CAPITOLO 2: MATERIALI E METODI 2.1 I SITI DI STUDIO 2.1.1 LA Posidonia oceanica

CAPITOLO 2: MATERIALI E METODI

2.1 I SITI DI STUDIO

2.1.1 LA Posidonia oceanica IN TOSCANA

Il servizio difesa mare del Ministero dell’Ambiente ha definito un piano specifico per la mappatura della Posidonia oceanica lungo le coste del Mediterraneo, secondo il “Programma nazionale di

individuazione e valorizzazione della Posidonia oceanica nonché di studio della misure di salvaguardia della stessa, da tutti i fenomeni che ne comportano il degrado e la distruzione”, previsto dalla legge n° 426/98.

Intorno agli anni ’90 si è concluso il primo programma per la mappatura delle praterie di P. oceanica in 5 regioni d’Italia tra cui la Toscana (escluse le isole minori dell’Arcipelago) (fig. 2.1.1.1).

A seguito del monitoraggio in Toscana sono state individuate 7 praterie, 3 si trovano in uno stato di salute buono, e rappresentano ben il 44% dell’estensione totale, le altre sono state giudicate come mediocri e scarse (Cinelli et al., 1990).

Successivamente nel 1992 - 1994 in seguito ad una nuova

campagna è stata prodotta anche la cartografia delle isole minori dell’Arcipelago toscano.

Lo studio ha interessato le isole di Gorgona, Capraia, Pianosa, Formiche di Grosseto, Giglio, Scoglio d’Africa, Montecristo e Giannutri.

La mappatura è stata effettuata mediante Side Scan Sonar tipo E.G. & G.260 (doppia frequenza 100/500KHz) a correzione di immagine (K MAP) e Tow Fish mod.272T. La frequenza utilizzata nell’indagine è stata di 500KHz e la banda laterale coperta di 150 metri. Allo scopo di verificare il tracciato ottenuto è stato impiegato un veicolo filoguidato o Remotely Operated Vehicle (ROV) del tipo “Achille”, munito di telecamera a colori e collegato alla nave da un monocavo di 400 metri di lunghezza (fig. 2.1.1.2) (Cinelli et al., 1995).

Un ecoscandaglio scientifico di precisione ha fornito i dati relativi alla batimetria.

I limiti superiori della prateria sono stati individuati con la fotografia aerea.

Elaborando tutti i dati ottenuti è stata ottenuta una cartografia a scala 1:10.000, nella quale per la rappresentazione delle principali biocenosi bentoniche sono stati utilizzati i simboli proposti da Meinesz et al. (1983).

Inoltre, per ogni prateria è stata valutata la densità dei fasci fogliari in superfici di 40x40 centimetri ad opera di operatori subacquei con autorespiratore ad aria (ARA) (Cinelli et al., 1992).

I risultati della mappatura mostrano vaste praterie che circondano senza interruzione il perimetro delle coste dell’ isola di Pianosa e dello Scoglio d’Africa. Le altre isole, Gorgona, Formiche di

Grosseto, Giglio, Montecristo e Giannutri presentano praterie meno estese. La situazione delle prime due isole è da correlare alla

natura prevalentemente sabbiosa dei fondali, che rappresentano il substrato più idoneo all’insediamento della fanerogama, e alla topografia del fondo che, degradando dolcemente, permette alla “matte” di Posidonia oceanica di estendersi anche fino a diverse centinaia di metri dalla costa (Cinelli et al., 1992).

Nelle altre isole, invece, la limitata estensione delle praterie è da mettere in relazione con la natura prevalentemente rocciosa dei fondali (Cinelli et al., 1992).

Dall’analisi dei fasci fogliari risulta complessivamente che le praterie investigate non presentano fenomeni di degrado; esse infatti appartengono prevalentemente al II stadio della

classificazione di Giraud (1977) (prateria densa).

