Cymbopogon citratus e Ocimum gratissimum

Cymbopogon citratus e Ocimum gratissimum

Cymbopogon citratus (DC) Stapf. (Graminacee)

Sinonimi

Andropogon citratus, A. ceriferus

Heckel, A. nardus L. var ceriferus

(L.) Rendle. Nomi comuni

Lemon grass, Citronelle, Fever grass.

Nomi africani

Bambara: ce kala; Igbo: nche awuta, ahihia tii; Turag (Arab): hhashel laymum; Yoruba: koriko oyibo, koko oba.

Descrizione botanica

Pianta erbacea bulbosa perenne, alta fino a 120 cm. Le foglie sono filiformi a forma di lame coniche ad entrambe le estremità, sono lunghe fino a 90 cm e larghe 1.25 cm. Le infiorescenze sono a pannocchia e sono lunghe da 30 a 60 cm. L’intera pianta quando viene spezzata emana un caratteristico odore di limone.

Habitat e distribuzione

La pianta richiede un clima caldo con esposizione al sole. È coltivata in Kenya, Tanzania e nella Repubblica Malgascia.

Usi medicinali

L’infuso di questa pianta è usato principalmente nelle febbri e nell’ittero. Gli estratti sono inoltre dispensati per le proprietà diuretiche, emmenagoghe, diaforetiche, carminative, antireumatiche e antidiarroiche. Gli oli essenziali sono largamente usati in profumeria (Iwu, 1993).

Composizione chimica dell’olio essenziale

Percentuale dei principali costituenti dell’olio essenziale di C. citratus, coltivato in diverse regioni.

Origine Citrale Mircene Geraniolo Limonene

Brasile 40.7-75.4 - - - Sud Canara (India) 67 - 12 6 Mali (Africa occidentale) 75 geraniale/nerale 2:1 6.2-9.1 3.0-5.6 - Cuba geraniale 49.5 nerale 38.2 - - - Filippine 69.39 - - - - = non riportato

(Barbosa et al., 2008); (Chandrashekar et al., 2006); (Sidibe et al., 2001); (Pino et al., 2000); (Torres e Ragadio, 1996); (Negrelle e Gomes, 2007).

Ocimum gratissimum L. (Labiate)

Sinonimi

O. viride Willd., O. guineense

Schum. et Thonn.

Nomi comuni

fever plant, fever leaf, fever plant of Sierra Leone, Tea Bush.

Nomi africani

Ashanti: nunum; Bini: ihiri eziza, aramogho; Ewe: debeshui, beblosi; Hausa: dai doya ta gida; Igbo: nchu-anwu; Efik: ntion; Malinke: su-guen-fira; Mandingo: sise-jambo; Mende: kumoi, kumwi; Timme: e-b’onto, o-gbonto; Yoruba: efinrin.

Descrizione botanica

Piccolo arbusto eretto con molti rami, generalmente alto fino a 1 m. Le foglie sono semplici, da lanceolate a oblunghe, lunghe fino a 9 cm e larghe 4.5 cm, con base cuneata e margini dentati; sulla pagina inferiore sono scarsamente pelose e munite di ghiandole. Le erbe se schiacciate hanno un odore aromatico. I fiori di colore bianco-crema o giallastri appaiono in racemi lunghi circa 12 cm. Il calice è piccolo con 2 labbra: il labbro superiore ha una forma sostanzialmente ovale, il labbro inferiore è oblungo e dentato e i petali si combinano per formare il corollino. I frutti sono piccole capsule 4 lobate.

Habitat e distribuzione

La pianta è presente nella foresta di latifoglie e nella savana. Si trova comunemente attorno ai villaggi di capanne e nei giardini, è coltivato per il suo uso medicinale e per le sue caratteristiche aromatizzanti nei cibi.

Usi medicinali

L’intera erba è usata in Africa come febbrifugo e come ingrediente dei molti rimedi contro la malaria. Le foglie schiacciate sono utilizzate nel trattamento della congiuntivite. L’olio ottenuto dalle foglie è considerato altamente antisettico e viene applicato nella medicazione delle ferite, nei gargarismi e per prevenire le infezioni post parto. Le foglie sono usate in Nigeria per le proprietà stomachiche e antidiarroiche. L’olio è usato in molte zone dell’Africa per prevenire le punture di zanzara. L’olio con aggiunta di alcool viene applicato come lozione nelle infezioni della pelle oppure utilizzato nelle bronchiti. L’infuso delle foglie, chiamato “Ocimum tea” o “Bush tea”, viene dispensato come rimedio per la febbre e come diaforetico. Le foglie inoltre vengono applicate esternamente per i dolori reumatici (Iwu, 1993).

Composizione chimica dell’olio essenziale

Percentuale dei principali costituenti dell’olio essenziale di O. gratissimum coltivati in diverse regioni.

Origine Timolo Eugenolo p-Cimene γ-Terpinene cis-Ocimene

Nigeria 32.7 - 25.4 10.8 - Est Kenya - 68.8 - - 7.47 Camerun 47.7 - 8.5 14.3 - Bangladesh 58.2 - - - Sichuan (Cina) - 84.5 - - 4.56 Ruanda 35 11 18 - - = non riportati

(Asawalam et al., 2008); (Matasyoh et al., 2007); (Jirovetz et al., 2005); (Yusuf et al., 1998); (Wu et al., 1990); (Ntezurubanza et al., 1987)

ATTIVITA’ ANTIMALARICA DELL’OLIO ESSENIALE DI CYMBOPOGON CITRATUS E OCIMUM GRATISSIMUM

Sono stati condotti studi atti ad investigare l’attività antimalarica degli oli volatili estratti dalle piante di Cymbopogon citratus e Ocimum gratissimum essendo esse piante che crescono tradizionalmente attorno alle abitazioni in molti paesi dell’Africa occidentale dove, come abbiamo visto in precedenza, sono utilizzate come rimedi popolari.

