3.2 DOSAGGI RADIOENZIMATICI E STIMA DEI PARAMETRI CINETICI

3. RISULTATI

3.1 COSTRUZIONE, ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DEI MUTANTI G99A, G99V E G99P

L’identificazione anche nella cN-II dei quattro motivi aminoacidici conservati, comuni a tutti i componenti della superfamiglia delle HAD, ha spinto a condurre esperimenti di mutagenesi sito-diretta per verificare il loro ruolo nel meccanismo catalitico. Gran parte delle ipotesi fatte sulla base dell’allineamento della sequenza primaria sono state confermate e attualmente si ritiene che la cN-II appartenga a questa superfamiglia. Poiché ancora non è stato possibile ottenere la struttura cristallina dell’enzima, per indagare sulla struttura tridimensionale della proteina e sui cambiamenti conformazionali che avvengono durante la catalisi il primo passo è quello di valutare se nella cN-II è presente il cap domain e eventualmente quale sia la sua localizzazione.

Recentemente Rinaldo-Matthis e coll. hanno ottenuto la struttura cristallina della nucleotidasi mitocondriale ed hanno individuato nella sequenza primaria i quattro motivi conservati del core domain e il motivo S contenuto nel loop 5 del cap domain; inoltre allineando le sequenze primarie delle nucleotidasi intracellulari hanno indicato, per ognuno di questi enzimi, la possibile sequenza del motivo S (Figura 3-A).

----motivo S---

Figura 3-A: Allineamento delle sequenze primarie delle 5’-nucleotidasi intracellulari e localizzazione del motivo S. La glicina conservata è indicata in rosso. (da Rinaldo-Matthis et al., 2002)

Durante l’attività catalitica, gli enzimi della sottofamiglia I subiscono dei cambiamenti conformazionali che si ripetono in modo ciclico; nella conformazione “cap-aperto” avviene il riconoscimento del substrato ma anche il rilascio del prodotto, mentre nella conformazione “cap-chiuso” avviene la reazione. I membri della sottofamiglia I, a cui sembra appartenere anche la cN-II, sono caratterizzati dal possedere un motivo S contenente una glicina conservata importante per il corretto funzionamento del cap domain. Nella nucleotidasi mitocondriale la glicina conservata è quella in posizione 73 e a

questa è stata attribuita una funzione di perno importante per conferire mobilità al cap domain e permettere al substrato di entrare nel sito attivo. Sulla base dell’allineamento mostrato da Rinaldo-Matthis è stato ipotizzato che per la cN-II la glicina del motivo S possa essere la glicina in posizione 99; per questo motivo sono stati costruiti tre mutanti:

G99A, G99V e G99P.

Nel mutante G99A la glicina è stata sostituita con una alanina, un aminoacido con una catena laterale leggermente più grande rispetto a quella della glicina, ma ancora di piccole dimensioni che consente infatti una buona libertà di movimento; nel mutante G99V la sostituzione è stata fatta con una valina, un aminoacido con un maggiore ingombro sterico dovuto alla presenza di un gruppo laterale ramificato che crea un impedimento con la catena principale del polipeptide e quindi determina una riduzione della flessibilità; nel mutante G99P la glicina è stata invece sostituita con una prolina, la cui catena laterale, legata sia all’atomo di azoto che al carbonio α, forma una struttura ciclica che induce rigidità nella catena polipeptidica.

Se questa glicina fosse quella della cerniera, le sostituzioni non conservative dovrebbero andare ad interferire con la funzionalità del cap domain, impedendone addirittura l’azione nel caso della sostituzione con la prolina, che blocca la struttura con un angolo fisso e non ne consente il movimento. Per capire il ruolo del residuo aminoacidico sono state determinate le caratteristiche cinetiche dei tre enzimi mutanti e sono state paragonate con quelle dell’enzima ricombinante wild-type, utilizzato come controllo.

