214, O3-tollerante) sono state poste a radicare per quattro mesi in cella climatica in vasetti di plastica contenenti un substrato costituito da una miscela di suolo, torba e perlite (1:1:1 in volume), ad una temperatura variabile tra 20 e 23°C, con 70-85% di umidità relativa, fornendo una radiazione fotosinteticamente attiva (PAR: 400- 700 nm) con densità di flusso di fotoni pari a 530 µmol m-2s-1 mediante lampade ad incandescenza (Sylvania, Wembley, England) per un fotoperiodo di 14 h, in condizioni ottimali di rifornimento idrico, nutrimento e con aria filtrata attraverso carbone attivo. La radicazione è stata incrementata mediante immersione delle talee in una soluzione alcolica di acido indol 3-butirrico (250 ppm) per 3 minuti.
Le pianticelle che presentavano almeno dieci foglie pienamente espanse sono state selezionate per i trattamenti.
1.2 Esposizione all’ozono
Il trattamento con ozono è stato effettuato presso il Dipartimento Coltivazione e Difesa delle Specie Legnose, Sezione di Patologia Vegetale, dell’Università di Pisa.
L’esposizione delle piante all’O3 è stata effettuata in un impianto di fumigazione Perspex (Lorenzini et al. 1994) situato all’interno della camera di crescita (Bertagnin) ad una temperatura di 20 ± 1°C e con 85 ± 5 % di umidità relativa; all’altezza delle piante è stata fornita una radiazione fotosinteticamente attiva (PAR: 400-700 nm) con densità di flusso di fotoni pari a 530 µmol m-2 s-1, con fotoperiodo di 14 h.
L’O3 era generato attraverso scariche elettriche prodotte da uno specifico generatore (Fisher 500), raffreddato ad aria, su ossigeno puro e la sua concentrazione all’interno della camera
Le piante sono state mantenute alle condizioni presenti nella camera per 48 h per l’acclimatazione ed esposte ad un singolo pulse di 150 ppb di O3 per 5 ore, in forma di onda quadra. Le piante di controllo sono state mantenute alle stesse condizioni, eccetto che per il trattamento con l’ozono, all’interno della stessa camera di crescita.
Foglie giovani e foglie mature sono state prelevate dalle piante, rapidamente immerse in azoto liquido e conservate a –80°C.
I prelievi sono stati effettuati sia durante il trattamento (un prelievo ogni ora per cinque ore), che dopo 1, 4, 12, 24, 48 ore dal trattamento.
2. Isolamento degli acidi nucleici
2.1 Isolamento del DNA genomico dalle piante
Il DNA è stato isolato dalle foglie del controllo e del trattato delle due specie di pioppo, seguendo il metodo descritto in Doyle and Doyle 1989. In un mortaio le foglie sono state omogeneizzate in azoto liquido e lisate in CTAB (esadeciltrimetilammoniobromuro) 1 mL/g di tessuto a 60°C. L’omogenato, è stato incuba to a 60°C per 20 minuti agitando gentilmente ogni 5 minuti. L’estrazione è stata effettuata con cloroformio -alcool isoamilico (24:1). Dopo centrifugazione a 7.000 rpm per 15 minuti a 4°C, gli acidi nucleici sono stati precipitati dalla fase acquosa aggiungendo 2/3 di volume di isopropanolo freddo, quindi centrifugati a 7.000 rpm per 10 min a 4°C. Il pellet ottenuto è stato lavato con etanolo freddo al 70% (v/v) mediante centrifugazione a 7.000 rpm per 5 min a 4°C e risospeso in acqua o tampone TE.
Per rimuovere l’eventuale RNA presente in soluzione il campione è stato sottoposto a digestione enzimatica con RNasiA, 15 ?l in 1ml di soluzione di acidi nucleici, a 37°C per 1 h e successiva estrazione con cloroformio -alcool isoamilico (24:1) come descritto precedentemente.
Quantità e qualità del DNA isolato sono state analizzate mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio.