A tale scopo, a Yaoundé (Camerun) nel settembre del 2002, sono stati raccolti 300 g di foglie fresche di ciascuna specie e sono stati sottoposti a idrodistillazione per 5 ore in apparecchio tipo Clevenger. Gli oli, che sono stati separati dall’acqua tramite decantazione, sono stati resi anidri mediante filtrazione con solfato di sodio anidro.

L’idrodistillazione delle foglie fresche di Ocimum gratissimum e Cymbopogon citratus ha prodotto in entrambe una quantità di olio pari a circa lo 0.5%. Gli oli essenziali estratti dalle due piante hanno mostrato differenze qualitative e quantitative:

• L’olio essenziale di Ocimum gratissimum è caratterizzato da un’elevata percentuale di monoterpeni idrocarburi tra cui i dominanti sono il β-fellandrene (21.1%) e il γ-terpinene (21.9%). Altri costituenti principali sono limonene (11.4%) e timolo (11.2%).

• I costituenti più rappresentativi dell’olio essenziale di Cymbopogon citratus sono il geraniale (32.8%), il nerale (29.0%), il mircene (16.2%) e il β-pinene (10.5%).

OH

H O O

Geraniale Nerale Mircene β-Pinene

Le analisi chimiche, relative alla composizione degli oli essenziali, riportate in questo studio sono comparabili con quelle effettuate da altri autori su Ocimum gratissimum e Cymbopogon

citratus raccolti in altri paesi.

Composizione percentuale degli oli essenziali di O. gratissimum e C. citratus

Componenti Ocimum Cymbopogon gratissimum % citratus % α-Thujene 4.1 - α-Pinene 5.3 - Canfene 0.1 - Sabine 0.3 - β-Pinene 0.9 10.5 Mircene 3.4 16.2 α-Fellandrene 0.5 - δ-3-Carene 2.1 - α-Terpinene 2.9 - ρ-Cimene 1.6 - β-Fellandrene 21.1 - Limonene 11.4 0.1 1,8-Cineole 1.3 - (Z)-β-Ocimene 0.5 0.4 (E)-β-Ocimene 0.2 0.5

γ-Terpinene 21.9 - Sabinene idrato 0.9 - Terpinolene 1.6 - Linaiolo 0.4 2.1 Canfora - 0.1 Terpinene 4-ol 1.4 - α-Terpineolo 0.4 - Nerolo - 0.5 Citronella - 0.5 Nerale - 29.0 Linalil acetato - 3.3 Geraniale - 32.8 Timolo 11.2 0.2 δ-Elemene t - α-Copaene 0.4 - β-Elemene t - β-Cariofillene 2.1 0.1 Alloaromadendrene 0.1 - Germacrene D t - α-Selinene 0.8 - γ-Muurolene 0.3 - γ-Cadinene t - δ-Cadinene 0.5 - Nerolidolo - 0.4 Τ-Cadinolo 0.1 0.1 α-Cadinolo 0.1 - Totale 97.9 96.8 t (<0.1%) = tracce - = non presente

Per valutare l’attività antimalarica dei due oli essenziali sono stati utilizzati topi svizzeri albini maschi. I topi, con pesi che oscillano tra 20 e 25 g, sono stati infettati con il Plasmodium berghei ANKA (ceppo sensibile alla clorochina) e sono stati divisi in cinque gruppi di cinque animali ciascuno. I primi tre gruppi sono stati trattati con l’olio essenziale alle rispettive dosi di 500 mg/kg, 300 mg/kg e 200 mg/kg di peso corporeo. Il quarto gruppo è stato trattato con clorochina per essere utilizzato come gruppo di controllo positivo e l’ultimo gruppo non è stato trattato per essere utilizzato come gruppo di controllo negativo. Le cavie sono state infettate tramite inoculazione intravenosa con 1×107 eritrociti infettati derivanti da topi infetti.

Prima di andare a testare l’attività antimalarica è stata verificata la tossicità dei due estratti volatili i quali, dopo essere stati diluiti con alcool al 10%, sono stati somministrati oralmente tramite sonda a topi non infettati, alla concentrazione di 700 mg/kg una volta al giorno per una settimana. Tale trattamento non ha comportato variazioni di peso corporeo delle cavie e non ha mostrato altri segni visibili di tossicità.

A questo punto è stato possibile procedere con la somministrazione per via orale degli oli essenziali ai gruppi sperimentali dei topi infetti. Una volta passate tre ore dal momento dell’infezione, ciascun topo di ciascun gruppo ha ricevuto la stessa dose pari a 0.5 ml, e nei giorni seguenti la dose è stata data alla stessa ora.

Per stimare l’effetto soppressivo sulla parassitemia, al quarto giorno di trattamento sono stati fatti strisci di sangue periferico su ogni topo. Gli strisci sono stati fissati sul vetrino da microscopio con metanolo e colorati con la colorazione di Giemsa, dopo di che sono stati esaminati con microscopio ad immersione con lenti oculari di Ehreich le quali sono state adattate in modo che il diaframma riuscisse ad esporre 200 globuli rossi per campo. Il conteggio degli eritrociti parassitati ha permesso la determinazione della parassitemia% del singolo animale, calcolata secondo la seguente formula:

Parassitemia% = ( numero eritrociti infettati / numero eritrociti totali ) x 100

Tale valore ha permesso poi di calcolare la parassitemia% media dei tre gruppi di topi trattati con diverse concentrazioni degli oli essenziali estratti dalle due piante.