E’ infine da notare che in molte zone le praterie a P. oceanica si estendono anche fino 40 metri, profondità che nei nostri mari

raramente permette lo sviluppo di questa pianta (Cinelli et al., 1992).

Nel 2000 Piazzi et al. evidenziano l’importanza dell’integrazione dei metodi diretti e indiretti nella mappatura delle praterie dell’Isola d’Elba (fig. 2.1.1.3).

Figura 2.1.1.3: mappatura delle praterie di Posidonia oceanica dell’Isola d’Elba.

Posidonia oceanica si estende per un’area di circa 3680 ettari

attorno alla maggiore isola dell’Arcipelago Toscano, le praterie maggiori sono localizzate nei 4 maggiori golfi dell’isola

caratterizzati da fondali sabbiosi e dalla dolce pendenza; la costa ovest e sud-est è caratterizzata da praterie discontinue, su ghiaia e roccia. Lo stato di salute delle praterie è generalmente buono, la cartografia prodotta è in scala 1:10000.

2.1.2 LA PRATERIA DI CAVO (ISOLA D’ ELBA)

dell’Isola d’Elba e appartiene, dal punto di vista amministrativo, al Comune di Rio Marina.

Essa è il punto più vicino di approdo al continente, al quale è collegata tramite il Canale di Piombino. Il centro è collocato ai piedi del Monte Grosso (340 m) e, lungo la costa, si estende da Punta delle Paffe a Capo Castello, di fronte al quale si può notare l’isolotto dei Topi, fino a Capo Vita, punta settentrionale estrema dell’Elba (Vantaggi, 1984) (fig. 2.1.2.1; fig. 2.1.2.2)

Figura 2.1.2.1: cartina dell’ Isola d’ Elba.

La baia risulta protetta da quasi tutti i venti, ad eccezione della Tramontana (vento dominante) e del Greco - Levante (vento regnante).

La prateria si presenta ampia ed estesa, si protende verso il largo fino ad incontrare un basso fondale, dove sono evidenti i limiti

idrodinamismo, segnati da ampie zone di “ripples” ad andamento Nord-Sud.

Figura 2.1.2.2: cartina di Cavo.

La prateria nel suo complesso, fino a Capo Vita e fino ad oltre l’abitato di Cavo, presenta caratteristiche di buona qualità con zone rade molto contenute e con aree a pelle di leopardo limitate alla zona più esposta della costa ai venti del IV° quadrante. All’isolotto dei Topi, la prateria di P. oceanica s’ insedia su un fondale sabbioso a 10 metri di profondità.

Si cominciano anche ad evidenziare alcune piccole aree di P.

oceanica su roccia, fenomeno abbastanza diffuso in generale

intorno all’Isola d’Elba, dato il carattere prevalentemente roccioso di molti fondali dell’isola. La baia di Cavo è infatti caratterizzata da un litorale sabbioso interrotto da piccoli promontori rocciosi;

Posidonia oceanica si insedia su fondale sabbioso a partire da 4

metri di profondità.

La prateria di Cala delle Alghe è strutturalmente molto simile a quella presente all’ isolotto dei Topi. I valori di densità di fasci su m2 _{sono molto simili e il substrato di impianto delle 2 praterie è lo}

stesso, ma Cala delle Alghe in passato è stata soggetta ad una perturbazione antropica di notevole rilievo.

Nel giugno - luglio 1999 la porzione della spiaggia di Cavo antistante Lungomare Kennedy ha subito un intervento di ripascimento assai discutibile.

A causa della notevole vicinanza tra la spiaggia oggetto

dell’intervento antropico e Cala delle Alghe, il materiale ferroso-ematico ha raggiunto facilmente il sito campionato. Una copertura rossastra è ben visibile osservando lo strato dei rizomi di Posidonia

oceanica di tutta la prateria.

