3. Materiali e metodi
3.1 Composti chimici
3.1.1 Salbutamolo
Il salbutamolo (Sigma Aldrich, Figura 14) è un farmaco β2-agonista ad azione rilasciante sulla
muscolatura liscia bronchiale impiegato nel trattamento dell’asma. Il farmaco, dopo essere stato pesato, è stato disciolto in una soluzione di tampone fosfato salino (PBS; Sigma Aldrich), tale da ottenere una soluzione madre 10 mM; successivamente diluita per ottenere le concentrazioni da saggiare. La soluzione madre è stata conservata a 4°C per un tempo non superiore a sette giorni.
3.1.2 Montelukast
Il montelukast (Merk, Figura 15) è un farmaco antagonista del recettore per il leucotriene D4 (LTD4).
Il farmaco è stato disciolto in dimetilsolfossido (DMSO) per ottenere una soluzione madre 50 mM, la quale è stata successivamente diluita per ottenere la concentrazione impiegata nei saggi in vitro (30 µM). La soluzione madre è stata conservata a –20°C .
3.1.3 IBMX
L'IBMX (Cayman Chemical, Figura 16) è un inibitore non specifico delle fosfodiesterasi cAMP e cGMP.
L'IBMX è stato disciolto in dimetilsolfossido (DMSO) per ottenere una soluzione madre 50 mM, la quale è stata successivamente diluita per ottenere la concentrazione utilizzata nei saggi in vitro (20 μM). La soluzione madre è stata conservata a -20°C per sei mesi.
3.1.4 NS-398
L’NS-398 (Cayman Chemical company, Figura 17) è un inibitore selettivo della ciclossigenasi-2 (COX-2).
Il composto è stato disciolto in dimetilsolfossido (DMSO) per ottenere una soluzione madre 50 mM. Successivamente l'NS-398 è stato diluito per ottenere la concentrazione utilizzata nei saggi in vitro di 2 μM.
3.1.5 Desametasone
Il desametasone (Cayman Chemical, Figura 18) è un antinfiammatorio di tipo steroideo.
Il composto è stato disciolto in DMSO per ottenere una soluzione madre alla concentrazione di 50 mM, la quale è stata successivamente diluita arrivando ad una concentrazione di 10 μM impiegata nei saggi. La soluzione madre è stata conservata per 6 mesi a -20°C.
3.2. Linea cellulare
La linea cellulare BSMC (Clonetics® Normal Human Bronchial Smooth Muscle Cells) (Figura 19)
è costituita da cellule di muscolatura liscia bronchiale umana. Le cellule crescono in adesione, si presentano morfologicamente con una aspetto affusolato ed hanno un tempo di duplicazione di circa 24 ore.
Figura 19. BSMC in coltura
Le cellule sono state coltivate nel mezzo SmGM®-2 (Lonza) contenente glucosio (5,5 mM), FBS
(5%), gentamicina (50 µg/ml), anfotericina-B (50 ng/ml), insulina (5 µg/ml), fattore di crescita fibroblastico basico umano (hFGF-B) (2 ng/ml) e fattore di crescita epidermico umano (0,5 ng/ml).
La crescita ed il mantenimento in coltura delle cellule sono stati realizzati in fiasche T75 e T25 ad una temperatura costante di 37°C, in un’atmosfera controllata al 5% di CO2. Le cellule sono state
mantenute in crescita esponenziale fino al 70-80% di confluenza e successivamente sub-coltivate in rapporto 1:3.
Lo splittaggio delle cellule in adesione, è stato realizzato mediante l’aspirazione del mezzo di cultura con una pasteur sterile e lo strato cellulare lavato con 5-6 ml di PBS. Successivamente, il PBS è stato scartato e alle cellule sono stati aggiunti 1,5 ml di soluzione contenente tripsina/EDTA e 1,5 ml di PBS. La fiasca è stata posta in incubatore per un tempo sufficiente a staccare le cellule dal fondo della fiasca. Per neutralizzare l’effetto della tripsina è stata aggiunta una quantità di
mezzo pari a circa il doppio del volume di tripsina/PBS presente nella fiasca. A questo punto la sospensione cellulare è stata trasferita in una provetta da 15 ml. Le cellule sono state successivamente centrifugate a 6.600 g per 3 minuti, il sovranatante scartato ed il pellet cellulare risospeso in un volume di mezzo appropriato. Per gli esperimenti, le cellule sono state utilizzate tra i passaggi 3 e 7.