In sede finale è stato possibile determinare la percentuale di soppressione della parassitemia secondo la seguente formula:

soppressione della parassitemia% = 100 x [ (parassitemia nel gruppo di controllo negativo - parassitemia nel gruppo trattato) / parassitemia nel gruppo di controllo negativo]

Nella seguente tabella sono riportati i risultati ottenuti a seguito di quattro giorni di trattamento delle cavie infettate da Plasmodium berghei, con dosi orali differenti degli oli essenziali di

Cymbopogon citratus e Ocimum gratissimum. Sono inoltre riportati i valori corrispondenti al

gruppo di cavie trattato con clorochina (gruppo di controllo positivo) ed al gruppo di cavie non trattato (gruppo di controllo negativo).

Gli oli hanno dimostrato una importante e significativa soppressione della parassitemia (55.0-77.8% per O. gratissimum e 62.1-86.6% per C. citratus) nel range di dose orale di 200-500 mg/kg al giorno.

La maggiore attività è stata osservata nel gruppo trattato con l’olio di Cymbopogon citratus che alla fine del periodo di dosaggio dei 4 giorni ha riportato una parassitemia media (media ± deviazione standard) che va da 8.7±1.9 a 24.5±10.8%. Il valore corrispondente per il gruppo di controllo infettato è pari a 64.6±9.2%.

Nei topi infettati trattati con l’olio di Ocimum gratissimum la parassitemia media varia da 13.0±4.5% a 26.4±11.0% e questi risultati sono stati di gran lunga inferiori a quelli ottenuti dal gruppo di controllo negativo (58.7±6.0%).

Tuttavia gli oli sono risultati meno potenti della clorochina la quale, usata come farmaco antimalarico standard alla dose di 10mg/kg, mostra una inibizione dello sviluppo del

Plasmodium berghei pari al 100% testato alle stesse condizioni.

In vivo, attività dell’olio essenziale di C. citratus e O. gratissimum contro il P. berghei

C. citratus O. gratissimum

Test group Dose mg/kg peso corporeo Parassitemia media % Soppressione parassitemia % Media sopravvis suti Parassitemia media % Soppressione parassitemia % Media sopravvis suti 1 500 8.7 ± 1.9 86.6 13.0 ± 1.5 13.0 ± 4.5 77.8 10.0 ± 1.1 2 300 11.8 ± 5.2 81.7 10.0 ± 0.8 14.6 ± 3.2 75.2 8.0 ± 0.8 3 200 24.5 ± 10.8 62.1 9.0 ± 1.6 26.4 ± 11.0 55.0 6.0 ± 0.8 Clorochina 10 0.0 100 - 0.0 100 - Controllo - 64.6 ± 9.2 - 6.0 ± 0.8 58.7 ± 6.0 - 6.0 ± 0.8

Particolare attenzione va posta anche alla durata di vita delle cavie, infatti in entrambi i test gli animali trattati con l’olio essenziale e con la clorochina hanno mostrato una durata della vita maggiore (9-13 giorni con C. citratus e 6-10 giorni con O. gratissimum) rispetto a quella del gruppo di controllo negativo. Invece come ci possiamo immaginare, in assenza di terapia tutti i topi sono morti in 6-7 giorni manifestando una graduale riduzione di peso. I risultati più promettenti sono stati ottenuti con l’olio essenziale di Cymbopogon citratus dove i topi trattati erano ancora vivi 13 giorni dopo l’infezione.

A fronte di tali risultati, possiamo attribuire agli oli essenziali di Cymbopogon citratus e Ocimum

gratissimum un effetto significativo sulla riduzione della crescita in vivo del Plasmodium berghei nei modelli di animali usati in questi studi. Per cui, possiamo dire che i dati ottenuti in

questi studi sono di supporto e vanno ad avvalorare l’utilizzo di Cymbopogon citratus e Ocimum

gratissimum nella cura tradizionale (per lo meno in Camerun) contro le febbri indotte dalla

malaria. Nell’uso tradizionale, la pianta viene bollita in acqua ed i suoi vapori, saturi di oli essenziali, vengono inalati dalle persone malate (Tchoumbougnang et al. 2005).

ATTIVITA’ LARVICIDA SU ANOPHELES GAMBIAE GILES

Ulteriori ostacoli, che si oppongono agli sforzi eseguiti dalle comunità colpite dalla malattia per controllane il contagio e la diffusione, sono rappresentati dalla resistenza della zanzara agli insetticidi, dai costi e dalle disponibilità degli insetticidi stessi. In conseguenza di ciò risulta importante il controllo delle nascite delle larve della zanzara coinvolta nella trasmissione della malaria. Come ci è noto, l’impiego intradomiciliare degli insetticidi di sintesi ha effetti negativi sull’uomo, sull’animale e sull’ambiente. Da qui nasce l’urgenza della ricerca di insetticidi naturali, attivi e biodegradabili.

Sono allora state testate le proprietà larvicide e repellenti, su ceppi di Anopheles gambiae Giles (principale vettore dell’Africa sub-sahariana), degli oli essenziali estratti da piante che si trovano vicino alle abitazioni dell’Africa sub-sahariana (Tchoumbougnang et al. 2009). In particolar modo ritroviamo già negli usi popolari la coltivazione di Cymbopogon citratus e Ocimum

gratissimum vicino alle abitazioni per le loro proprietà repellenti. L’olio essenziale di queste due

inzuppato nei due oli essenziali non è stato mangiato dalle formiche rosse, mentre lo zucchero non trattato è stato mangiato (Sofowora, 1982).