Come descritto nella sezione MATERIALI E METODI, i tre mutanti puntiformi sulla glicina 99 sono stati ottenuti adoperando la tecnica della mutagenesi sito-diretta, che prevede l’utilizzo di due reazioni di PCR per creare ciascun mutante. Il gene mutato portato dal vettore pET 28c viene espresso nelle cellule BL21, un ceppo di E. coli ingegnerizzato per garantire una elevata produzione della proteina. Per recuperare il nostro enzima localizzato nel solubile cellulare, si ricorre all’utilizzo del lisozima, che degrada la parete batterica, e del sonicatore, i cui ultrasuoni sono in grado di rompere le membrane cellulari. Una volta ottenuto l’estratto grezzo, per separare l’enzima ricombinante dalle altre proteine batteriche si utilizza la resina Ni-NTA agarosio. L’acido nitrilotriacetico (NTA) è un chelante tetradentato che lega uno ione di nichel lasciando liberi due siti di coordinazione del metallo, in modo che questo possa stabilire legami con la nostra proteina dotata di His-tag. La sequenza di poli-istidina possiede infatti una elevata affinità per gli ioni divalenti di metalli di transizione, grazie alla capacità dell’anello imidazolico della

catena laterale dell’istidina di stabilire legami di coordinazione [The QIAexpressionist handbook]. L’enzima ricombinante si lega selettivamente alla resina cromatografica e, dopo aver rimosso le proteine contaminanti prive di His-tag, viene eluito utilizzando una soluzione contenente una elevata concentrazione di imidazolo. Questo composto compete con l’His-tag per la chelazione del metallo e determina il rilascio dell’enzima dalla resina.

La concentrazione proteica della soluzione ottenuta al termine della purificazione viene stimata con il metodo di Bradford, mentre la sua purezza viene valutata con l’elettroforesi SDS-PAGE (Figura 3-B). Per ogni mutante si ha una banda localizzata in corrispondenza di 61 KDa, il peso molecolare della subunità della cN-II.

1 2 3 4

Figura 3-B: Elettroforesi SDS-PAGE al 10% delle proteine ricombinanti mutate sulla glicina 99.

Lane 1: standards; lane 2: G99A; lane 3:

G99V; lane 4: G99P.

3.2 DOSAGGI RADIOENZIMATICI E STIMA DEI PARAMETRI CINETICI

I tre mutanti appena purificati sono stati sottoposti a dosaggi radioenzimatici per stimare le attività 5’-nucleotidasica e fosfotransferasica e calcolare il rapporto dell’una rispetto all’altra. I dosaggi per le due attività sono stati eseguiti in presenza di inosina come accettore del gruppo fosfato, ma utilizzando una concentrazione sottosaturante corrispondente alla Km del wild-type; per questo motivo, l’attività PHT misurata non rappresenta il valore massimo. Se il rapporto tra la velocità di scissione dell’IMP e il trasferimento del fosfato fosse stimato in presenza di concentrazioni saturanti dei due substrati si otterrebbe un valore pari ad 1 e non circa 2, come mostrato nella Tabella II.

Inoltre è importante ricordare che, in presenza di inosina, l’attività 5’-nucleotidasica è più alta rispetto a quella che si misurerebbe in assenza del nucleoside accettore del fosfato,

perché il trasferimento del fosfato al nucleoside avviene più velocemente della reazione di idrolisi e in questo modo stimola la reazione complessiva dell’enzima.

Per verificare se la mutazione ha alterato le affinità verso i due substrati IMP e inosina sono stati eseguiti anche dei dosaggi radioenzimatici per valutare una eventuale variazione della velocità di reazione in funzione di concentrazioni crescenti di substrato; mediante il grafico dei doppi reciproci o di Lineweaver-Burk è stato possibile stimare i valori della Km

e quelli della Vmax. Conoscendo l’attività specifica massima è stata anche calcolata la Kcat, un parametro che indica il numero di eventi catalitici al secondo per mole di enzima quando esso si trova in condizioni saturanti di substrato. Questo valore è stato utilizzato per calcolare il rapporto Kcat / Km, che esprime l’efficienza catalitica dell’enzima.

Per completare la caratterizzazione dei mutanti sono state esaminate anche le affinità per l’attivatore ATP e per il cofattore Mg²⁺. Il parametro che indica il grado di affinità per un attivatore o un cofattore è la K50, che viene calcolata con un dosaggio simile a quello per la valutazione della Km; si misura infatti la velocità della reazione fosfotransferasica in funzione di concentrazioni crescenti di ATP o di Mg²⁺, a seconda del parametro da misurare, e si estrapola il valore della K50 dal grafico di Lineweaver-Burk. Tutti i valori dei parametri cinetici calcolati sono riportati nella Tabella II.