3.3 Valutazione dell’espressone di IL-8 nelle cellule BSMC
3.3.1 Estrazione dell’RNA da cellule bronchiali
Per poter estrarre l’RNA dalle cellule queste devono venir rimosse dalle fiasche in cui sono coltivate. Si inizia aspirando il mezzo di coltura. La fiasca viene lavata con PBS (tampone fosfato), il quale è stato poi aspirato e sostituito con tripsina diluita, nello stesso tampone. La fiasca con le cellule e la tripsina viene tenuta in incubatore a 37°C per circa 1 minuto e successivamente vengono aggiunti circa 5 ml del mezzo di coltura per inattivare l’enzima. Le cellule vengono poi centrifugate, il surnatante aspirato ed il pellet mantenuto in ghiaccio. Il numero minimo di cellule impiegate per l’estrazione era di circa 106. L’estrazione dell’RNA
cellulare è stata effettuata mediante una serie di lavaggi con dei tamponi che servono a lisare le cellule e ad eliminare tutte le impurezze del materiale proteico e genomico contenuto nel citoplasma “RNeasy mini kit” (Qiagen, Italia). Una volta estratto, l’RNA è stato conservato in una eppendorf a –80°C. Per quantificare l’RNA estratto è stata effettuata una lettura spettrofotometrica (GeneQuant pro, Biochrom, UK) alle lunghezze d’onda di 230 nm (indica la possibile presenza nel campione di carboidrati, peptidi e altri composti aromatici), 260 nm (indica la presenza acidi nucleici), 280 nm (inidica la presenza di proteine) e 320 nm (indica la contaminazione con
solventi organici). La qualità dell’RNA è indicata dal rapporto di densità ottica alla lunghezza d’onda di 260/280 nm >1,9. L’integrità dell’RNA è stata verificata mediante elettroforesi su gel di agarosio all’1%, agarosio.
3.3.2 Retrotrascrizione dell’RNA
La retrotrascirizione è il processo che porta alla conversione dell’RNA in cDNA. Per effettuare la retrotrascrizione è stato utilizzato il kit “QuantiTect Reversion Transcript kit” (Qiagen, Italia). Tutte le operazioni sono state eseguite in ghiaccio per minimizzare la possibile degradazione dell’mRNA. In una eppendorf viene messo 1 µg del campione di RNA, il gDNA Wipeout buffer e acqua RNAasi free; si miscela bene la soluzione e si incuba a 42°C nel termociclizzatore per 2 minuti. Questo passaggio serve ad eliminare dalla soluzione il DNA genomico che è stato estratto dalle cellule insieme all’RNA. Terminata l’incubazione nel termociclizzatore, si pone la miscela in ghiaccio aggiungendo la soluzione per la retrotrascrizione (1µl di enzima retrotrascrittasi, 4 µl di RT buffer, 1µl di RT primer mix, cioè gli oligo dT di innesco). La soluzione risultante è stata incubata nel termociclizzatore a 42°C per 30 minuti; il cDNA ottenuto dopo incubazione per 3 minuti a 95°C (per inattivare la retrotrascrittasi) è stato conservato a –20°C.
3.3.3 Reazione a catena della polimerasi (PCR)
L’amplificazione del cDNA è stato realizzato mediante il kit “Masterscript RT-PCR System” (Qiagen, Italia). La PCR è stata eseguita usando primers specifici per l’interleuchina 8 (IL-8) e per la GAPDH, conservati a –20°C. La sequenza “senso” e la sequenza “antisenso” impiegate per IL-8 e GAPDH (Invitrogen Life Technologies) sono: IL-IL-8, ATG/ACT/TCC/AAG/CTG/GCC/GT (senso), CCT/CCT/TCA/AAA/ACT/TCT/CCA/CACC (antisenso), GAPDH, CGA/TGC/TGG/CGC/TGA/GTA (senso), CGT/TCA/GCT/CAG/GGA/TGA/CC (antisenso).
I campioni sottoposti alla PCR avevano la seguente composizione: HotStar Taq master mix (6,25 µl), primer 10 µM (0,5 µl), primer (F) 10 µM (0,5 µl), cDNA (2 µl) e acqua RNAasi free (3,25 µl). Il volume finale della soluzione era di 12,5 µl. Il campione è stato incubato nel termociclizzatore, selezionando il programma opportuno in base ai primers che utilizzati.