Al fine di testare tali attività, è stato ottenuto l’olio essenziale per idrodistillazione delle foglie secche di Cymbopogon citratus, Ocimum gratissimum, Ocimum canum e Thymus vulgaris coltivati in Camerun, e ne è stata determinata la composizione:

• Nell’essenza di Cymbopogon citratus la classe di composti presente in maggiore percentuale è quella dei monoterpeni (97.4%) con la prevalenza di composti ossigenati (81.0%) tra cui predominano: geraniolo (15.6%), geraniale (39.3%) e nerale (21.9%). Come abbiamo già riscontrato, nerale e geraniale sono caratteristici del Cymbopogon

citratus indipendentemente dalla provenienza geografica, mentre è interessante porre

attenzione alla presenza, in questo olio, di eugenolo (0.7%) che si ritrova molto raramente in questa essenza volatile.

• L’olio essenziale di Ocimum gratissimum è ricco in monoterpeni tra cui i più rappresentati sono: p-cimene (32.1%) e timolo (24.3%).

• Nell’olio essenziale di Ocimum canum i monoterpeni (86.8%) sono prevalentemente rappresentati da linalolo (56.3%) e limonene (10.9%).

• L’olio essenziale di Thymus vulgaris è anch’esso a principale composizione monoterpenica (93.9%) con una proporzione quasi uguale tra monoterpeni idrocarburi (45.0%) ed i monoterpeni ossigenati (48.9%). Il principale costituente della frazione ossigenata è il timolo (40.1%) e i principali monoterpeni idrocarburi sono il p-cimene (23.4%) e il γ-terpinene (15.1%).

I test biologici sono stati effettuati secondo la metodologia contenuta nel protocollo del World Health Organization del 1985.

Concentrazione letale in ppm (CL50 e CL80) degli oli essenziali di Cymbopogon citratus,

Ocimum canum, Ocimum gratissimum Thymus vulgaris contro l’Anopheles gambiae al

quarto stadio di larva.

Cymbopogon citratus Ocimum canum Ocimum gratissimum Thymus vulgaris CL50 18 ± 0.7 201 ± 0.9 180 ± 0.8 119 ± 1.5 CL80 25 ± 1.1 300 ± 1.5 270 ± 1.3 147 ± 2.4

CL50 = concentrazione letale che provoca il 50% di morti sulla popolazione delle larve

CL80 = concentrazione letale che provoca l’80% di morti sulla popolazione delle larve

Come mostrano i risultati riportati in tabella, questi oli essenziali presentano una notevole attività larvicida. Essi inducono il 100% di mortalità delle larve allo stadio 4 di Anopheles gambiae Giles alla concentrazione di 100 ppm per C. citratus, 200 ppm per T. vulgaris, 350 ppm per O.

gratissimum e 400 ppm per O. canum. Le CL50 e CL80 calcolate sui 4 oli essenziali inducono lo

stesso ordine di attività. L’olio essenziale di C. citratus è risultato il più efficace con i valori rispettivamente di CL50 =18 ppm e CL80 =25 ppm, mentre gli altri tre campioni hanno fornito

valori di 5-12 volte superiori a questo.

L’olio essenziale più attivo quindi risulta essere quello del Cymbopogon citratus che, come abbiamo visto, è caratterizzato da una elevata percentuale di citrale. A seguire troviamo le essenze di Thymus vulgaris e Ocimum gratissimum che abbiamo visto essere ricche in timolo, possiamo in questa sede osservare che la differenza di attività mostrata dai due oli essenziali sembra direttamente proporzionale alla concentrazione di timolo contenuto nei due oli stessi.

Sappiamo che l’utilizzo di insetticidi di sintesi è alla base di numerosi casi di resistenza degli insetti quindi, in questo contesto, il ricorso a molecole naturali di interesse ecologico ed economico, con proprietà insetticide o insettifughe e con minore tossicità per l’uomo, si dimostra essere una valida alternativa all’impiego di insetticidi di sintesi. (Tchoumbougnang et

Altre attività farmacologiche degli oli essenziali di Cymbopogon citratus e Ocimum gratissimum

Vari studi hanno testato gli effetti dell’olio essenziale di Cymbopogon citratus su batteri (Gram+ e Gram-) e su funghi.

L’attività antibatterica è stata saggiata su ceppi di Salmonella antibiotico-sensibili ed

antibiotico-resistenti, quali: Salmonella enteritidis e Salmonella typhimurium (Gram-). È stato accertato che l’olio essenziale a concentrazioni che vanno da 0,5 mg/ml a 0,8 mg/ml, inibisce entrambi i ceppi di Salmonella esaminati. Tale olio essenziale inoltre ha mostrato un effetto sinergico quando utilizzato in associazione con Streptomicina permettendo di ridurre la dose effettiva di antibiotico richiesto nel trattamento delle infezioni dovute a Salmonella typhimurium (Shin 2005). L’olio essenziale ha presentato inoltre elevata attività sullo Sthaphylococcus aureus (Gram+) alla concentrazione di 0,08 mg/ml, mentre si è rivelato inattivo su Escherichia coli (Gram-) e su Pseudonomas aeruginosa (Gram-) (Santos et al., 2009).

L’attività dell’olio essenziale di Cymbopogon citratus, testata su Aspergillus flavus, Aspergillus

fumigatus, Aspergillus niger, Alternaria alternata, Penicillum citrum, Curvularia lunata e Trichoderma harzianum ha fornito dati che attribuiscono a tale olio essenziale attività

antifungina. Infatti alla concentrazione di 250 ppm è stata riscontrata l’inibizione della produzione di spore fungine pari all’80%, eccetto che per la Curvularia lunata la cui produzione di spore è stata inibita solo al 30%. A concentrazioni maggiori dell’olio essenziale, pari a 1500 ppm, la sporulazione fungina è stata completamente ritardata. (Maanta et al., 2007). L’olio inoltre mostra avere una potente attività antifungina contro la Candida albicans (Rauber et al., 2001).