5’N/PHT Km IMP

(mM) Km Ino (mM) Vmax (U/mg) K^cat/Km K50 Mg²⁺

(mM)

K50 ATP (mM) WT 1,8 0,10 1,00 12,00 590 2 1

G99A 1,9 0,18 0,83 10,42 260 1,8 1

G99V 1,9 0,039 0,33 1,46 149 1 0,66

G99P 1,5 0,15 1,3 15,38 460 1,5 0,5

Tabella II: Parametri cinetici dell’enzima Wild-type e dei mutanti G99A, G99V e G99P

I risultati ottenuti rivelano che la mutazione conservativa del G99A non altera in modo significativo né le affinità per i substrati IMP e Ino né quelle per l’attivatore ATP e per il cofattore Mg²⁺; anche il rapporto tra le attività nucleotidasica e fosfotransferasica non

sembra risentire della sostituzione aminoacidica. L’unico parametro che mostra una particolare variazione è quello dell’efficienza catalitica, ma la sua diminuzione è il risultato sia della piccola riduzione della velocità massima sia del leggero aumento della Km.

Il mutante G99V mostra invece, rispetto al wild-type, una forte riduzione del potere catalitico e della Vmax, ma anche un incremento significativo delle affinità per entrambi i substrati e in modo un po’ meno eclatante per il cofattore Mg²⁺. Il rapporto tra le attività nucleotidasica e fosfotransferasica sembrerebbe ad un primo sguardo invariato; in realtà, poiché la Km per l’inosina è molto più bassa rispetto a quella del wild-type, la concentrazione dell’accettore del fosfato utilizzata nel saggio è in questo caso saturante.

Alla luce di ciò il valore di questo rapporto sembra indicare che, al contrario del wild-type, l’attività fosfotransferasica sia sfavorita rispetto all’attività idrolizzante.

La sostituzione della glicina 99 con una prolina, che irrigidisce la struttura, non provoca, come osservato nel mutante precedente, né una riduzione dell’efficienza catalitica né un aumento delle affinità per i substrati e per il cofattore; in questo mutante, per il quale avremmo potuto aspettarci anche una assenza di attività, possiamo osservare, contrariamente alle nostre aspettative, un incremento della Vmax, come se avessimo bloccato la struttura dell’enzima in una conformazione più attiva. Il rapporto 5’N/PHT, confrontato con quello del wild-type, sembra rivelare che nel mutante G99P l’attività fosfotransferasica sia lievemente favorita rispetto all’attività idrolizzante.

Nelle pagine successive sono stati riportati i vari grafici della velocità in funzione di concentrazioni crescenti di substrato, di magnesio e di ATP e i rispettivi grafici di Lineweaver-Burk utilizzati per estrapolare i valori delle Km, delle Vmax e delle K50 per ciascun mutante.

GRAFICI PER LA DETERMINAZIONE DEI PARAMETRI CINETICI DEI MUTANTI G99A, G99V e G99P

G99A

a)

0 1 2 3 4

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,

[IMP] mM

U/ml

5

b)

0 0,4 0,8 1,2 1,6

-10 0 10 20 30 40

1/[IMP]

1/V

Grafico I: a) Velocità della reazione nucleotidasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di [8-¹⁴C]IMP per il mutante G99A; b) grafico dei doppi reciproci o di Lineweaver-Burk: 1/V è posto in funzione di 1/[IMP], l’intercetta

sulle ordinate è 1/Vmax e l’intercetta sulle ascisse è -1/Km

G99A

K_m Ino a)

0 1 2 3 4

0 0,5 1 1,5 2 2,

[Ino] mM

U/ml

5

b)

0 0,4 0,8 1,2

-2 0 2 4 6

1/[Ino]

1/V

Grafico II: a) Velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di [8-¹⁴C]Ino per il mutante G99A; b) grafico dei doppi reciproci o di Lineweaver-Burk: 1/V è posto in funzione di 1/[Ino], l’intercetta sulle ordinate è 1/Vmax e l’intercetta sulle ascisse è -1/Km

G99V

K_m IMP

a)

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

[IMP] mM

U/ml

b)

0 2 4 6

-30 -20 -10 0 10 20 30 40

1/[IMP]

