Metodologie per lo studio del Proteoma
Laurea Specialistica in Genomica Funzionale
Sgarra Riccardo
Dipartimento di Scienze della Vita Università degli Studi di Trieste
A.A. 2020-2021
Programma del Corso
1) Introduzione alla Proteomica
2) Metodi di estrazione delle proteine 3) Metodi di prefrazionamento
4) Metodi di condizionamento
5) Metodi per la determinazione della concentrazione proteica 6) Analisi separative di tipo
elettroforetico
Concetti generali
Elettroforesi in condizioni native Elettroforesi in condizioni denaturanti Analisi bidimensionali
7) Metodi per la visualizzazione delle proteine in gel
8) Analisi elettroforetiche on-line (CE & Chip-elettroforesi)
9) Analisi separative di tipo cromatografico
Concetti generali
Cromatografia a scambio ionico RP-HPLC e ion pair RP-HPLC Cromatografia d’affinità
Cromatografia d’esclusione, Cromatofocalizzazione
10) Spettrometria di massa
Metodi di ionizzazione Analizzatori
Tandem mass spectrometry (CID & ETD) Sequenziamento delle proteine
Peptide-mass fingerprinting
11) Shot-gun proteomics
Concetti generali e strumentazione
SILAC, ICAT, iTRAQ e metodi label free
12) Protein array
Metodologie per lo studio del proteoma
(Sgarra Riccardo – rsgarra@units.it – 040 5588721 – Dip.to Scienze della Vita, Ed. Q, II° Piano, Stanza 210)
Orari di Lezione: Come da calendario fornito (6 cfu - frontali) (1 CFU di laboratorio + altri 2 CFU con altro docente -
Erogato nel secondo semestre)
Question Day: da concordare (corso finito, prima del 1° appello) Date di esame:
Fissate in accordo con i docenti del corso e distribuite 2 per sessione solitamente distanziate di 1 mese circa.
Ricevimento: Tutti i giorni (su appuntamento concordato tramite e-mail )
Testi consigliati: nessuno – tutte le informazioni sulle slide
presentate a lezione – disponibili in rete - materiale fornito dal
docente disponibile sulla piattaforma moodle2
ORARIO Aula: A – C5
Su base settimanale (come da calendario) 48 ore lezione frontale (6CFU)
36 ore laboratorio (3CFU)
Laboratorio: date da stabilire (secondo semestre)
Gruppi da stabilire sulla base del numero, su particolari esigenze degli studenti ed in dipendenza della normativa vigente in merito alle disposizioni sul Covid19.
Indicativamente equi-distribuiti
i.e. 60 studenti => 4 gruppi da 15 persone
Esame:
a) Compito Scritto (2 ore - circa 4 minuti a domanda) - orale in caso di problemi relati a Covid-19;
b) 30 domande con risposta puntuale o “semi aperta”;
c) Possibilità di sostituire 1 domanda con una domanda a scelta (Formulazione di una domanda e relativa risposta);
d) Punteggio: Ciascuna domanda può essere valutata 1, 0.75, 0.5, 0.25 o 0;
e) Voto finale: Sommatoria dei punteggi relativi alle 30 domande. Questo voto è rapportato a 28.
f) 2 punti derivano dalle esercitazioni (presenza, consegna e valutazione delle relazioni). Se uno studente non frequenta una o più esercitazioni deve sostenere un esame scritto relativo alla parte pratica non seguita. 4 esercitazioni => 0,5 punti a esercitazione – ciascuna domanda su una singola esercitazione vale 0,5 punti (aggiunto 15’ ad esercitazione sul tempo del compito scritto).
g) Possibile arrotondamento o aumento massimo di 0,5 punti durante la correzione del compito in dipendenza delle risposte fornite relativamente ai chiarimenti richiesti.
Esempio: 24,1 – candidato risponde bene => 0.5 punti => 24.6 => 25 / NON RISPONDE BENE: 24 24.2 – candidato risponde bene => 0.5 punti => 24.7 => 25 / NON RISPONDE BENE: 24 24.3 – candidato risponde bene => 0.5 punti => 24.8 => 25 / NON RISPONDE BENE: 24 24.4 – candidato risponde bene => 0.5 punti => 24.9 => 25 / NON RISPONDE BENE: 24 24.5 – candidato risponde bene => 0.5 punti => 25.0 => 25 / NON RISPONDE BENE: 24 24.6 – candidato risponde bene => 0.5 punti => 25.1 => 25 / NON RISPONDE BENE: 25 24.7 – candidato risponde bene => 0.5 punti => 25.2 => 25 / NON RISPONDE BENE: 25 24.8 – candidato risponde bene => 0.5 punti => 25.3 => 25 / NON RISPONDE BENE: 25 24.9 – candidato risponde bene => 0.5 punti => 25.4 => 25 / NON RISPONDE BENE: 25 25.0 – candidato risponde bene => 0.5 punti => 25.5 => 26 / NON RISPONDE BENE: 25 f) Lode a discrezione del docente
Esempio:
1) Operare con un metodo per l’estrazione delle proteine che preveda molti passaggi e che richieda molto tempo cosa potrebbe comportare? (si consideri naturalmente conseguenze a livello del campione proteico estratto)
………
………
……….