2.2 Corsa elettroforetica su gel di agarosio
Tutti i campioni di DNA (DNA genomico, frammenti di DNA, cDNA) sono stati sottoposti a corsa elettroforetica su gel di agarosio a concentrazioni variabili tra 0,8% e 2% disciolto in un tampone di Tris-acetato (TAE) 1X.
I campioni da caricare sono stati preparati aggiungendo al DNA 0,1 volumi di una soluzione di etidio bromuro 0.5 ?g/?l e 0,1 volumi di tampone di caricamento.
La concentrazione del DNA è stata calcolata confrontando il campione con un marker a concentrazione nota. Le dimensioni dei frammenti di DNA analizzati sono state calcolate confrontando il campione con un marker di pesi molecolari (marker IX Roche).
2.3 Isolamento dell’RNA totale
L’RNA totale è stato isolato dalle foglie del controllo e del trattato delle due specie di pioppo, seguendo il metodo descritto da Logemann et al. (1987). Un grammo di foglia è stato omogeneizzato in azoto liquido in un mortaio e lisato in 2 ml di tampone di estrazione costituito da guanidina idrocloruro 8 M, MES (4- morpholinneethansulfonic acid) 20 mM, EDTA20 Mm, ß- mercaptoetanolo 50 mM. Dopo un’estrazione con fenolo/cloroformio/alcool isoamilico (25:24:1) per rimuovere le proteine, l’RNA totale è stato centrifugato e successivamente purificato mediante precipitazione con 0,7 vol. di etanolo freddo e 0,2 vol. di acido acetico 1 M a -80°C per 1 ora. La soluzione è stata centrifugata a 10.000 rpm per 30 min a 4°C e il pellet ottenuto è stato lavato 2 volte con sodio acetato 3M pH 5,2 e etanolo al 70% e risospeso in H2ODEPC.
Quantità e qualità dell’RNA ottenuto sono state misurate sia con analisi spettrofotometrica che mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio in condizioni denaturanti.
2.4 Corsa elettroforetica su gel di agarosio in condizioni denaturanti
Tutti i campioni di RNA sono stati sottoposti a corsa elettroforetica su gel di agarosio 1%
disciolto in una soluzione contenente MOPS e formaldeide.
I campioni da caricare sono stati preparati aggiungendo all’RNA 3 volumi di soluzione denaturante per RNA; la miscela è stata mantenuta a 65°C per 10 minuti e posta in ghiaccio, dopodiché è stata aggiunta la soluzione di caricamento in quantità pari ad 1/5 del volume finale.
3. Reazione a catena della polimerasi (PCR)
La PCR è stata utilizzata per
? amplificare i frammenti di DNA inseriti in un plasmide utilizzando 5ng di stampo
? amplificazione di frammenti di cDNA da RT utilizzando 0,6 µl di stampo
? amplificazione da DNA genomico utilizzando 100ng di stampo
Una miscela di reazione da 30 ?l è così composta:
Buffer 10x: 3 µl (1X finale)
MgCl2 50mM: 1.02 µl (1,7 mM fiinale)
dNTP Mix 10mM: 0.6 ?l (0,2 mM finale)
Primer5’ 10?M: 0.6 ?l (0,2 ?M finale) Primer3’ 10?M: 0.6 ?l (0,2 ?M finale) Euro Taq (EuroClone) 5U/µl: 0.3 ?l (1,5 U)
DNA Stampo + H2O : 23,88 ?l Condizioni di reazione:
1) 94°C per 4 min
2) 30 cicli: 94°C per 30 sec, Tannealing (°C) per 30 sec, 72°C per il tempo necessario alla sintesi 3) 72°C per 7 min
Le condizioni di amplificazione variano a seconda degli oligonucleotidi utilizzati e delle dimensioni del frammento da amplificare.
Le sequenze dei primers utilizzati nelle reazioni di PCR sono riportate nella tabella 2.1.
La temperatura di annealing della coppia di primers utilizzata e il tempo necessario alla sintesi del frammento di PCR sono riportati nella tabella 2.2.
4. Retrotrascrizione del mRNA (RT)
La retrotrascrizione del mRNA è stata eseguita utilizzando il kit SuperScript™ II RNase H- Reverse Transcriptase (Invitrogen) con l’ Oligo(dT)12-18 Primer (Invitrogen) seguendo le istruzioni fornite dalla ditta.