1/V

Grafico III: a) Velocità della reazione nucleotidasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di [8-¹⁴C]IMP per il mutante G99V; b) grafico dei doppi reciproci o di Lineweaver-Burk: 1/V è posto in funzione di 1/[IMP], l’intercetta sulle ordinate è 1/Vmax e l’intercetta sulle ascisse è -1/Km

G99V

K_m Ino a)

0 0,2 0,4 0,6

0 0,5 1 1,5 2 2,5

[Ino] mM

U/ml

b)

0 2 4 6

-3 -1 1 3 5 7

1/[Ino]

1/V

Grafico IV: a) Velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di [8-¹⁴C]Ino per il mutante G99V; b) grafico dei doppi reciproci o di Lineweaver-Burk: 1/V è posto in funzione di 1/[Ino], l’intercetta sulle ordinate è 1/Vmax e l’intercetta sulle ascisse è -1/Km

G99P

0 1 2 3 4

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

[IMP] mM

U/ml

b)

0 0,4 0,8 1,2 1,6

-10 0 10 20 30 40

1/[IMP]

1/V

Grafico V: a) Velocità della reazione nucleotidasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di [8-¹⁴C]IMP per il mutante G99P; b) grafico dei doppi reciproci o di Lineweaver-Burk: 1/V è posto in funzione di 1/[IMP], l’intercetta sulle ordinate è 1/Vmax e l’intercetta sulle ascisse è -1/Km

G99P

0 1 2 3 4 5

0 0,5 1 1,5 2 2,5

[Ino] mM

U/ml

b)

0 0,3 0,6 0,9

-2 -1 0 1 2 3 4 5 6

1/[Ino]

1/V

Grafico IV: a) Velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di [8-¹⁴C]Ino per il mutante G99P; b) grafico dei doppi reciproci o di Lineweaver-Burk: 1/V è posto in funzione di 1/[Ino], l’intercetta sulle ordinate è 1/Vmax e l’intercetta sulle ascisse è -1/Km

G99A

a)

0 2 4 6

0 2 4 6 8

[MgCl₂] mM

U/ml

10

b)

0 0,2 0,4 0,6 0,8

-1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5

1/[MgCl₂]

1/V

Grafico VII: a) Velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di MgCl2 per il mutante G99A; b) grafico di Lineweaver-

Burk: 1/V è posto in funzione di 1/[MgCl2], l’intercetta sulle ascisse è –1/K50.

G99V

a)

0 0,3 0,6 0,9

0 2 4 6 8

[MgCl₂] mM

U/ml

10

b)

0 1 2 3 4

-1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5

1/[MgCl₂]

1/V

Grafico VIII: a) Velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di MgCl2 per il mutante G99V; b) grafico di Lineweaver- Burk: 1/V è posto in funzione di 1/[MgCl2], l’intercetta sulle ascisse è –1/K50.

G99P

a)

0 0,1 0,2 0,3 0,4

0 2 4 6 8

[MgCl₂] mM

U/ml

10

b)

0 4 8 12 16 20

-1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5

1/[MgCl2]

1/V

Grafico IX: a) Velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di MgCl2 per il mutante G99V; b) grafico di Lineweaver- Burk: 1/V è posto in funzione di 1/[MgCl2], l’intercetta sulle ascisse è –1/K50.

G99A

a)

0 2 4 6 8

0 1 2 3 4 5 6 7

[ATP] mM

U/ml

b)

0 0,2 0,4 0,6 0,8

-1,5 -0,5 0,5 1,5 2,5

1/[ATP]

1/V

Grafico X: a) Velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di ATP per il mutante G99A; b) grafico di Lineweaver- Burk: 1/V è posto in funzione di 1/[ATP], l’intercetta sulle ascisse è –1/K50.

G99V

a)

0 0,3 0,6 0,9

0 1 2 3 4 5 6 7

[ATP] mM

U/ml

b)

0 1 2 3 4

-1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5

1/[ATP]

1/V

Grafico XI: a) Velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di ATP per il mutante G99V; b) grafico di Lineweaver- Burk: 1/V è posto in funzione di 1/[ATP], l’intercetta sulle ascisse è –1/K50.

G99P

0 0,1 0,2 0,3

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

[ATP] mM

U/ml

b)

0 5 10 15 20 25

-2 0 2 4 6

1/[ATP]

1/V

Grafico XII: a) Velocità della reazione fosfotransferasica (U/ml) in funzione di concentrazioni crescenti di ATP per il mutante G99P; b) grafico di Lineweaver- Burk: 1/V è posto in funzione di 1/[ATP], l’intercetta sulle ascisse è –1/K50.