L’effetto dell’olio essenziale di Cymbopogon citratus è stato verificato, in vivo sui ratti, a livello del Sistema Nervoso Centrale valutandone l’attività sedativa, ansiolitica, anticonvulsivante e antinococettiva. L’olio, somministrato per via orale, si è rivelato efficace nell’incrementare la durata del sonno. È stato visto che l’essenza ritarda le manifestazioni cloniche indotte dal pentilenetetrazolo e blocca le estensioni toniche date dall’elettroshock. Questi risultati sono in accordo con l’uso etnofarmacologico del Cymbopogon citratus (Blanco et al., 2009). In aggiunta a ciò è stato osservato che la somministrazione per via orale (25 mg/kg) o per via intraperitoneale (25-100 mg/kg) dell’olio essenziale, aumenta il tempo di reazione agli stimoli

termici. L’impiego di un antagonista oppioide come il Naloxone va a bloccare l’effetto antinocicettivo centrale indotto dall’olio essenziale suggerendo così che tale olio va a esplicare la sua azione sia a livello periferico che centrale (Viana et al., 2000).

L’olio essenziale di Ocimum gratissimum oltre ad essere stato testato sul plasmodio è stato saggiato su un ulteriore parassita protozoarico, appartenente al genere Leishmania, trasmesso anch’esso da un insetto vettore. Tale olio essenziale inibisce la crescita del protozoo appartenente al genere Leishmania a concentrazioni che vanno da 100 a 1000 µg/ml, non inducendo effetti citotossici sulle cellule di mammiferi. Questi risultati suggeriscono l’impiego dell’olio essenziale dell’Ocimum gratissimum come fonte per nuovi farmaci antileishmaniosi (Ueda-Nakamura et al., 2006).

Oltre all’attività antiprotozoarica, attraverso altri studi, è stato valutato l’effetto antimicrobico dell’olio essenziale di Ocimum gratissimum, il quale ha mostrato una pronunciata attività antibatterica e antifungina su tutti i microorganismi saggiati, batteri Gram+ ( : Staphylococcus

aureus), batteri Gram- (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Shigella ssp. ) e funghi (Candida albicans) (Matasyoh et al.,

2007). In aggiunta, tramite test di suscettibilità agli antibiotici, è stato riscontrato che l’utilizzo dell’olio essenziale di Ocimum gratissimum riduce la concentrazione inibitoria minima di antibiotico (MIC) necesaria ad inibire la crescita delll’enterobatterio. Dati tali risultati, la combinazione antibiotico-olio essenziale potrebbe essere utilizzata come misura terapeutica contro la shigellosi (Iwalokun et al., 2003).

Date le proprietà repellenti dell’olio essenziale di Ocimum gratissimum esso viene coltivato vicino alle abitazioni. Oltre a testare la sua attività repellente e larvicida sulla zanzara Anopheles, ne è stato testato l’effetto sul coleottero Sitophilus zeamais (Motschulsky) principale parassita del grano in stoccaggio. L’olio è risultato moderatamente repellente verso tale coleottero ma altamente letale. Inoltre il grano trattato con l’olio essenziale di Ocimum gratissimum ha mostrato una significante riduzione nel numero di progenie. Il grano trattato con tale olio essenziale è risultato adatto all’alimentazione (Asawalam et al., 2008).

Anche l’olio essenziale di Ocimum gratissimum è stato valutato per gli effetti a livello del Sistema Nervoso Centrale in vivo. In primo luogo gli studiosi hanno determinato la durata del

sonno indotta dalla somministrazione di pentobarbitale sodico e l’attività convulsivante indotta dalla somministrazione di pentilentetrazolo e dall’elettroshock. L’olio essenziale si è dimostrato efficace nell’aumentare la durata del sonno ed è stato in grado di proteggere gli animali contro gli attacchi tonici indotti dall’elettroshock (Freire et al., 2006).

Artemisia annua L. (Asteraceae)

Nomi comuni

Inglese: annual wormwood, sweet annie, sweet wormwood.

Cinese: qinghao, qin hao su, huag hua hao.

Descrizione botanica

Pianta erbacea annua, vigorosa e aromatica, che nei climi temperati può raggiungere i 2 m di altezza. Essa può assumere un portamento monocaule con rami alternati, o cespuglioso con ramificazioni alla base. Le foglie sono profondamente settate, da 2,5 a 5 cm di lunghezza, contenenti trinomi filamentosi. L’infiorescenza a capolino ha un diametro di circa 2-3 mm, è generalmente di colore giallastro e racchiusa da numerose brattee. L’infiorescenza presenta al centro numerosi fiori bisessuali (ermafroditi), circondati da fiori femminili (pistillati). Entrambi i tipi fiorali hanno una corolla tubolare simpetala con margine pentalobato nei fiori bisessuali e bi-trilobato in quelli femminili. Il ricettacolo è glabro ed ha forma triangolare. Anche tutti gli organi fiorali contengono numerose cellule filamentose. Il frutto è un achenio piccolissimo ed i semi sono di dimensioni ridottissime (circa 12000 per grammo) (Ferriera Janick, 2009); (Diemer et al., 2005).

Habitat e distribuzione

Artemisia annua predilige i terreni a medio impasto ma si adatta anche in terreni argillosi. La

pianta è poco esigente nei riguardi dei fattori nutritivi ed è moderatamente resistente alle basse temperature.