La miscela per la retrotrascrizione è costituita da:
Oligo(dT)12-18 Primer 1 µl
RNA: 5µg
dNTP( 20mM) 1 µl
H2ODEPC q.b. fino a 12 µl
La miscela è stata incubata a 65°C per 5 minuti e posta in ghiaccio per 5 minuti.
Successivamente sono stati aggiunti:
First-Strand Buffer 5X: 4µl
DTT 0.1M: 2 µl
Inibitore delle RNasi: 1µl
Dopo incubazione a 42°C per 2 minuti è stato aggiunto 1 µl di SuperScript II RT (200 U/µl).
La miscela è stata incubata a 42°C per 50 minuti.
Al termine la reazione è stata bloccata mediante riscaldamento a 70°C per 15 minuti.
Il cDNA così ottenuto è stato utilizzato come stampo in reazioni di PCR per isolare i frammenti genici espressi, che sono stati in seguito clonati e sequenziati, e allo scopo di analizzare l’andamento dell’espressione genica (RT-PCR Relativa).
5. RT-PCR Relativa
La retrotrascrizione con la successiva PCR (RT-PCR) permette l’amplificazione di mRNA cellulare. Questo consente di valutare anche cambiamenti minimi ma fisiologicamente rilevanti nell’espressione genica (Gause W.C. et al, 1995).
Amplificando contemporaneamente la sequenza di interesse e un controllo interno (in questo caso ?-actina) è possibile confrontare la quantità di un trascritto tra più campioni. A questo scopo è necessario che i primers per l’amplificato del gene di interesse (target) e quelli per il controllo interno siano compatibili e che le bande dei frammenti di PCR abbiano pesi molecolari simili ma facilmente distinguibili su gel d’agarosio. Per questo tipo di analisi è necessario che la reazione di PCR venga analizzata durante la fase lineare dell’amplificazione prima che entrambi i prodotti di amplificazione raggiungano la fase di plateau ossia di saturazione (Prediger, 2001).
Allo scopo di individuare il punto di saturazione sono state prelevate aliquote di 5 ?l dopo 22, 24, 26, 28, 30 cicli di PCR; le aliquote sono state immediatamente trasferite in un termociclizzatore adiacente dove hanno subito la fase di estensione finale di 7 min a 72°C. In questo modo è stato possibile stabilire il numero di cicli appropriato per una valutazione quantitativa relativa mediante questa tecnica (nel nostro caso 28 cicli). Per ogni gene in analisi sono state fatte tre prove di RT-PCR relativa utilizzando come stampo cDNA ottenuti sia da tre retrotrascrizioni diverse sia da tre diverse estrazioni.
I prodotti di PCR sono stati analizzati su gel di agarosio 2% colorato con Etidio Bromuro. Gli amplificati sono stati quantizzati mediante scansione diretta del gel di agarosio al 2% con il
densitometro UVP Image Store 5000 (Ultra Violet Product Ltd, Cambrige, England) equipaggiato con l’UVP GelBase-GelBlot TM Windows Software.
Per normalizzare i campioni relativamente alla quantità di RNA totale utilizzato e alla efficienza della sintesi di cDNA, le intensità delle bande di amplificazione dei frammenti da analizzare sono state rapportate ai prodotti di amplificazione della ?-actina. Questo rapporto è stato calcolato per tre esperimenti indipendenti.
6. Clonaggio
6.1 Ligation
La reazione di ligation è stata effettuata seguendo il protocollo del TOPO TA Cloning® kit (Invitrogen). 4 ?l di ciascun prodotto di PCR, 1 ?l di vettore e 1?l di salt solution, (fornita nel kit) sono stati incubati a 22°C per 30 minuti, dopodiché la reazione è stata messa in ghiaccio ed è stata effettuata la trasformazione.