3.3 DOSAGGI IN ASSENZA E IN PRESENZA DI INOSINA

Per chiarire i risultati dei parametri cinetici calcolati, in particolare i valori del rapporto 5’N/PHT per il G99V e il G99P, sono stati eseguiti ulteriori dosaggi per stimare le varie attività dell’enzima in assenza e in presenza dell’inosina come accettore del fosfato. Anche in questo caso sono stati utilizzati come controllo i risultati ottenuti dai dosaggi eseguiti sull’enzima wild-type.

La velocità di scissione dell’IMP, in assenza e in presenza di inosina, e l’attività fosfotransferasica vengono misurate con il metodo radiochimico, mentre l’attività fosfatasica viene stimata utilizzando il dosaggio colorimetrico con il metodo di Chifflet, che misura il fosfato inorganico rilasciato dall’enzima. L’esecuzione del saggio in assenza e in presenza di inosina evidenzia l’effetto provocato dall’intervento del nucleoside accettore sulla velocità complessiva della reazione e sulla velocità di idrolisi.

WT

Ino

H2O

IMP + E

E

P E + P

Ino

H2O

IMP + E

E

P E + P

( 41.72 U/mg ) ( 16.05 U/mg ) Ino

IMP + E

Per quanto riguarda il wild-type, in assenza dell’accettore del fosfato, dall’idrolisi dell’IMP si ha la liberazione di Ino e Pi, ma, come mostrato sopra, le due velocità, che dovrebbero essere uguali, appaiono leggermente diverse. La discrepanza tra i due valori è dovuta al fatto che la formazione di Ino e Pi sono state misurate con due metodiche diverse

e non direttamente paragonabili. In particolare il dosaggio colorimetrico con il metodo di Chifflet, benché sia un saggio molto sensibile e in grado di rilevare anche nanomoli di Pi, calcola la quantità di fosfato rilasciato dall’enzima estrapolandola da una curva di taratura, costruita utilizzando una soluzione di sodio fosfato bibasico (Na2HPO4) preparata nei nostri laboratorio. Poiché il Pi formato dall’enzima viene ricavato in modo indiretto e si lavora con quantità molto piccole di Pi, anche la possibilità di incorrere in un errore è maggiore.

In presenza dell’Ino, il gruppo fosfato derivante dall’IMP può essere trasferito sull’accettore del fosfato con l’attività fosfotransferasica; questa reazione è favorita rispetto all’attività idrolizzante, ma poiché si utilizza una concentrazione di inosina sottosaturante il fosfato viene ripartito tra l’acqua e l’inosina. La somma dell’attività idrolizzante e fosfotransferasica rappresenta quindi l’attività complessiva, che dovrebbe corrispondere alla velocità di scissione dell’IMP. Anche in questo caso i valori non corrispondono, per il fatto che le due metodiche, i dosaggi radiochimici e il dosaggio colorimetrico, non sono direttamente paragonabili (le considerazioni riguardo questi due tipi di saggio valgono anche per i valori dei mutanti mostrati di seguito). Confrontando l’attività catalitica dell’enzima in assenza e in presenza dell’accettore del fosfato, possiamo inoltre osservare che la presenza dell’inosina determina un incremento di circa il 20% della prima fase della reazione..

G99V

Ino

H2O

IMP + E

E

P E + P

Ino

H2O

IMP + E

E

P E + P

+ 20%

( 3.45 U/mg ) ( 1.02 U/mg ) Ino

IMP + E

Per il mutante G99V possiamo osservare che, come per il wild-type, la presenza dell’inosina come accettore del fosfato determina un incremento del 20% della prima fase della reazione; poiché in questo mutante la Km per l’inosina si è ridotta, l’attività enzimatica avviene in realtà a concentrazioni saturanti del nucleoside. In tali condizioni per il wild-type avremmo osservato un completo spostamento della reazione verso la formazione dell’IMP e un maggior effetto attivante dell’inosina, perciò la sostituzione della glicina con la valina sembra aver creato un enzima in cui l’attività fosfotransferasica è sfavorita rispetto alla liberazione di Pi. Come rilevato dai precedenti parametri cinetici, l’attività del G99V si mostra molto più bassa rispetto ai valori registrati per il wild-type.