L’isolotto di Palmaiola è una piccola isola rocciosa ,che nella parte settentrionale presenta un litorale roccioso, che termina a 10 metri di profondità su un pianoro sabbioso. Qui, la prateria presenta caratteristiche di buona qualità, con ampie aree colonizzate con continuità e con alti valori di densità che si riducono relativamente tra la costa e l’ isolotto suddetto.

2.1.3 LA PRATERIA DI BARATTI

Il Golfo di Baratti appartiene al territorio comunale di Piombino, ed è un’area di particolare pregio naturalistico e paesaggistico. La prateria scelta per il campionamento si estende in prossimità del porticciolo turistico; la zona è comunemente chiamata “ Canessa” dagli abitanti del luogo.

In quest’area la prateria, che si presenta piuttosto uniforme, si spinge fino quasi a riva, lambendo con le foglie più lunghe la superficie del mare e costituendo una “récife barriere”.

La “récife barriere” è una struttura da considerare rara, soprattutto lungo le coste continentali dell’intero bacino Mediterraneo, a

conferma del pregio naturalistico dell’area (Acunto et al., 1997). Il limite inferiore si trova alla profondità di 20 metri e si presenta di tipo erosivo con un evidente scalino di “matte”, quello superiore è posto a una profondità di circa 1 metro.

La prateria è insediata su substrato sabbioso nella parte rivolta verso il Golfo mentre man mano che ci si avvicina alla Punta delle Pianacce il substrato diventa roccioso, qui il limite superiore si assesta ad una profondità di circa 10 metri ai piedi della scogliera e scompare in profondità con l’aumento della pendenza del fondale roccioso (Cinelli & Piazzi, 1990) (fig. 2.1.3.1).

I valori di densità reperibili in bibliografia per l’area indagata

mostrano una prateria in buono stato di salute,configurando sempre una prateria da densa (oltre la batimetria dei 5 metri), a molto densa nella parte più superficiale della prateria (sotto la batimetria dei 5 metri).

La riduzione della densità della pianta con l’aumentare della

profondità è un fenomeno osservato oltre che per P. oceanica anche per altre fanerogame marine (Backman & Barilotti, 1976; Hulings,

1979; Mazzella et al., 1986) e viene considerato un adattamento della pianta a ridotte condizioni di illuminazione.

2.2 ORGANIZZAZIONE DELLO STUDIO

Lo studio intrapreso sulla fioritura di Posidonia oceanica avvenuta in alcune praterie toscane nel settembre 2003, si articola in diversi punti con le seguenti finalità:

• Valutare lo stato di salute e la morfologia delle praterie considerate.

• Seguire il ciclo di riproduzione sessuale di P. oceanica in tutte le sue fasi.

• Valutare l’entità della presente fioritura in rapporto con quelle documentate negli anni 90.

• Relazionare la fioritura di P. oceanica con la temperatura del mare.

La valutazione dello stato di salute delle praterie di Cavo (Isola d’Elba) e Baratti (Piombino) è stato effettuato misurando la densità dei fasci fogliari su m2 _{e confrontando i risultati ottenuti con quelli}

presenti in bibliografia.

I dati di densità dei fasci fogliari della prateria di Cavo risalgono al 2001-2002, anni in cui è stata effettuata una indagine sullo stato di conservazione della prateria di Posidonia oceanica, a seguito degli interventi di ripascimento della spiaggia prospiciente.

Per quanto riguarda la prateria di Baratti, i dati in bibliografia

risalgono al 1997, quando Acunto et al. hanno effettuato uno studio sulla dinamica stagionale delle praterie nei golfi di Follonica e Baratti. Per valutare la salute delle praterie, lo studio si basa su rilevamenti, puntiformi e collocati in siti specifici, effettuati utilizzando il metodo del “quadrat - relevé” (Bianchi et al., 1991), particolarmente adatto per studi quantitativi, poiché effettuando conteggi diretti, risulta abbastanza immediato ottenere valori di densità.

Successivamente, è stato monitorato il fenomeno della fioritura, sempre utilizzando i “quadrat - relevé”, al fine di determinare quantitativamente il fenomeno analizzato.