6.2 Trasformazione di cellule di Escherichia coli con DNA plasmidico
2 ?l della reazione di ligation sono stati aggiunti alla provetta contenente le cellule chimicamente competenti di E. coli, ceppo TOP10F’, fornite nel kit. La miscela è stata incubata in ghiaccio per 30 minuti e successivamente sottoposta a shock termico a 42°C per 30 sec. La reazione è stata immediatamente bloccata ponendo il tutto in ghiaccio per 2 minuti.
Sono stati aggiunti 250 ?l di SOC medium, fornito nel kit, precedentemente preriscaldato a temperatura ambiente. La soluzione è stata incubata a 37°C per 1 ora, in agitazione orizzontale.
Le cellule così preparate sono state piastrate su LB AGAR A+ X+ I+ (contenenti Ampicillina, X-gal e IPTG).
Le piastre sono state incubate capovolte a 37°C per una notte, quindi chiuse con parafilm e conservate a 4°C.
X-gal è la molecola che consente la distinzione tra i cloni contenenti l’inserto e quelli che ne sono privi: nel plasmide l’operone Lac-Z codifica per l’enzima beta-galattosidasi; questo è in grado di scindere la molecola X-gal (5-bromo -4-cloro-3-indolil-beta-D-galattopiranoside) in 5-bromo-4-cloroindolil e 5,5’-dibromo-4,4’-dicloroindigo che è di colore blu. Il frammento di DNA estraneo viene inserito all’interno dell’operone interrompendo il gene per la beta- galattosidasi che non viene più sintetizzata. Le cellule contenenti l’inserto, quindi, non saranno in grado di scindere l’X-gal presente nel substrato e assumeranno una colorazione bianca;
quelle prive dell’inserto, me tabolizzando l’X-gal si coloreranno di blu.
7. Screening dei cloni (colony PCR)
Una porzione della colonia è stata messa a crescere a 37°C in 50 ?l di LB A+ liquido su agitatore rotante per 2 ore.
La coltura (1µl) è stata amplificata mediante PCR utilizzando Euro Taq (EuroClone) e gli oligonucleotidi specifici utilizzati per isolare i diversi frammenti clonati (Tabelle 2.1 e 2.2).
I prodotti di PCR sono stati analizzati su gel di agarosio.
8. Isolamento del plasmide da cellule batteriche per mini preparazioni
Il DNA plasmidico è stato estratto e purificato utilizzando High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche).
I cloni sono stati inoculati in provette contenenti 10 ml di LB liquido e ampicillina (50?g/ml) e incubati a 37°C su agitatore rotante per tutta la notte.
Le provette contenenti le cellule sono state centrifugate a 11.000 rpm per 1,5 minuti a 4°C. Il pellet è stato risospeso in 250 ?l di suspension buffer (Tris-HCl 50 mM, EDTA 10 mM pH 8) contenente RNasi A. Dopo aggiunta di 250 ?l di lysis buffer (NaOH 0,2 M, SDS 1%) la
soluzione è stata incubata a temperatura ambiente per 5 minuti. Sono stati aggiunti 350 ?l di binding buffer (guanidina idrocloruro 4M, potassio acetato 0,5 M, pH 4,2) e la soluzione è stata mescolata vigorosamente agitando la provetta e ponendola in ghiaccio per 5 minuti.
Dopo centrifugazione a 14.000 rpm per 10 minuti il sovranatante, contenente il plasmide, è stato trasferito in un tubo con filtro (High Pure Tube) posizionato sopra ad un tubo di raccolta e centrifugato a 14.000 rpm per 1 minuto. Dopo un lavaggio mediante aggiunta di 700 ?l di wash buffer (NaCl 20 mM, Tris-HCl 2 mM, pH 7,5) il plasmide è stato fluito in 50 ?l di H2O.
9. Digestione del DNA mediante enzimi di restrizione
Il DNA genomico è stato sottoposto a digestione enzimatica. In una eppendorf da 1,5 mL sono stati inseriti il DNA da digerire (10 ?g), 5 unità di enzima di restrizione per ogni ?g di DNA, il tampone specifico per ogni enzima (1/10 del volume finale).
Enzimi utilizzati: BoxI, SspI, DraI, EcoRV; SnaI.
La digestione è stata condotta a 37°C per tutta la notte.