2) I campioni proteici sottoposti ad analisi di tipo proteomico sono solitamente estremamente complessi (in termini di numero di componenti). Per analizzare questi campioni è dunque necessario adottare delle metodiche ……….. caratterizzate da un’elevata ………
DNA
RNA
PROTEINE
GENOMICA
PROTEOMICA Regolazione,
mantenimento e trasmissione informazione
Trasferimento
informazione Effettori
molecolari
L’informazione di base di un organismo è uguale
per tutte le sue cellule
L’utilizzo dell’informazione è differenziale a seconda del tipo di cellula e del particolare
contesto biologico preso in considerazione
Il complemento proteico è differente a seconda del tipo di cellula e
del particolare contesto biologico preso
in considerazione
DNA
mRNA
PROTEINE
GENOMICA
PROTEOMICA Regolazione,
mantenimento e trasmissione informazione
Trasferimento
&
Regolazione Effettori
molecolari
L’informazione di base di un organismo è uguale
per tutte le sue cellule
L’utilizzo dell’informazione è differenziale a seconda del tipo di cellula e del particolare
contesto biologico preso in considerazione
Il complemento proteico è differente a seconda del tipo di cellula e
del particolare contesto biologico preso
in considerazione
ncDNA Structural RNA
(i.e. tRNA/rRNA)
Regulatory RNA
(i.e miRNA)
Genomica/trascrittomica
Proteomica
Studia il complemento proteico di una determinata cellula - profilo di espressione proteica -
ovvero quali proteine sono presenti in un determinato momento STIMOLO
=>
Risposta cellulare in termini di variazioni del complemento proteico
Approcci globali nello studio della biologia cellulare
Studia il genoma come l’informazione in esso contenuta è utilizzata - i.e. profilo di espressione genica -
ovvero quali geni sono attivi in un determinato momento STIMOLO
=>
Risposta cellulare in termini di geni attivati/disattivati
FINGERPRINT – IMPRONTA molecolare
Genomica e trascrittomica
Proteomica
Studia il complemento proteico di una determinata cellula - profilo di espressione proteica -
ovvero quali proteine sono presenti in un determinato momento STIMOLO
=>
Risposta cellulare in termini di variazioni del complemento proteico
Approcci globali nello studio della biologia cellulare
Studia il genoma e come l’informazione in esso contenuta è utilizzata - i.e. profilo di trascrizione -
ovvero quali geni/ncDNA sono trascritti in un determinato momento STIMOLO
=>
Risposta cellulare in termini di geni/ncDNA/miRNA, etc.
attivati/disattivati
FINGERPRINT – IMPRONTA DIGITALE
Genomica equivale a Proteomica ?
DNA (x)
mRNA (x)
trascrizione
Processamento RNA (splicing alternativo)
mRNA (x
1)
mRNA (x
3) mRNA (x
2)
mRNA (x
4)
mRNA (x
3)
Pro-Proteina (x
3)
Traduzione
Proteina (x
3.1) Proteina (x
3.2) ....
Processamento proteolitico
Proteina (x
3.1A) Proteina (x
3.1B) ....
PTMs
Localizzazione Compartimentalizzazione
Proteina (x
3.1A-α) Proteina (x
3.1A-β) ....
Degradazione
Proteina (x
3.1A-α1) Proteina (x
3.1A-α2) ....
miRNA
miRNA
mRNA
Proteomica più complessa della genomica/trascrittomica?
Ovviamente la risposta è NO!
L’aumento di complessità riguarda esclusivamente il passaggio da mRNA a proteine in quanto da un singolo mRNA si possono ottenere più “oggetti” diversi.
Ogni singola forma proteica diversamente modificata in modo post-traduzionale è da considerarsi un’entità unica e diversa.
DNA
RNA
PROTEINS
Epigenetics
“Epigenetics” refers to structural or covalent modification of DNA, proteins involved in DNA functions, and RNA, resulting in changes in DNA transcriptional output without alterations of DNA primary sequences. In some cases, epigenetic modifications are stable and passed on to future generations, but in other instances they are dynamic and change in response to environmental stimuli. Nearly every aspect of biology is influenced by epigenetics, making it one of the most important fields in science.