Il ciclo sessuale di Posidonia oceanica è stato seguito anche nella fase della fecondazione dei fiori e della formazione dei frutti, con

particolare interesse per l’aborto dei frutti.

La germinazione dei semi è stata valutata mediante ricognizione nelle aree considerate (fig. 2.2.1).

Figura 2.2.1: germoglio di Posidonia oceanica.

Lo studio climatologico della relazione tra la fioritura e la temperatura marina ha richiesto un’analisi statistica effettuata mediante l’analisi discriminante. In questo caso, l’area considerata comprende l’intera costa toscana da Livorno a Talamone dal 1991 al 2003.

2.3 IL CAMPIONAMENTO SUBACQUEO

Il disegno di campionamento, scelto per descrivere la fioritura di P.

oceanica nelle praterie considerate è di tipo fisso; per ogni data di

campionamento sono stati effettuati 4 conteggi 3 alla stessa profondità e 1 a profondità diversa.

La prateria di Cavo (Isolotto dei Topi) si sviluppa a profondità

maggiori rispetto alla prateria di Baratti, ne consegue che anche i siti scelti per il campionamento delle 2 praterie si trovano a profondità diverse.

Nella prateria di Isolotto dei Topi (Cavo) è stato individuato un transetto specifico permanente. Il transetto scelto è costituito da 4 punti fissi, 2 dei quali (I- III) già esistenti perché corrispondenti ad un precedente “balisage” (fig. 2.3.1).

Figura 2.3.1: “balise” appartenente al transetto effettuato all’Isolotto dei Topi.

Le profondità considerate variano dai 10.4 metri del “balise I” agli 11.6 metri dei punti fissi II, III, IV.

IV

III

I

II

8 metri PUNTI II-III-IV: 11.6 m di profondità I punti del campionamento sono stati contrassegnati mediante l’uso

di aste metalliche (Sandulli et al., 1994) (fig. 2.3.2).

Per essere individuate più facilmente nelle successive immersioni di controllo, le aste sporgono dal fondo di circa 50 - 60 centimetri ed è

stata inserita una piccola boa galleggiante legata con una sagola. Un altro transetto specifico permanente è stato individuato nella

prateria di Baratti, ma in questo caso i 4 punti di riferimento scelti appartengono alla morfologia del fondale, sul quale si è sviluppato il posidoneto.

La prateria è interrotta da un’ampia radura priva di vegetazione, che segna anche un cambio della profondità.

I punti IV, III e II sono situati in prossimità del limite superiore della radura, il punto I è situato oltre il limite superiore. Le profondità considerate variano dai 2.5 ai 3,9 metri.

IV

III

I

II

Nell’ottobre 2003, al fine di ottenere una migliore valutazione dell’entità della fioritura, si è deciso di misurare il tasso di fioritura in un ulteriore sito situato sempre al Cavo: Cala delle Alghe.

Qui non è stato individuato un transetto specifico, il campionamento è stato effettuato a “random” all’interno della prateria per un totale di 4 repliche.

La profondità è pressochè invariata per tutte e 4 le repliche, va dai 7 ai 7.2 metri.

Il sito di Cala delle Alghe, a differenza di Cavo e Baratti non è stato successivamente monitorato; solo in giugno – luglio si è deciso di tornare in loco per verificare la presenza di germogli.

Tutte le misurazioni sono state effettuate in immersione autonoma dalla barca con autorespiratore ad aria (A.R.A). Per rilevare il tasso di fioritura, di aborto dei fiori, di fruttificazione e di germinazione sono state effettuate misure di densità dei fasci, dei fiori e dei frutti di

Posidonia oceanica, utilizzando il metodo del “quadrat-relevé”

(Bianchi et al., 1991). Si sono usate cornici di PVC di 50 centimetri di lato, con alcuni fori che lascino entrare l’acqua: a terra la cornice presenta peso trascurabile, in immersione la penetrazione dell’acqua la rende debolmente negativa, ma sempre molto leggera e

maneggevole. In questo modo è assai stabile sia sui fondali pianeggianti sia sulle pareti verticali (fig. 2.3.3).