Le piante non più giovani sono molto sensibili agli stimoli fotoperiodici che inducono la fioritura in circa due settimane. Il fotoperiodo critico sembra essere di 13.5 ore giornaliere anche se è probabile che il suo calcolo debba essere fatto tenendo conto della temperatura.

Pianta originaria dell’Asia il cui centro di origine sembra essere la Cina; la pianta è largamente diffusa in Asia e nell’Europa dell’est. È stata introdotta per la coltivazione in Brasile, Camerun, Etiopia, India, Kenya, Mozambico, Tanzania, Uganda, Zambia etc. in regioni con elevate altitudini o con periodi di freddo pronunciato.

In Italia si può trovare nelle aie, nei lotti agricoli, ai confini dei boschi, nelle distese fangose, lungo i ruscelli e presso i laghetti. È diffusa nelle regioni temperate.

Usi medicinali

Si tratta di un’erba medicinale con uso tradizionale; nella Farmacopea della Repubblica Cinese ne è stato registrato l’impiego contro la malaria, contro le febbri dovute alla tubercolosi, contro l’ittero, e nelle febbri serali correlate alla “deficienza di yin”(secchezza delle fauci, insonnia con irrequietezza, sudorazione notturna, costipazione, concentrazione delle urine, etc.).

Gli infusi della pianta vengono dispensati per le loro proprietà antisettiche, digestive, febbrifughe e antidiarroiche.

Le foglie vengono impiegate nel trattamento dei brufoli, degli ascessi, delle emorroidi e dei dolori articolari (Diemer et al., 2005).

Composizione chimica dell’olio essenziale

La composizione degli oli volatili di Atrtemisia annua varia notevolmente da una regione fitogeografica all’altra e varia anche in base al periodo di raccolta.

Composizione percentuale dei principali costituenti dell’olio essenziale di A. annua coltivata in differenti regioni fitogeografiche

Origine Artemisia

chetone

Cineolo Canfora

Germacrene-D Cina 63.1 1.5 tr n.r. Usa (semi di origine cinese) Raccolta prima dell’estate 35.6 28.8 n.r. n.r. Raccolta in piena estate 26.8-56.0 7.7-8.7 10.5-20.5 n.r. Coltivata in Oregon 37.5 31.5 n.r. 0.7

Paesi Bassi Semi di origine cinese 63.9 tr 3.3 n.r. Semi di origine vietnamita n.r. 3.1 21.8 18.3 Bulgaria 80.9 9.3 11.0 n.r. Giappone 13.0 13.0 13.0 n.r. India Coltivata a Lucknow plains 58.8 10.2 15.8 2.4 Coltivata nella valle dell’Himalaya 52.3 13.1 15.5 1.9 n.r.= non riportato tr = tracce

O

O

O

Artemisia ketone 1,8-Cineolo Canfora

Germacrene D

Come possiamo osservare dai dati riportati nella tabella, il maggiore costituente dell’olio essenziale di Artemisia annua è generalmente l’artemisia chetone con una percentuale che varia da 26.8 a 80.9% sul totale dei composti presenti nell’essenza. Questo intervallo come possiamo riscontrare dai risultati non è una costante, infatti l’olio ottenuto dalle piante giapponesi presenta una percentuale di Artemisia chetone che sta al di sotto di tale intervallo (13%) ed al pari del cineolo e della camfora , mentre nell’essenza di Artemisia annua coltivata nei Paesi Bassi da semi di origine vietnamita non si riscontra la presenza di artemisia chetone. (Ateeque e Laxmi, 1994). L’assenza dell’artemisia chetone nell’olio essenziale della pianta vietnamita è avvalorata da altre ricerche effetuate sulla composizione di tale olio (Bhakuni et al., 2001).

Diviene interessante osservare come varia la composizione chimica degli oli essenziali estratti da parti differenti della pianta, infatti gli oli ottenuti da petali e foglie sono ricchi in monoterpeni, mentre quelli ottenuti dagli steli contengono prevalentemente sesquiterpeni.

Attraverso indagini condotte sull’olio essenziale di Artemisia annua coltivata in India, è stato riscontrato che l’olio estratto dai petali è ricco di trans-sabinolo (10.2%), paramental-1,4 (8)-dien-3-ol (10.1%) e 1,8-cineolo (6.8%). Quello estratto dalle foglie abbonda in camfora (23.2%), ed è ricco anche di 1,8-cineolo (6.4%) e germacrene D (3.4%). Questi due oli mostrano 73 composti in comune e la principale differenza è data dall’assenza della canfora nell’olio essenziale ottenuto dai petali.

L’olio essenziale derivante dagli steli contiene in quantità maggiori cariofillene ossido (10.0%) e β-cariofillene (6.1%).

I tre oli mostrano 55 composti in comune, tra cui anche alcool arteannuico, e soltanto l’olio ottenuto da petali e da foglie contiene acido diidroartemisinico (Goel et al., 2007).

ATTIVITA’ ANTIMALARICA: SINERGIA TRA I COMPONENTI DELL’OLIO ESSENZIALE E L’ARTEMISININA

Dall’Artemisia annua sono stati isolati numerosi metaboliti secondari appartenenti al gruppo del perossido di terpene tra cui artemisia chetone, arteannuin B e mircene idroperossido. Alcuni di questi possono essere trovati nella composizione dell’olio essenziale, anche se il più famoso terpene perossido ad attività antimalarica che si ritrova nella pianta è l’artemisinina (sesquiterpene endoperossido) che però non è presente nell’olio essenziale.