?
?
Approcci allo studio della biologia cellulare/biochimica Proteomico Classico
Singola Proteina Sequenza Struttura Funzione Processi biologici
Processo biologico Proteine coinvolte
Relazione funzionale tra di esse
?
?
? ?
?
Protein list
Bioinformatic annotation tools
(i.e Gene Ontology - GO)
Functional categories Pathways
Functional Hypothesis
Experimental validation
The GO project has developed three structured ontologies that describe gene products in terms of their
associated biological processes, cellular components
molecular functions
in a species-independent manner.
There are three separate aspects to this effort: first, the development and maintenance of the ontologies themselves; second, the annotation of gene
products, which entails making associations
between the ontologies and the genes and gene
products in the collaborating databases; and third,
the development of tools that facilitate the creation,
maintenance and use of ontologies.
ESEMPIO: Biological process
Evento osservato - cambiamento fenotipico:
Epithelial to mesenchymal transition
Down-regulation Up-regulation
annotation annotation
Functional Hypothesis Test
Exploit
i.e: “has that set of proteins a role in controlling cell motility”
Biological experimental validation
Are these proteins valuable drug targets?
PROTEIN FUNCTIONAL NETWORK
Effetti “diretti” – i.e conformazionali, PTMs, etc Effetti “indiretti “– i.e. regolazione trascrizionale, etc
Conoscere quali sono le molecole “coinvolte” in un determinato processo non è un’informazione sufficiente a spiegare quel determinato processo, è necessario conoscere le loro attività e le relazioni che esse hanno con gli
altri fattori proteici e cosa queste relazioni significhino/comportino
=>
Costruire network molecolari a cui sono attribuiti dati funzionali
INSERIRE le proteine identificate all’interno di NETWORK molecolari con specifici significati funzionali
=> Capire quali sono le pathway che vengono alterate => comprendere il possibile OUTCOME funzionale
Una proteina è, in un determinato istante, il risultato dell’azione di tutta una serie di attività in serie e/o in parallelo su di essa.
SAPER guardare al di là …
Cosa significa che una proteina è più espressa in una
determinata condizione?
Fenotipo di un organismo:
proprietà osservabili di un organismo prodotte a partire dal suo genotipo in combinazione con l’ambiente.
? livello di osservazione del fenotipo:
a) morfologico;
b) fisiologico;
c) biochimico;
d) molecolare.
L’acquisizione di un particolare fenotipo non è dovuta (nella maggior parte dei casi) ad un singolo gene ma ad una cooperazione fra diversi di essi.
A livello molecolare un gene (o
meglio il suo prodotto proteico)
acquisisce una funzione/esercita la
sua influenza solo se inserito in un
appropriato contesto molecolare
Dinamicità del proteoma
Complemento proteico di una cellula VARIAZIONI
QUANTITATIVE QUALITATIVE
=> Cambiamenti nei livelli di espressione
=> Stabilizzazione proteica (strettamente connessa a variazioni qualitatitive)
=> degradazione proteica
=> Cambiamenti nell’utilizzo dell’informazione:
Attivazione / repressione genica Splicing alternativo
=> processamento proteolitico
Attivazione /disattivazione proteica degradazione proteica
=> Modificazioni post-traduzionali
(fosforilazione, acetilazione ....)
Variazioni del livello
di una determinata proteina
Variazioni delle forme di una determinata proteina
Proteine diverse
produzione effettori cellulari
Circuito (network) genetico – Aspetti temporali - Cinetica
TEM PO : an al is i ci ne ti ca de llo sv ilu pp o di un a ri sp os ta ce llu la re
Stimolo
Vie di trasduzione del segnale
attivazione effettori cellulari GENOMA
Risposta
Proteomica
2D gel
Spettrometria di massa
Cromatografia
RP-HPLC / Multi dimensional chromatography (Miniaturalizzazione colonne)
Colorazioni proteiche in gel (Coomassie, argentiche,
Protein array
(nanotecnologie)
Gestione dell’immagine (scanner,etc)
Derivatizzazioni Chimiche Fluorofori differenziali (2D)
(scanner con lapossibilità di illuminare i gel
a determinate lunghezze d’onda)
MS Protein sequencing MS peptide figerprinting Derivatizzazioni Chimiche ICAT (MS) -shotgun proteomics
dalla tecnologia dei
DNA array
Metodologie di studio per le interazioni proteina-proteina
Bioinformatica
Banche dati Swiss-prot. etc Peptide fingerprinting
MS sequencing
Robotica
(Dalla preparazione del campione all’interpretazione dei dati)
Preparazione del campione
sviluppo di detergenti, agenti riducenti, etc
