RIASSUNTO
Le 5' nucleotidasi sono una famiglia di enzimi estremamente conservati filogeneticamente (si ritrovano sia nei batteri che negli eucarioti più evoluti come i vertebrati) e si differenziano, all'interno della stessa specie, sia per distribuzione tissutale e subcellulare sia per specificità di substrato. La caratteristica comune di questa classe di enzimi è la loro capacità di idrolizzare 5'-deossiribonucleosidi e/o ribonucleosidi monofosfato. Nell'uomo sono state isolate e caratterizzate sette 5'-nucleotidasi: una ancorata esternamente alla membrana citoplasmatica (eN), una mitocondriale (mdN) e cinque citosoliche.
Tra le nucleotidasi citosoliche, la 5'-nucleotidasi II (cN-II) è ubiquitaria e idrolizza preferenzialmente IMP, GMP e i loro deossiderivati. Questo enzima, oltre ad avere una attività fosfatasica, possiede anche un’attività fosfotransferasica. Durante l’idrolisi di un nucleoside monofosfato, l’enzima si fosforila e rilascia come primo prodotto, il nucleoside;
il fosfato legato all’enzima può essere idrolizzato da una molecola d’acqua oppure può essere trasferito ad un opportuno nucleoside accettore. In vivo è stato dimostrato che la cN- II si comporta come un’idrolasi, mentre resta ancora incerto un eventuale ruolo fisiologico come fosfotransferasi.
La cN-II ha una struttura omotetramerica con subunità di 61 kDa e la sua attività enzimatica, dipendente dal magnesio, è modulata allostericamente da specifici effettori (ATP, ADP e 2,3 bisfosfoglicerato) e inibitori (fosfato inorganico).
Questa nucleotidasi riveste un importante ruolo nel metabolismo dei nucleotidi purinici;
attualmente si ritiene che la sua funzione principale sia quella di controllare la disponibilità intracellulare del precursore purinico IMP, prevenendone la perdita o l’accumulo in funzione delle fluttuazioni della carica energetica. Inoltre è stato ipotizzato che, grazie alla attività fosfotransferasica, la cN-II possa partecipare attivamente alla sintesi de novo del DNA, spiegando così l'aumento della attività enzimatica in tessuti in rapida crescita come il fegato rigenerante di ratto o le cellule tumorali.
Nonostante risulti ancora incerto un possibile ruolo fisiologico della cN-II come fosfotransferasi, già da alcuni anni è stata dimostrata la sua capacità di fosforilare alcuni analoghi nucleosidici utilizzati per la cura delle infezioni virali. Inoltre l’attività nucleotidasica della cN-II potrebbe essere implicata anche nell’impedire l’attivazione di alcuni analoghi purinici utilizzati nelle terapie antitumorali e quindi essere responsabile dell’insorgenza di chemioresistenze. L'aumento della sua attività enzimatica in fibroblasti ed emazie di pazienti affetti da sindrome di Lesh-Nyhan, una grave patologia neurodegenerativa, fa pensare ad un coinvolgimento della cN-II in tale sindrome. Studi
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strutturali e funzionali sulla cN-II risultano perciò importanti per poter perfezionare l’efficacia terapeutica dei farmaci utilizzati in queste patologie.
Recentemente è stato dimostrato che, durante la catalisi, la cN-II si fosforila sul primo aspartato della sequenza aminoacidica DMDYT; un motivo aminoacidico simile, il motivo I (DXDX(T/V)), è presente in tutti i membri della superfamiglia delle aloacido dealogenasi (HAD), per questo si ritiene che la cN-II appartenga a tale superfamiglia. Altri motivi strutturali sono presenti sia nella superfamiglia delle HAD che nella cN-II: il motivo II, caratterizzato dalla presenza di un solo aminoacido altamente conservato (Thr o Ser), ritenuto in grado di stabilizzare il substrato formando un legame ad idrogeno; il motivo III, costituito da una lisina coinvolta nella stabilizzazione dell'intermedio covalente; il motivo IV, costituito da due residui di aspartato carichi negativamente coinvolti nella coordinazione dello ione Mg2+.
Nonostante la bassa omologia di sequenza, i componenti della superfamiglia delle HAD condividono una stessa struttura tridimensionale formata da un α/β core domain in cui è localizzato il sito attivo, costituito da quattro loops che contengono i motivi consenso sovracitati.
Alcuni membri della superfamiglia delle HAD presentano un secondo dominio per il riconoscimento del substrato, denominato cap domain, che agisce come un cappuccio sopra il sito catalitico. La natura e la localizzazione del cap domain divide la superfamiglia HAD in tre sottogruppi: 1) un sottogruppo con un piccolo cap domain formato da più α- eliche localizzato tra il loop 1 e 2 del core domain; 2) un sottogruppo con un β-sandwich domain tra il loop 2 e 3; 3) un sottogruppo privo del cap domain. Il cap domain è connesso al core domain e muovendosi come un corpo rigido legato ad un perno apre e chiude il sito catalitico al solvente.
Nel mio lavoro di tesi ho voluto valutare la presenza e l'eventuale localizzazione del cap domain nella cN-II. È stato ipotizzato che la glicina 99 possa essere la migliore candidata nel conferire flessibilità al cap domain, perciò, per indagare sul ruolo della Gly99, sono stati creati tre mutanti sito-specifici: G99A, G99V e G99P, nei quali la glicina 99 è stata sostituita rispettivamente con Alanina, Valina e Prolina. Tutti e tre i mutanti sono stati sottoposti a dosaggi radioenzimatici per valutare eventuali variazioni dei seguenti parametri cinetici: attività specifica nucleotidasica e PHT, affinità sia per i substrati principali (IMP e Inosina) che per l'attivatore fisiologico ATP e per il catione bivalente Mg2+. Sono state anche calcolate l’efficienze catalitiche (Kcat/Km) ed il rapporto tra l’attività nucleotidasica e l’attività fosfotransferasica. Inoltre, attraverso analisi spettrofluorimetriche in assenza e in presenza di Mg2+, sono andata a valutare l’effetto
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stabilizzante di questo metallo. I risultati ottenuti hanno evidenziato una variazione dei parametri cinetici dei mutanti rispetto all’enzima wild-type, suggerendo che la glicina 99 entri a far parte dell’architettura del sito attivo.
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