10. Preparazione delle sonde
La preparazione della sonda per l’isolamento del promotore del gene Ft32C-WAK H nel clone I-214, sonda WAKh, è stata ottenuta amplificando una porzione distintiva del trascritto Ft32C- WAK H in prossimità della sua estremità 5' mediante reazione di PCR. Il frammento (Figura 2.1) è stato isolato da eventuali prodotti aspecifici tramite corsa elettroforetica su gel di agarosio; la porzione di gel contenente la banda relativa al prodotto di PCR specifico è stata ritagliata, purificata ed eluita utilizzando il kit Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega).
sonda MIX
154 bp
603 bp
10.1 Marcatura di un frammento di dna con metodo non radioattivo
Il frammento di DNA è stato marcato con il DIG DNA Labeling Kit (Roche) per essere utilizzato come sonda in esperimenti di Southern Blotting e ibridazione.
Il DNA (0,1-1 µg) è stato denaturato mediante riscaldamento a 100°C per 10 minuti e immediatamente posto in ghiaccio. Sono stati aggiunti 2 ?l di esanucleotidi, 2 ?l di dNTP labelling mix, contenente l’uridina trifosfato marcata con digossigenina (dUTP-DIG), e 1 ?l di Klenow (2 U/?l) per un volume finale di 20 ?l.
La soluzione è stata incubata a 37°C per una notte.
La reazione è stata bloccata aggiungendo 2??l di Na2EDTA 0,2 M (pH 8) e il DNA marcato è stato precipitato con 2,5 ?l di LiCl 4 M ed etanolo assoluto freddo incubandolo a -80°C per 1 ora.
Dopo centrifugazione a 12.000 rpm per 15 minuti a 4°C il pellet è stato lavato con etanolo al 70% freddo e risospeso in 50 ?l di H2O.
Figura 2.1. Amplificazione della porzione corrispondente alla sonda del trascritto Ft32C-WAK H nel clone I214 (sonda). MIX, marker IX di pesi molecolari (Roche).
11. Tecniche di trasferimento del DNA su membrana: Southern blotting
Il DNA frammentato mediante digestione con enzimi di restrizione è stato sottoposto a corsa elettroforetica su gel di agarosio all’1%, per una notte a 4°C.
Il trasferimento del DNA dal gel alla membrana è stato effettuato mediante un apposito apparato di blottaggio (LKB) collegato ad una pompa a vuoto.
Una membrana di nylon carica positivamente (Roche), inumidita in SSC 2X, è stata posizionata sull’apparecchio; sopra di essa è stato adagiato il gel precedentemente esposto a radiazione ultravioletta al fine di depurinizzare i frammenti superiori a 4 Kb facilitandone il trasferimento.
Una volta accesa la pompa il gel è stato sommerso con soluzione denaturante per 8 minuti.
Dopo aver recuperato tale soluzione il gel è stato ricoperto per 8 minuti con soluzione neutralizzante, necessaria per interrompere la denaturazione. Infine, dopo aver recuperato questa soluzione, il gel è stato ricoperto con SSC 20X e mantenuto in questa condizione per almeno 2 ore. In questo modo il DNA viene trasferito dal gel alla membrana (Southern blotting).
Terminato il trasferimento la membrana è stata immersa in una soluzione di lavaggio (SSC 2X), asciugata e fissata mediante Hoefer™ UVC 500 cross-linker (Amersham Biosciences). In questo modo il DNA viene legato irreversibilmente alla membrana.
A questo stadio è possibile conservare la membrana a 4°C per un utilizzo futuro, oppure procedere alla preibridazione, ibridazione e detection.
12. Ibridazione e lavaggi delle membrane
La membrana, preparata mediante Southern blotting, è stata inserita in un tubo di ibridazione e incubata in 20 ml di soluzione di preibrida zione (DIG-Easy Buffer) a 39°C per almeno 2 ore.
La sonda, denaturata a 100°C per 10 minuti, è stata diluita in 15 ml di soluzione di preibridazione fresca in modo da ottenere una soluzione di ibridazione ad una concentrazione di 20 ng/ml.