Il programma del termociclizzatore era il seguente:
1. 95°C per 15 minuti (attivazione dell’enzima che deve amplificare il cDNA) 2. 95° per 1 minuto (denaturazione del cDNA)
3. Tm per 2 minuti (appaiamento dei primers con le sequenze specifiche del cDNA) 4. 72°C per 1 minuto (prolungamento della catena)
5. 72°C per 10 minuti (prolungamento della catena)
Le fasi 2, 3 e 4 sono state ripetute per 30-40 volte per ottenere una quantità sufficiente della sequenza di DNA di interesse. Il risultato delle amplificazioni (per ciascun campione 12,5 μL del prodotto di amplificazione con 5 μL di Loading Buffer di tipo III) è valutato mediante corsa elettroforetica per 1h e 20 minuti su gel d’agarosio al 2% (0,8 g di agarosio, 40 mL di TBE 0,5X). È caricato anche il Ladder 100 pbper la marcatura del numero di paia basi.
3.3.4 Calcolo della temperatura di melting
La temperatura di melting è la temperatura alla quale i primers hanno maggiore affinità per la sequenza di interesse. La temperatura è specifica per ogni primers e si calcola conoscendo la sua sequenza nucleotidica.
Tm = [2*(A+T)]+[2*(G+C)] A= adenine contenute nel primer T= timine contenute nel primer G= guanine contenute nel primer
C= citosine contenute nel primer
3.3.5 Calcolo della temperatura di annealing
La temperatura di annealing si trova sperimentalmente e corrisponde circa a 3-5°C in meno rispetto alla temperatura di melting più bassa tra i 2 primers o alla temperatura di melting media, se quelle dei vari primers sono vicine.
3.4 Le Microparticelle
3.4.1 Isolamento dei monociti e formazione delle microparticelle
I monociti sono stati isolati dal sangue periferico di donatori. Ogni campione è stato diluito 1:1 con PBS/EDTA 2 mM, miscelato con ¼ del volume di una soluzione di Dextran T500 al 4% e lasciato sedimentare per 30 minuti a temperatura ambiente, per eliminare tutti gli eritrociti presenti. Il surnatante è stato poi centrifugato per 10 minuti a 200g. Il pellet ottenuto è stato risospeso in 30 ml di PBS/EDTA, portato a volume con 15 ml di soluzione Ficoll-Hypaque, e centrifugato per 30 minuti a 350 g a temperatura ambiente. Le cellule mononucleate sono state risospese in RPMI 1640 e FBS al 10% e seminate in piastre da 24 pozzetti per 18 ore a 37°C in modo da ottenere circa 106 cellule per pozzetto. La produzione di microparticelle è stata indotta
trattando i monociti con lo ionoforo del calcio, A23187, alla concentrazione di 12 µM in RPMI 1640 per 15 minuti a 37°C. Le cellule sono state poi centrifugate a 14.000 g per 5 minuti a temperatura ambiente per rimuovere le cellule morte, i monociti e i frammenti cellulari di grosse dimensioni che si possono essere formati durante la stimolazione.
3.4.2 Attivazione cellulare dovuta alla stimolazione con microparticelle
Le cellule muscolari lisce umane bronchiali, a confluenza, sono state incubate a 37°C overnight con il surnatante dei monociti stimolati, contente le microparticelle, in piastre da 96 pozzetti in un volume di 200 l per pozzetto. Dopo l’incubazione le cellule sono state centrifugate a 13.400 g per 5 minuti e il surnatante ottenuto è stato analizzato mediante un saggio ELISA per misurare il rilascio di IL-8 nel mezzo di coltura.
3.4.3 Misurazione dei livelli intercellulari di AMP ciclico (cAMP)
La produzione di cAMP, dopo esposizione delle cellule muscolari lisce bronchiali, alle microparticelle è stata misurata mediante il saggio ELISA “Cyclic AMP EIA kit” (Cayman Chemical company, USA) (Figura 20).
