Elementi di Micologia

Jean-Denis Docquier

Laboratorio di Fisiologia e Biotecnologia dei Microrganismi Dipartimento di Biologia Molecolare

Policlinico "Le Scotte", Viale Bracci, II piano, V lotto Tel. 0577 23 3134

jddocquier@unisi.it

Elementi di Micologia

I° anno - Laurea Magistrale Farmacia - 2012-2013

Recupero lezioni Prof. Zazzi:

3 giugno, 9-11, aula 9 4 giugno, 9-11, aula 12

Appelli di esame (aula informatica):

19 giugno, 9-14.

4 luglio, 9-14.

19 luglio, 9-14.

5 settembre, 9-14.

23 settembre, 9-14.

 Completa mancanza di tessuti differenziati e elementi conduttori

 Sistema riproduttivo attraverso elementi detti spore e non attraverso uno stadio embrionale come avviene per piante e animali

Ubiquitari in natura:

• negli strati superficiali del suolo

• come commensali di animali e piante



eucarioti



immobili



chemiosintetici



eterotrofi (mancano di clorofilla e sono dipendenti dei composti

organici per la nutrizione)



parete cellulare rigida



uni o pluricellulari



si riproducono per mezzo di spore



aerobi (facoltativi)



parassiti, saprofiti e simbionti

TALLO: corpo vegetativo di un fungo

Un lievito, Saccharmyces cerevisiae, è stato utilizzato fin dai tempi più remoti per processi alimentari come la lievitazione del pane, la fermentazione del vino e della birra

Penicillium italicum: muffa verde-blu che fa marcire le arance

Penicillium camemberti e P. rocqueforti giocano un ruolo fondamentale nella manufattura dei formaggi di tipo Camembert, Brie e Roquefort

Penicillum notatum e Penicillium chrysogenum, ed un suo metabolita, la penicillina, hanno consentito a Fleming nel 1928 di anticipare l’era

antibiotica

Il Tolypocladium niveum produce clicloserina, un immunosoppressore utilizzato nella terapia della sclerosi e nei trapianti e alcuni lieviti vengono utilizzati in ingegneria genetica per la produzione di insulina

Aggregati

PLURICELLULARI

Funghi filamentosi MUFFE o

L’insieme delle IFE viene detto

MICELIO

IFE

Ife non settate Ife settate

Micelio AEREO:

Strutture specializzate alla riproduzione

Conferisce l’aspetto tipico della colonia

Micelio VEGETATIVO:

Assorbimento di materiale nutritizio dal terreno

UNICELLULARI

Miceti lievitiformi LIEVITI o

Dimensioni

> cellula batterica

< cellula animale

LA CELLULA FUNGINA

Capsula

polisaccaridica (in alcuni casi)

PARETE CELLULARE RIGIDA

reticolo endoplasmico complesso di Golgi

nucleo compartimentato con cromosomi lineari

mitocondri membrana plasmatica

contenente ERGOSTEROLO

Citoplasma Membrana

plasmatica

Mannoproteine

Chitina (poli-NAG)

b–(1,3)-glucano b–(1,6)-glucano

Struttura pluristratificata in livelli con particolari composizioni chimiche



Caratterizza la forma del micete



Proprietà antigeniche



Media interazioni con la cellula ospite

ergosterolo



Contiene ergosterolo



Controlla lo scambio di metaboliti con l’ambiente esterno



Coinvolta nella sintesi della parete cellulare

I miceti si riproducono per mezzo di strutture specializzate: SPORE o CONIDI

Due modalità di riproduzione:

 sessuata

 asessuata

Le due forme possono essere presenti, escludersi o

alternarsi nel ciclo vitale di un fungo con ritmi e frequenze diversi nelle varie specie

Riproduzione per

GEMMAZIONE

(budding yeasts):

BLASTOGONIA

Sistema in cui le cellule figlie compaiono come protuberanze dalla cellula madre dalla quale poi si distaccano diventando

autonome, diversa dalla scissione perché avviene una ripartizione diseguale del citoplasma

Attraverso un processo mitotico vengono prodotte strutture specializzate

denominate spore o conidi in grado di generare un nuovo individuo

I conidi hanno il vantaggio di essere molto leggeri, altamente resistenti, facile disseminazione ambientale

Accrescimento longitudinale delle ife

POTENZIALITA’ DI ESPANSIONE INFINITA



Conidiospore: i conidi si distaccano da un conidioforo posto su una ifa aerea



Sporangiospore: le spore vengono

prodotte all’interno di un organo detto

sporangioforo



Artrospore: le spore sono prodotte per

frammentazione delle ife vegetative

Le spore asessuate possono essere:

La diversa morfologia dei conidi

permette il riconoscimento delle

varie specie di funghi filamentosi

Subordinata alla produzione di milioni di spore diffuse attraverso vento, acqua o insetti

La spora sessuale di un determinato sesso nelle condizioni più favorevoli germina formando un filamento di cellule detto

micelio primario

Per poter completare il ciclo biologico e creare il micelio secondario l’ifa primaria generata da una spora con carica

“maschile” si unisce una a carica sessuale opposta per formare il

micelio secondario che genererà i corpi fruttiferi

Spore sessuali: Zigospore Ascospore Basidiospore

Caratteristica peculiare di alcuni miceti patogeni

Capacità, reversibile, di presentarsi morfologicamente distinti

nella forma parassitaria o tessutale, in genere lievitiforme, e nella forma colturale o vegetativa, in genere filamentosa

La conformazione è riferibile a:



scarso adattamento dei miceti alle condizioni ambientali (es.

temperatura)



meccanismi di regolazione genica esercitati da temperatura, concentrazione ioni, variazioni pH

Abituali saprofiti, l’infezione rappresenta un evento accidentale

Molti prodotti considerati fattori di virulenza sono funzionali a scopi metabolici e riproduttivi

Nelle muffe il meccanismo principale è l’alta capacità di penetrazione nei

tessuti e la capacità di adattarsi alle condizioni avverse dei tessuti parassitati

Resistenza alla fagocitosi:

 dimensioni del tallo fungino

 capacità di interferire con l’attività fagacitaria per presenza di strutture cellulari antifagocitarie: mannani (

C. albicans

), a 1-3 glucano (

Blastomyces dermatitidis

,

H. capsulatum

,

P. brasiliensis

), capsula (

Cryptococcus neoformans

), recettori del complemento che inibiscono l’opsonizzazione

Adesività:

 meccanismi non specifici: forza idrofobiche, cariche elttrostatiche

 meccanismi specifici: interazione tra adesine e recettori (chitina, glucani, mannani: possibili adesine)

Pleomorfismo: pluralità di forme (dimorfismo)

Produzione di tossine: alcune interferiscono con la risposta immunitaria



Candida albicans

: canditossina, tossine a basso pm



Aspergillus

spp.: aflatossina, gliotossina, fumigatossina, restrictocina

Produzione di enzimi idrolitici: proteasi (

C. albicans

), fosfolipasi, lipasi, serinproteasi (

Aspergillus

spp.), cheratinasi (dermatofiti), fenolo-ossidasi (

Cryptococcus neoformans

)

Barriere meccaniche

Sostanze antimicrobiche non specifiche Fagocitosi e killing intracellulare

Immunità umorale e cellulo-mediata

Le specie fungine esplicano la patogenicità attraverso:

 Parassitismo diretto (micosi)

 Produzione di micotossine (intossicazioni  micotossicosi)

 Intossicazioni alimentari da ingestione di funghi macroscopici velenosi (micetismo)

 Reazioni allergiche

La maggior parte delle infezioni da funghi sono lievi ed autolimitanti Un numero limitato di funghi (generalmente dimorfici) possono

causare malattia in soggetti altrimenti sani

MICOTOSSINE DI INTERESSE UMANO

Micotossine Effetto biologico Microrganismo

Aflatossina Carcinogenesi epatica A. parasiticus, A. flavus Tricoteceni

Tossicità dermatologica;

indebolimento del sistema immunitario; inibizione della sintesi proteica; effetto teratogeno

Fusarium, Acremonium,

Stachyobotris, Trichoderma, Trichothecium,

Verticimonosporium Antrachinoni Epatotossico, carcinogenesi

epatica Penicillium, Aspergillus

Citreoviridine Neurotossica Penicillium

Naftochinoni Epatotossico Trychophyton, Penicillium

viridicatum

Ocratossine Inibizione della tRNA sintetasi Aspergillus, Penicillium Zearalenone Estrogenico, teratogeno Fusarium graminearum Cloropeptide Epatotossico, diminuisce la

sintesi del glicogeno epatico Penicillium islandicum

Le micotossine possono esercitare effetti tossici acuti o cronici

Ne esistono numerosi tipi (B1, B2, G1, G2 e i loro derivati metabolici M1 ed M2).