Al termine della preibridazione la prima soluzione è stata eliminata ed è stata inserita la soluzione di ibridazione. La membrana è stata mantenuta in incubazione a 39°C per una notte.
Terminata l’ibridazione e recuperata la sonda, la membrana è stata sottoposta ad una serie di lavaggi con diverso potere stringente. La stringenza è stata determinata empiricamente.
SSC 2X (SDS 0,1%) 25°C, 5 minuti, (due volte) SSC 0,5X o SSC 0,1X (SDS 0,1%) 65°C, 15 minuti, (due volte)
13. Rivelazione del segnale (Detection)
Terminato l’ultimo lavaggio, il segnale di ibridazione è stato rilevato mediante il Dig Luminescent Detection Kit (Roche). Le membrane sono state immerse prima in Buffer 1 per 1 minuto, poi in Buffer 2 su agitatore per 30 minuti.
La membrana è stata incubata con anticorpo anti-digossigenina legato alla fosfatasi alcalina, diluito in Buffer 2 (1:10.000) per 30 minuti su agitatore.
Successivamente la membrana è stata sottoposta a due lavaggi di 15 minuti in Buffer 1 su agitatore per rimuovere l’anticorpo non legato. Il primo lavaggio è stato effettuato previa aggiunta di Tween 20 (0.3% p/v).
La membrana è stata poi equilibrata in Buffer 3 per almeno 2 minuti.
Per la rivelazione del segnale di ibridazione la membrana è stata cosparsa con CPD STAR (1 ml per memb rane di 100 cm²), inserita in una busta trasparente sigillata e incubata per 5 minuti a temperatura ambiente. La membrana con busta è stata poi messa a contatto per circa 1 ora con una lastra autoradiografica (Amersham MP) che è stata successivamente sviluppata e fissata con soluzioni Kodak, seguendo le istruzioni fornite dalla ditta.
14. Stripping di una membrana: rimozione della sonda
In alcuni casi una stessa membrana è stata utilizzata più volte con sonde diverse. Ogni volta la sonda è stata rimossa utilizzando il metodo di stripping descritto in DIG nucleic acid detection kit (Roche): la membrana è stata immersa in acqua, incubata a 37°C in una soluzione contenente NaOH 0,2 M e SDS 0,1 p/v per 30 minuti e lavata, successivamente, con SSC 2X.
15. Isolamento della sequenza promotrice del gene Ft32C -WAK H nel clone I-214
La sequenza promotrice del gene Ft32C-WAK H è stata isolata utilizzando il Genome Walker Universal kit (BD Bioscences Clontech) seguendo il protocollo indicato nel kit.
Inizialmente 2,5 µg di DNA genomico, estratto dal clone I-214, è stato digerito con EcoRV seguendo le istruzioni del kit. L’enzima di restrizione è stato scelto mediante analisi Southern blot (vedi Risultati par. 5), effetuata precedentemente al fine di conoscere le dimensioni del frammento, contenete la sequenza promotrice, da amplificare.
Al DNA digerito con EcoRV (che genera estremità blunt ends) è stato legato l’adattatore Genome Walker adapter (Figura 2.2), grazie al quale è stato possibile amplificare un frammento contenente la sequenza promotrice di interesse utilizzando, in due PCR successive (vedi Risultati par.5, figura3.16) i primer forward AP1 e AP2 in coppia con 2 primer specifici reverse (WAK gsp1 e WAKgsp2) disegnati in una regione all’estremità 5' del gene Ft32C-WAK H. I primer specifici (vedi Tabella 2.1) sono stati disegnati in modo da amplificare specificamente la regione promotrice del gene di interesse. Le due PCR successive sono state effettuate seguente le istruzioni del kit. Il prodotto di amplificazione della seconda PCR (vedi Risultati par. 5, figura 3.16) è stato eluito da gel e clonato in vettore plasmidico.
16. Analisi delle sequenze
Le analisi delle sequenze presentate in questo lavoro sono state effettuate mediante programmi disponibile in rete.
Le sequenze aminoacidiche dedotte sono state ottenute utilizzando ExPASy Translate Tool (http://www.expasy.org), e i multiallineamenti delle sequenze nucleotidiche e aminoacidiche utilizzando CLUSTALW (http://align.genome.jp/).