Forti evidenze dimostrano che l’artemisinina è secreta nei tricomi ghiandolari, l’associazione di artemisinina con queste ghiandole è dimostrata dal fatto che non viene trovata nelle parti di pianta che non hanno ghiandole, quali polline o radici, e nei biotipi senza ghiandole in quanto nei biotipi di A. annua che non presentano tricomi ghiandolari non c’è produzione della sostanza. Nei tricomi ritroviamo anche una abbondante presenza dell’olio essenziale.

Tramite l’impiego di una gas cromatografia multidimensionale, la quale migliora notevolmente la separazione e l’identificazione dei componenti, è stata analizzata la composizione dell’olio essenziale derivante dalle foglie e dai fiori di Artemisia annua coltivata in Cina.

componenti principali dell’olio essenziale di A. annua coltivata in Cina Componenti Contenuto % Borneolo 15.903 (Z)-β-Farnesene 12.920 Germacene D 10.900 β-cis-Cariofillene 5.984 Sabinene 3.213 β-Eudesmene 1.254 β-Cimene 1.224 Copaene 1.209

Acico acetico, bornil estere 1.139

cis-Z-α-Bisabolene epossido 1.010 γ-Elemene 0.991 (-)-Spatulenolo 0.979 Morillolo 0.912 Camfene 0.840 Linalool 0.823 (-)-β-Elemene 0.730 Limonene 0.720 Isoaromadendrene epossido 0.656 2-Esanale 0.550 Acido 3-metil-but-2-enoico 0.538 4-Terpinenolo 0.471 2-Cicloesan-1-ol 2-metil-5-(1-metiletenil)-acetato 0.437 2-Metil-6-metilene-oct-3,7-dien-2-ol 0.301 Bornil estere dell’acido n-pentanoico 0.293

Pitolo 0.287

Elixene 0.263 Carvacrolo 0.257 γ-Gurjunene 0.254 δ-Cadinene 0.253 α-Bisabololo 0.250 Acido ciclopentancarbossilico 0.231 (E)-1-Octenil acetato 0.209 Artemisia chetone 0.069 Acido arteannuico 0.044 H H COOH Acido arteannuico

Dai risultati possiamo osservare che i 10 composti presenti in percentuali maggiori all’1% sono composti terpenici, eccetto il β-cimene che è fenilico, possiamo quindi affermare che l’olio essenziale di Artemisia annua si compone prevalentemente da composti terpenici.

Notevole rilievo assume la presenza, seppur in tracce, nell’olio essenziale dell’acido arteannuico in quanto alcuni autori lo hanno identificato come un potenziale precursore dell’artemisinina. Nonostante il valore commerciale dell’artemisinina, la sua via biosintetica non è completamente chiara: il primo step nella biosintesi dell’artemisinina è la ciclizzazione del farnesil di fosfato (FDP) ad amorfa-4, 11-diene che risulta essere il primo precursore specifico dell’artemisinina. Tuttavia, si hanno poche informazioni al riguardo degli enzimi coinvolti nella conversione

dell’amorfa-4, 11-diene ad acido arteannuico, ma i risultati ottenuti forniscono il potenziale per ulteriori investigazioni sulla via metabolica dell’artemisinina (Chenfei et al., 2007).

A questo punto diviene importante fare presente che la sintesi della molecola di artemisinina è estremamente difficile e costosa, per cui lo studio dei suoi precursori potrebbe fornire valide alternative.

In aggiunta a ciò dobbiamo ricordare che nella lotta contro la malaria l’obiettivo è fornire, alle popolazioni del terzo mondo, formulazioni galeniche “semplici” che permettano di far gestire al malato la sua salute come la preparazione di un tè.

Nella medicina tradizionale cinese il tè a base di Artemisia annua veniva impiegato nel trattamento delle febbri e dei brividi che noi oggi associamo alla malaria. Abbiamo visto che il principale responsabile dell’attività antimalarica contenuto nella pianta è l’artemisinina, che non si ritrova nell’olio essenziale.

Sebbene l’artemisinina pura abbia bassa solubilità in acqua, alcuni studi (Ridder et al., 2008) hanno dimostrato che la concentrazione di artemisinina presente nel tè, preparato aggiungendo 5 g di foglie essiccate ad 1 l di acqua bollente, è di gran lunga superiore a quella attesa, ciò potrebbe essere dovuto alla presenza di altri componenti della pianta (flavonoidi o saponine) che presentando proprietà amfifiliche vanno probabilmente a migliorare la solubilità dell’artemisinina in acqua. Questo ci dimostra che l’artemisinina può essere estratta dalla pianta per addizione di acqua bollente.

Il tè tradizionale risulta efficace contro la malaria da P. falciparum, nonostante ciò si manifestano elevati casi di recrudescenza dovuti al fatto che l’artemisinina non è in grado di uccidere tutti i cicli vitali del parassita. Al contempo possiamo sostenere che le preparazioni a base di Artemisia annua vengono impiegate da 2000 anni in Cina nel trattamento delle febbri e continuano ad essere utilizzate apparentemente senza l’emergere della resistenza. Questo potrebbe essere dovuto al fatto che la combinazione degli ingredienti presenti nel tè ha un effetto sinergico che impedisce al parassita di mutare.

Dobbiamo inoltre tenere presente che l’olio essenziale potrebbe avere un’azione protettiva sulla molecola di artemisinina. Tale ipotesi (De Mmagalhales et al., 2004) si basa sul fatto che il tè ottenuto dalle foglie di Artemisia annua ha presentato un effetto terapeutico nel trattamento della malaria permettendo di utilizzare dosi di artemisinina molto più basse rispetto a quelle richieste nell’impiego di atremisinina pura. La spiegazione di ciò potrebbe essere dovuta al fatto che l’olio va a proteggere la molecola dell’artemisinina dalla degradazione che essa subisce nell’organismo

umano lasciando la molecola attiva per più tempo, oppure possiamo ipotizzare la presenza di un’azione sinergica che va ad aumentare la penetrazione dell’artemisinina nella membrana del P.

falciparum.