Sono fortemente sospettate di esplicare un’azione tossica, mutagena e cancerogena a carico del fegato e tossica per il sistema immunitario

Difficili da eliminare perché sono organismi estremamente termoresistenti

Gli alimenti più esposti alla contaminazione sono i cereali (mais, frumento, riso, orzo, segale, ecc.) e derivati (farina e prodotti da forno, polenta ecc.), semi oleaginosi (arachidi,girasole, ecc.), frutta secca ed essiccata, legumi, spezie, caffé e cacao

Le condizioni ideali per lo sviluppo dell’aflatossina sono:

1. temperatura compresa tra 15 e 40 °C (optimum 20-25 °C) 2. umidità relativamente elevata superire al 70%

3. pH i cui valori siano compresi tra 4 e 8 4. presenza di ossigeno

 Candida spp.

 Cryptococcus neoformans

 Malassezia spp.

 Dermatofiti

 Aspergillus spp.

 Pneumocystis jirovecii ⁽ Pneumocystis carinii ^{sp. f.} hominis ⁾

 Miceti con dimorfismo temperatura-dipendente

Specie

Candida albicans

Candida tropicalis Candida parapsilosis Candida glabrata Candida krusei

Specie clinicamente più rilevante

Altre specie clinicamente rilevanti

Habitat:

C. albicans

: commensale umano

distretti colonizzati:

- cavo orale - intestino

- vagina Altre specie: più frequentemente ambientali (acque, suolo, vegetali)

Nei terreni di coltura in genere cresce come LIEVITO

Nei tessuti infetti sono possibili PSEUDOIFE e FORME FILAMENTOSE

Candida albicans

può essere considerata un micete dimorfo

Micete lievitiforme

(cresce bene a 25 - 37°C) Habitat:

saprofita molto diffuso nell’ambiente abbonda negli escrementi di piccione

Provvisto di abbondante CAPSULA POLISACCARIDICA - fattore di virulenza

- colonie di aspetto mucoide

- evidenziabile con inchiostro di china

Miceti filamentosi ad ampia diffusione ambientale Caratteristica morfologia delle strutture conidiali

Il genere Aspergillus comprende varie specie:

 Aspergillus fumigatus

(la specie clinicamente più importante)



Aspergillus niger



Aspergillus flavus

Distinguibili per caratteri macro- e microscopici

Aspergillus niger

SPECIE SUPERFICIE VERSO

A. clavatus Blu-verde Bianco, marrone con il tempo

A. flavus Giallo-verde Dorato, marrone-rosso

A. fumigatus Blu-verde al grigio Bianco fino al marrone A. glaucus Verde con aree gialle Giallo fino al marrone

A. nidulans Verde, camoscio o giallo Rosso porpora fino a verde oliva

A. niger Nero Bianco al giallo

A. terreus Cannella fino al marrone Bianco al marrone A. versicolor Inizialmente bianco, vira poi al giallo,

marrone-rosso, verde pallido o rosa Bianco al giallo o rosso porpora

A. flavus

Aspergillus fumigatus

VANTAGGI:

- rapidità - semplicità



esame microscopico a fresco



esame microscopico dopo colorazione di Gram



esame microscopico dopo colorazione con lattofenolo



esame microscopico dopo colorazione con inchiostro di china



esame microscopico dopo colorazione con calcofluor

TERRENI DI COLTURA Non selettivi

Sabouraud dextrose agar: pH 5.6 favorisce la crescita dei miceti invece che dei batteri

SAB Heart infusion (SABHI):

arricchito di nutrienti, adatto per Blastomyces e Histoplasma

Potato dextrose

Selettivi

Mycosel (SAB con antibiotici):

cloramfenicolo; cyclohexamide inibiscono la crescita dei saprofiti

Chromagar: terreno cromogenico per lieviti

Czapek agar: usato nella

coltivazione dei microrganismi capaci di utilizzare nitrogeno inorganico;

raccomandato per l’isolamento di Aspergillus e Penicillium

Corn meal agar

Sabauraud dextrose agar

Terreno cromogeno per

lieviti Czapek

MUFFE Identificazione microscopica in base ai conidi e conidiofori

LIEVITI  mediante terreni cromogenici

 mediante test biochimici

E-test: MIC in agar diffusione

Sensititre: MIC in microdiluizione

Caratteristiche di un antifungino ideale:



Bersaglio selettivo



Attività fungicida



Elevata potenza



Ampio spettro



Bassa tossicità



Scarse o assenti interazioni farmacologiche

Disponibili in numero molto minore degli antibatterici

- più difficile trovarne data la natura eucariotica della cellula fungina

- l’impatto delle infezioni fungine è minore di quello delle infezioni batteriche

• Antibiotici POLIENICI

• Chemioterapici AZOLICI

• Allilamine

• Griseofulvina

• 5'-Fluorocitosina

• Echinocandine

Amfotericina B (uso sistemico)

Nistatina (uso topico)

Il numero di doppi legami coniugati è direttamente proporzionale

all’attività antifungina e inversamente proporzionale alla tossicità in cellule di mammifero. I comporti con 7 doppi legami, come l’amfotericina B, non solo sono circa 10 volte più tossici per la cellula fungina, ma sono gli unici

che possono essere impiegati per terapie sistemiche nell’uomo

Relativa nefrotossicità (Amfotericina B) (migliorata dalle formulazioni liposomiali)

Meccanismo di azione: legame a membrane contenenti ergosterolo formazione di canali transmembranari

(effetto permeabilizzante)

Amfotericina B è pochissimo solubile in acqua.

Complessata con acido desossicolico per somministrarla ev.

Più recentemente formulazioni complessate con lipidi e incapsulate in liposomi ne hanno diminuito la tossicità e permettono di avere livelli plasmatici più elevati del farmaco

SQUALENE

Squalene epoxide LANOSTEROL

14-alpha-demethyl lanosterol Zymosterol

Fecosterol ERGOSTEROL

Squalene epossidasi

Lanosterolo 14-alpha demetilasi

ALLILAMINE:

Naftifina Terbinafina

AZOLI:

Ketoconazolo Fluconazolo Itraconazolo Voriconazolo

Caratterizzate dalla presenza di un gruppo allilaminico (naftifina e terbinafina) Butenafina e tolnaftato vengono annoverati in questa classe anche se hanno struttura diversa perché accomunati dallo stesso meccanismo d’azione

Indicazioni: micosi cutanee e degli annessi (Dermatofizie) (il farmaco si concentra nella cute e negli annessi)

Meccanismo di azione: inibizione sintesi ergosterolo

bersaglio: SQUALENE EPOSSIDASI

Gli azoli sono classificati come:

1. imidazoli se possiedono due atomi di azoto nell’anello azolico (ketoconazolo)

2. triazoli se contengono tre atomi di azoto (fluconazolo, itraconazolo e voriconazolo, posaconazolo e ravuconazolo)

Meccanismo di azione: inibizione sintesi ergosterolo

bersaglio: LANOSTEROLO DEMETILASI

I triazoli hanno tossicità minore degli imidazoli a causa della loro maggiore specificità per i citocromi P450 fungini rispetto a quelli delle cellule di mammiferi

 Ridotta permeabilità che impedisce l’ingresso del farmaco nella cellula

 Aumentata produzione enzima bersaglio Erg11p per incrementata espressione del gene codificante ERG11

 Alterazioni enzima bersaglio per mutazioni che ne diminuiscono l’affinità con gli azoli

 Pompe da efflusso che estrudono il farmaco e non ne permettono l’accumulo, sono pompe do tipo “ABC

trasporter”

> Bassa tossicità

> Frequente l’insorgenza di resistenza a causa di mutazioni a carico dei tre enzimi chiave

Meccanismo di azione: Inibizione della sintesi degli acidi nucleici Inibizione della sintesi proteica

5-FLUOROCITOSINA 5-FLUOROURACILE

Citosina deaminasi

5-FLUOROURIDINA TRIFOSFATO incorporato nel RNA della cellula fungina e

determina inibizione della sintesi proteica 5-FLUORODESOSSIURIDINA

MONOFOSFATO Inibitore della timidilato sintetasi, enzima chiave nella

sintesi del DNA

Trasportato all’interno della cellula ad opera dell’enzima citosina permeasi

Uridina monofosfato fosforilasi

Si pensa che si leghi con la proteina tubulina, interferendo con il corretto funzionamento del fuso mitotico e quindi interferisca con la divisione cellulare

Meccanismo di azione:

Indicazioni: micosi superficiali delle unghie

Ergosterolo Meccanismo di azione: inibisce specificatamente la sintesi del b-1-3-D-

glucano, componente essenziale per l’integrità della parete; provoca un’aumentata permeabilità della parete e la conseguente lisi della cellula

Cryptococcus neoformans non risulta sensibile Zygomycetes sono naturalmente resistenti