La ricerca di domini funzionali all’interno delle sequenze aminoacidiche dedotte sono state effetuate con:
? PROSITE: (http://www.expasy.org )
? Pfam: (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam)SMART: (http://smart.embl- heidelberg.de/)I dati ottenuti utilizzando questi software sono stati poi integrati con le informazioni presenti in letteratura.
La ricostruzione dell’architettura del promotore è stata effettuata con:
? SoftBerry: (http://softberry.com/berry.phtml)
? PLACE: (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)I risultati riguardanti la ricostruzione del core promoter (vedi Risultati par. 5) sono stati corretti in base al lavoro di Yamamoto et al. (2007).
Tabella 2.1. Primers utilizzati in questo lavoro.
Oligonucleotidi Sequenza Utilizzo
WRKY5' 5’-GCTAGGTACCTGATTATTATTTGTCTCG-3’ Isolamento trascritto e gene Ft312B-WRKY, colony -PCR WRKY3' 5’-AAAACTCTAAATTCTCTACAATAGTACTAGTG-3’ Isolamento trascritto e gene Ft312B-WRKY, colony -PCR WRKYf 5’-CATTTGCCCCAAGTTGCCCTG-3’ RT- PCR Relativa Ft312B-WRKY clone Eridano e I-214 WRKYr 5’-CCGCTTTGGATCAAATCAAGGG-3’ RT- PCR Relativa Ft312B-WRKY clone Eridano e I-214 WAK5' 5’-CAGAAAAGTAGCTGTCATGAGAATTCG-3’ Isolamento trascritto e geneFt32C-WAK, colony -PCR WAK3' 5’-TTATTCAAAGCAAACTATCAAGCGAAG-3’ Isolamento trascritto e gene Ft32C-WAK, colony -PCR WAKHtf 5’-CACGGCAAGTACTATAAACGTAACGG-3’ RT- PCR Relativa clone I214 Ft32C-WAKH
WAKHtr 5’-CTTGCTAGAAACTGCTATGCTAAAGTATTC-3’ RT- PCR Relativa clone I214 Ft32C-WAKH WAKLtf 5’-TTTTTAGGAAATGGTAACTTAAGTGTCACA-3’ RT- PCR Relativa clone I214 Ft32C-WAKL WAKLtf 5’-CTAAACAAGCTCACGTCGAAGTACTTAAT-3’ RT- PCR Relativa clone I214 Ft32C-WAKL WAKHsf 5’- TCTCAACACAAGTACTATAAACGTCACGG-3’ RT- PCR Relativa clone Eridano Ft32C-WAKH WAKHsr 5’- CTGGCTAGAAACTGTTAAGTCAAAGTGATT-3’ RT- PCR Relativa clone Eridano Ft32C-WAKH WAKLsf 5’-TTTATAGGAAAAAGTGACTTAAATTTCACA-3’ RT- PCR Relativa clone Eridano Ft32C-WAKL WAKLsf 5’-CTAGACAAGCTCACTTTGAAGTGCTTAAT-3’ RT- PCR Relativa clone Eridano Ft32C-WAKL WAKsonda5' 5’-TATAATGCATCAGGACAAACTTCTAAC-3’ amplificazione frammento costruzione sonda WAKsonda3' 5’-ATTCGTTATCAGTACTACCAGCTTTCAA-3’ amplificazione frammento costruzione sonda WAKgsp1 5’-GGAAGCTCGTCAACGTCCTTCAGATCCT-3’ Isolamento del promotore Ft32C-WAKH clone I-214 WAKgsp2 5’-GCTGCAGGGGCTGAAGCTCAAGATGTCTTT-3’ solamento del promotore Ft32C-WAKH clone I-214
Tabella 2.2. Reazioni di amplificazioni (PCR) effettuate in questo lavoro.