G99P

Ino

H2O

IMP + E

E

P E + P

Ino

H2O

IMP + E

E

P E + P

( 9.56 U/mg ) ( 3.85 U/mg ) Ino

IMP + E

Nel G99P, in condizioni semisaturanti di inosina, la prima fase della reazione presenta un incremento del 50%, indicando che in questo mutante l’inosina ha un effetto attivante molto più pronunciato rispetto a quello del wild-type e che il trasferimento del fosfato al nucleoside accettore avviene più prontamente del suo trasferimento all’acqua.

3.4 ANALISI SPETTROFLUORIMETRICHE

I parametri cinetici del G99P ci hanno fatto sospettare che l’enzima possa essere bloccato in una conformazione più attiva e più stabile. Per valutare l’effetto delle tre mutazioni sulla stabilità della proteina e l’efficacia del magnesio nello stabilizzare l’enzima nella forma attiva, sono state eseguite delle analisi spettrofluorimetriche in assenza (controllo) e in presenza dello ione metallico; il segnale dinamico di fluorescenza emesso dai residui di triptofano presenti nella proteina eccitata a 295 nm è stato misurato a vari tempi di incubazione.

Per l’enzima wild-type è stato osservato che con il passare del tempo si ha una rapida riduzione del segnale e uno spostamento del picco di massima intensità verso il rosso, fino ad osservare una completa assenza del segnale già dopo quattro ore; questi dati indicano una totale denaturazione dell’enzima confermata con un dosaggio radiochimico che rivela una completa assenza di attività. L’aggiunta di 20 mM MgCl2 nella miscela di incubazione sembra impedire la denaturazione della proteina, perché dopo essere trascorse quattro ore la massima intensità del segnale è stabile a 335 nm e appare solo moderatamente ridotta, infatti l’enzima mostra ancora buona attività.

Il segnale di fluorescenza proveniente dall’enzima mutante G99A, in assenza e in presenza di magnesio, mostra un andamento simile a quello osservato per l’enzima ricombinante wild-type. Al contrario il segnale di fluorescenza relativo al G99V in assenza di magnesio indica che l’enzima mutato è più stabile del wild-type, perché al passare del tempo l’intensità della fluorescenza non si riduce in modo così eclatante e non si osserva neanche uno spostamento del picco di massima intensità verso il rosso; la presenza di 20 mM MgCl2 nella miscela di incubazione non provoca l’effetto osservato nel wild-type, ma addirittura sembra destabilizzare la proteina, perché rispetto al controllo i valori dell’intensità della fluorescenza sono più bassi. Per il mutante G99P si può osservare che, sia in assenza che in presenza di 20 mM MgCl2 nella miscela di incubazione, il segnale di fluorescenza mantiene la massima intensità a 335 nm e mostra al passare del tempo solo una moderata riduzione, indicando che la mutazione ha creato un enzima più stabile rispetto al wild-type.

a) WILD-TYPE CONTROLLO

b) WILD-TYPE + MgCl2

Figura 1: Segnale dinamico di fluorescenza emesso dai residui di triptofano presenti nella proteina eccitata a 295 nm e misurato a vari tempi di incubazione dell’enzima Wild-type in assenza (CONTROLLO) e in presenza di 20 mM MgCl2.

a) G99A CONTROLLO

b) G99A + MgCl2

Figura 2: Segnale dinamico di fluorescenza emesso dai residui di triptofano presenti nella proteina eccitata a 295 nm e misurato a vari tempi di incubazione del mutante G99A in assenza (CONTROLLO) e in presenza di 20 mM MgCl2.

a) G99V CONTROLLO

b) G99V + MgCl2

Figura 3: Segnale dinamico di fluorescenza emesso dai residui di triptofano presenti nella proteina eccitata a 295 nm e misurato a vari tempi di incubazione del mutante G99V in assenza (CONTROLLO) e in presenza di 20 mM MgCl2.

a) G99P CONTROLLO

b) G99P + MgCl2

Figura 4: Segnale dinamico di fluorescenza emesso dai residui di triptofano presenti nella proteina eccitata a 295 nm e misurato a vari tempi di incubazione del mutante G99P in assenza (CONTROLLO) e in presenza di 20 mM MgCl2.