Per maggiore praticità il quadrato è stato suddiviso al suo interno, per mezzo di una serie di cimette, in 4 quadrati più piccoli che fungono da riferimento per i rilevamenti quantitativi.

Figura 2.3.3: uso del “quadrat – relevè” per i rilevamenti quantitativi.

Tutti i dati raccolti “in situ” sono stati annotati su lavagnette di PVC, sulle quali è stata posizionata una bussola usata per il rilievo della direzione subacquea del transetto.

In tutte le immersioni è stata effettuata una documentazione sia fotografica (mediante fotocamera digitale) sia con registrazioni video (mediante telecamera scafandrata) del lavoro subacqueo svolto (fig. 2.3.4). Figura 2.3.4: uso della telecamera subacquea per le registrazioni video del monitoraggio subacqueo.

Le immersioni di campionamento sono state effettuate in alcuni mesi dell’ anno considerati di particolare rilievo nel ciclo di fioritura,

fruttificazione e germinazione della specie.

Le 2 praterie sono state campionate sempre a pochi giorni di distanza l’una dall’altra, al fine di minimizzare possibili differenze legate a diversi momenti del ciclo di riproduzione sessuale.

Una prima serie di immersioni di ricognizione è stata effettuata alla fine del mese di settembre 2003, per verificare le dimensioni del fenomeno della fioritura, scegliere i siti in cui effettuare il

campionamento e all’interno di questi localizzare e definire i transetti con i punti fissi.

Nell’ottobre 2003 sono iniziati i conteggi con l’uso del “quadrat –

relevé” nelle praterie di Cavo (Isolotto dei Topi) Cavo (Cala delle

Alghe) e Baratti. In questo periodo sono stati misurati: • Densità dei fasci fogliari di Posidonia oceanica su m2

• Densità delle infiorescenze di Posidonia oceanica su m2

A marzo - aprile 2004 all’ Isolotto dei Topi e a Baratti, sono stati effettuati i conteggi successivi; in questo caso i parametri misurati sono stati:

• Densità dei fasci fogliari di Posidonia oceanica su m2

• Densità delle infiorescenze di Posidonia oceanica su m2

• Densità delle infiorescenze di Posidonia oceanica abortite su m2

• Densità dei frutti di Posidonia oceanica su m2

Le ultime immersioni con uso del “quadrat – relevé” risalgono a giugno – luglio 2004; in questo periodo sono stati misurati:

• Densità delle infiorescenze di Posidonia oceanica abortite su m2

ancora presenti alla base del fascio

In questo periodo dell’anno e nei mesi successivi sono state effettuate varie immersioni di ricognizione, al fine di individuare la presenza di germogli di P. oceanica nelle praterie di Baratti, Cavo (Isolotto dei Topi) e Cavo (Cala delle Alghe).

Sulla base dei conteggi effettuati, sono stati successivamente calcolati:

• Il tasso di fioritura che corrisponde al n° di fasci fertili su n° totale di fasci x 100 (Pergent, 1995)

• Il tasso di fruttificazione che corrisponde al n° di fasci con frutti su n° di fasci con infiorescenze x 100 (Pergent, 1995)

Il 25/06/04 è stato effettuato anche un monitoraggio ambientale, eseguito in immersione autonoma con autorespiratore ad aria

(A.R.A), per il prelievo di sedimenti dai fondali antistanti la spiaggia di Cavo, oggetto del ripascimento. In laboratorio i campioni sono stati sottoposti a test biologici, al fine di valutare le loro proprietà tossiche su alcuni organismi marini.