Sulla base di tali ipotesi andiamo allora a verificare quale corrispondenza possa essere riscontrata tra i componenti degli oli essenziali e quelli delle acque aromatiche di Artemisia

annua.

A questo scopo sono state analizzate tramite GC/MS le composizioni dell’olio essenziale e dell’estratto in esano dell’acqua aromatica di Artemisia annua coltivata e raccolta in Italia (Sesto Fiorentino).

Principali componenti individuati nell’acqua aromatica e nell’olio essenziale di Artemisia annua

Componenti Estratto dell’acqua aromatica Olio essenziale

α-Pinene 0.4 0.7 Camfene 0.2 1.5 Sabinene 0.2 0.2 β-Pinene 0.1 0.5 Mircene 0.5 0.1 Yomogi alcol 1.2 nd α-Terpinene nd 0.1 ρ-Cimene 0.1 1.7 Santonina alcol 0.2 nd 1,8-Cineolo 14 1,4 γ-Terpinene nd 0.3 Artemisia chetone 10.1 nd cis-Sabinene idrato 0.2 0.2 Artemisia alcol 2.0 nd Linalool 3.9 0.2 trans-Sabinene idrato 0.6 0.2 Deidrosabinachetone 0.9 nd trans-Pinocarveolo 5.4 nd Canfora 27.7 17.6

β-Pinene idrossido 2.5 nd Sabinachetone 0.4 nd Pinocarvone 3.8 0.3 γ-Terpineolo 1.0 nd Borneolo 1.8 0.9 Terpinen-4-ol 3.4 0.6 ρ-Cimen-8-ol 0.4 nd α-Terpineolo 6.1 0.5 Mirtenolo 0.2 nd (E,E)-2-4-nonadienale 0.6 nd trans-Carveolo 0.5 0.3 Lavandulil acetato nd 0.9 Timolo nd 1.5 trans-Carvile acetato nd 1.0 Eugenolo 1.1 tr α-Copaene 0.2 0.9 β-Cubenene nd 0.7 (E)-β-Cariofillene 0.6 0.9 (E)-β-Farnesene 0.3 10.2 β-Camigrene 0.1 1.4 Germacrene D 0.4 21.2 β-Selinene 0.3 0.8 Biciclogermacrene nd 4.2 Spatulenolo 0.7 1.3 Cariofillene ossido 0.4 0.6 Cubenolo nd 2.3 T-Muurololo nd 0.7 Kongol 0.1 0.6 (Z)-α-Santalolo nd 1.3 nd = non dichiarato tr = tracce

Tra i principali costituenti dell’olio essenziale spiccano il germacrene D (21.2%), la canfora (17.6%), il β-farnesene (10.2%), il β-cariofillene (9%) e il biciclogermacrene (4.2%). L’acqua aromatica, in seguito ad estrazione con n-esano, mostra tra i principali componenti la canfora (27.7%), l’1,8-cineolo (14%), l’artemisia chetone (10.1%), l’α-terpineolo (6.1%), il trans-pinocarveolo (5.4%) e l’artemisia alcol (2%). Nessuno dei due estratti mostra però la presenza di artemisinina (Bilia et al., 2008). I risultati ci permettono di riscontrare la presenza di molti composti volatili nelle acque aromatiche.

Altre attività farmacologiche dell’olio essenziale di Artemisia annua

In altri studi è stata testata l’attività antimicrobica, su batteri Gram+ e Gram-, dell’olio essenziale di Artemisia annua.

L’effetto dell’olio essenziale è stato misurato su batteri Gram- appartenenti a ceppi antibiotico-sensibili e antibiotico-resistenti di Salmonella enteridis e di Salmonella typhimurium. L’olio essenziale inibisce significativamente i ceppi delle due specie di Salmonella esaminate alla concentrazione inibitoria minima (MIC) che va da 2.0 mg/ml a 8.0 mg/ml. Inoltre la combinazione di dell’olio con kanamicina sembra essere utile nel ridurre la dose effettiva minima di antibiotico richiesto per il trattamento delle infezioni da ceppi resistenti di Salmonella

typhimurium (Shin, 2007). L’olio essenziale di Artemisia annua ha mostrato inoltre un elevato

tasso di inibizione sulla crescita dell’ Enterococcus hirae batterio Gram+ (Juteau et al., 2002).

Altri studiosi hanno valutato l’attività dell’essenza volatile e dell’estratto grezzo etanolico di

Artemisia annua sul Sistema Nervoso Centrale utilizzando delle cavie. Una volta indotta

immobilità, tramite somministrazione di opportuno farmaco, gli animali sono stati sottoposti al “test del nuoto forzato” e al “test del campo aperto” per valutare la depressione indotta dal farmaco. La somministrazione dell’olio essenziale e/o dell’estratto etanolico grezzo di Artemisia

annua ha aumentato l’immobilità nel “test del nuoto forzato” ed ha ridotto le attività di

deambulazione ed esplorazione nel “test del campo aperto”. Entrambe le preparazioni hanno aumentano il sonno indotto tramite pentobarbitale, ma l’olio essenziale dimostra avere un effetto più marcato. Questi risultati ci portano a dedurre che sia l’estratto grezzo di etanolo che l’olio essenziale possono agire come depressori del sistema nervoso centrale (Perazzo et al., 2008).