Coppia di Oligonucleotidi Temp. annealing (°C) Tempo di sintesi
WRKY5'/WRKY3' 57 1’17’’
WRKYf/WRKYr 58 25’’
WAK5'/WAK3' 57 2’30’’ (trascritto) 3’30’’ (gene)
WAKHtf/WAKHtr 58 25’’
WAKLtf/WAKLtf 58 25’’
WAKHsf/WAKHsr 58 25’’
WAKLsf/WAKLsf 58 25’’
WAKsonda5'/WAKsonda3' 60 27’’
17. Soluzioni utilizzate
Tampone di estrazione per DNA
NaCl 1,4 M
Na2-EDTA 20 mM
Tris-HCl 100 mM pH 8
CTAB 3% w/v
2-Mercaptoetanolo 0,2% v/v
TE buffer (pH 8)
Tris-HCl 10 mM pH 8
Na2-EDTA 1 mM pH 8
Cloroformio -alcool isoamilico (24:1)
Cloroformio e alcool isoamilico miscelati in rapporto 24:1, saturati con Tris-HCl 100 mM, pH 8.
RNAasi A (10 mg/ml) 10 mg di enzima disciolti in:
Tris-HCl 10mM, pH 7,5
NaCl 15 mM
Bollire per 5 minuti e raffreddare a temperatura ambiente.
Conservare a -20°C.
Tampone Tris-acetato (TAE) 10X Tris-acetato 0,4 M
Na2-EDTA 0,01 M
pH 7,7 con acido acetico glaciale
Autoclavare.
Tampone di caricamento per DNA Saccarosio 60%
Na2-EDTA 25 mM pH 8 Orange G 0,5%
Filtrare.
Soluzione denaturante di caricamento per RNA Formamide deionizzata: 250 µl
Formaldeide 37% (p/v): 83 µl
MOPS 10X: 50 µl
Preparare giornalmente una soluzione fresca
MOPS 10X
Morpholinopropansulfonic acid: 200 mM
Sodio acetato: 50 mM
EDTA: 10 mM
pH 7.0
Soluzione di caricamento per RNA
Saccarosio 30%
Blu di Bromo fenolo q.b.
LB (dosi per 1 L)
Bactotriptone 10 g Yeast extract 5 g
H20 1 l Autoclavare.
Raffreddare a temperatura ambiente e aggiungere ampicillina: 5 ml/L soluzione, dallo stock da 10 mg/ml.
Conservare a 4°C.
YT Agar (dosi per 1 L di soluzione)
Bactotryptone 8 g
Yeast Extract 5 g
NaCl 5 g
Bacto-Agar 15 g
Portare a volume con acqua e autoclavare.
Raffreddare a temperatura ambiente e aggiungere:
Ampicillina: 50 mg/l X-Gal: 40 mg/l IPTG: 120 mg/l
Agitare dolcemente e versare il composto nelle capsule di Petri.
Ampicillina
Soluzione stock 10 mg/ml in etanolo al 70%
Conservare a -20°C.
X-Gal
40 mg in 1 ml di dimetilformamide da aggiungere in 1 l di YT Agar.
IPTG
soluzione stock 100 mM: 238 mg di IPTG solubilizzati in 10 ml di H2O sterile
Salt solution
NaCl 1,2 M
MgCl2 0,06 M
SOC medium
Triptone 2,0%
Yeast extract 0,5%
NaCl 10 mM
KCl 2,5 mM
MgCl2 10 mM
MgSO4 10 mM
Glucosio 20 mM
SSC 20X
NaCl 3 M
Sodio citrato 300 mM pH 7 con acido citrico Autoclavare.
Soluzione denaturante
NaOH 0,5 M
NaCl 1,5 M
Soluzione neutralizzante
NaCl 3 M
Tris-HCl 0,5 M pH 6,2-6,3 con HCl
Blocking Stock Solution
Blocking reagent (Roche) 10% w/v in Buffer 1 Sciogliere a 60°C e autoclavare.
Conservare a -20°C.
Buffer 1
Acido maleico0,1 M NaCl 0,15 M pH 7,5 con NaOH Autoclavare.
Buffer 2
Blocking Stock Solution diluita 1:10 in Buffer 1.
Buffer 3
Tris-HCl 100 mM pH 9,5 NaCl 100 mM