Figura 20. Funzionamento del saggio ELISA
per pozzetto e successivamente incubate overnight con RPMI 1640 (Sigma Aldrich). Successivamente le cellule sono state esposte per 24 ore alle MP in presenza o meno dei seguenti composti: montelukast 30 μM, desametasone 10 µM, salbutamolo 1 µM, indometacina 1 µM, NS-398 2µM e IBMX 20µM. I composti sono stati saggiati anche in assenza di MP per valutare il loro contributo sulla modulazione di cAMP intracellulare. Nella prima serie di esperimenti lo schema di trattamento prevedeva 24 ore nel terreno di coltura completo, poi esposizione al montelukast 30 µM, micro particelle e micro particelle in presenza di montelukast 30 µM. Nella successiva serie, le cellule sono state trattate per 24 ore con RPMI 1640 + FBS 10% + P/S 1% + microparticelle, NS-398 2 μM, desametasone 10 μM, IBMX 20 μM e loro rispettive combinazioni con le microparticelle, e con salbutamolo 1 μM + salbutamolo combinato con IBMX. Nei controlli è stato aggiunto solo il veicolo. Al termine dell’esperimento il terreno di coltura è stato rimosso e le cellule sono state incubate con papaverina (una molecola che inibisce l’enzima PDE4D5) alla concentrazione 100 µM per 20 minuti e successiva aggiunta di salbutamolo 10 µM, per 15 minuti per modulare la sintesi di cAMP. La soluzione di salbutamolo e papaverina è stata successivamente rimossa e le cellule sono state lisate con 300 µl di HCl 0,1 M per 10 minuti a 37°C. Dopo la lisi il contenuto è stato aspirato, posto in una apposita eppendorf e centrifugato a 700g per 10 minuti. I campioni e gli standards sono stati aggiunti nei pozzetti della piastra da 96 contenenti l’anticorpo specifico per la molecola di interesse, in questo caso cAMP, e sono stati lasciati incubare a 4°C
overnight. Successivamente sono stati effettuati 5 lavaggi con 200 µl di Wash Buffer, ad ogni
pozzetto è stato aggiunto il substrato ed lasciando incubare per 90-120 minuti sull’agitatore di piastra oscillante a temperatura ambiente. A reazione è avvenuta, è stato aggiunto ad ogni pozzetto lo Stop Buffer e la lettura è stata effettuata a 405 nm.
La densità ottica (OD) è stata calcolata come differenza tra il valore di assorbanza di ogni pozzetto e il valore di assorbanza del pozzetto in cui si ha il legame non specifico con l’anticorpo: OD = AssX- Ass NSB
campione e l’assorbanza del pozzetto in cui si ha il massimo legame cAMP dato dal kit, moltiplicato per 100.
% legame = (Ass campione/ Ass Bo) *100
3.4.4 Misurazioni dei livelli di IL-8
Un altro saggio ELISA specifico è stato utilizzato per la misurazione della produzione di IL-8 da parte delle cellule muscolari lisce bronchiali stimolate overnight con le MP.
I particolare, le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti alla densità di 5.000 cellule per pozzetto. Lo schema di trattamento è stato lo stesso impiegato per la valutazione dei livello di cAMP (paragrafo precedente).
La superficie di poliestere di ogni pozzetto di una piastra da 96 è stata ricoperta con 100 µl di anticorpo, specifico per la proteina di interesse, diluito in coating buffer e incubato a 4°C. Il giorno dopo ogni pozzetto è stato bloccato con 300 µl di Assay buffer per 1 ora a temperatura ambiente. Passata un’ ora è stato eliminato l’Assay buffer, sono stati aggiunti 100 µl di ogni campione diluito in Assay buffer ed è stata costruita la curva di calibrazione attraverso la quale è stato possibile valutare la concentrazione di IL-8. Immediatamente dopo, ai campioni ed allo standard sono stati aggiunti 50 µl di anticorpo biotinilato specifico per la proteina in esame diluito in Assay Buffer. La piastra è stata incubata a temperatura ambiente per 2 ore in condizioni di lenta agitazione. Dopo tre lavaggi con 300 µl di Wash Buffer sono stati aggiunti 100 µl/pozzetto di Streptavidin-HRP diluito 1:400 in Assay Buffer e la piastra è stata incubata per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo ulteriori cinque lavaggi con Wash Buffer, sono stati aggiunti 100 µl del substrato cromogeno 3, 3’, 5, 5’ tetrametil benzidina (TMB) e la piastra è stata incubata per 5 minuti a temperatura ambiente, dopo è stata bloccata la reazione con 100 µl di acido solforico 1,8 N, ed è stata effettuata la lettura a 450/650 nm mediante spettrofotometro.