Il monitoraggio ha portato al prelievo di 8 campioni in 8 postazioni diverse, selezionate in relazione alla dispersione del materiale usato nell’ intervento antropico, nel tratto di spiaggia soggetto al

ripascimento compreso tra il porto, Punta Scandelli e Cala delle Alghe ed in un punto esterno all’area indagata (Cala Mandriola), considerato come “bianco” .

Degli 8 prelievi, 6 sono stati effettuati nel fondale antistante la

spiaggia che costeggia Lungomare Kennedy seguendo 2 transetti che dalla spiaggia si allontanano dalla costa in linea retta fino alla

distanza massima di 400 metri dalla costa.

I 2 transetti sono stati ubicati uno in corrispondenza di Via Bellaria e l’altro in corrispondenza del Bar Paradiso; per ogni transetto sono stati effettuati 3 prelievi:

• A 2 metri di distanza dalla costa e alla profondità di circa 1 metro.

• A 200 metri di distanza dalla costa e alla profondità di circa 5 metri.

• A 400 metri di distanza dalla costa e alla profondità di circa 10 metri.

Un altro campione è stato prelevato a Cala delle Alghe alla profondità di 5.3 metri ed ad una distanza di 150 metri dalla costa; questo sito è stato scelto per la sua vicinanza con la spiaggia oggetto del

ripascimento, al fine di valutare gli effetti della dispersione del materiale usato.

Il sito di Cala Mandriola è stato scelto come “bianco”, data la sua sostanziale estraneità ad ogni possibile contatto con il materiale depositato sulla spiaggia di Cavo; il prelievo è stato effettuato a una profondità di 10 metri ed a una distanza di 200 metri dalla costa. I prelievi dei sedimenti sono stati eseguiti mediante un contenitore cilindrico in vetro e un carotatore a mano, al fine di verificare una eventuale stratificazione degli inquinanti nella matrice.

Il carotatore utilizzato è costituito da un tubo di alluminio di circa 90 centimetri di lunghezza e del diametro di 20 centimetri che viene inserito nel sedimento, chiuso e riportato in superficie. Il tubo è dotato di 2 manici laterali per permettere all’operatore di spingere il carotatore nel sedimento.

La carota è stata divisa in 3 porzioni:

• La “testa” della carota, corrispondente ai primi 10 centimetri prelevati (porzione A)

• Il “centro” della carota, corrispondente ai successivi 20 / 30 centimetri (porzione B)

Il contenitore cilindrico in vetro ha permesso di prelevare la porzione superficiale del sedimento corrispondente ai primi 3-4 centimetri.

2.4 LE ANALISI DI LABORATORIO

I campioni di sedimento prelevati il 25/06/04, sono stati conservati refrigerati durante il trasporto, fino al momento delle analisi

avvenute il 28/06/04 nei laboratori della Eco Bioqual.

Le analisi ecotossicologiche dei sedimenti sono state eseguite sull’ acqua interstiziale, ottenuta mediante centrifugazione

refrigerata. Nei casi in cui è risultato impossibile il recupero dell’ acqua interstiziale, sono stati utilizzati elutriati dei campioni, ottenuti attraverso omogeneizzazione manuale del campione, estrazione dal sedimento in acqua di mare sintetica in un rapporto 1:4, agitazione magnetica per 60 minuti e centrifugazione con filtrazione del surnatante (Eco Bioqual, 2004).

I campioni sono stati sottoposti a 4 saggi di tossicità acuta:

• Saggio di tossicità acuta - inibizione dell’emissione luminosa del Vibrio fischeri.

• Saggio di tossicità acuta con il crostaceo marino Artemia

salina (valutazione della LC50 a 24h).

• Saggio di tossicità acuta con il rotifero marino Brachionus

plicatilis (valutazione della LC50 a 24h/48h).

• Saggio di tossicità acuta - inibizione dell’emissione luminosa del Vibrio fischeri per campioni solidi.

2.4.1 SAGGIO DI TOSSICITA’ ACUTA: INIBIZIONE

DELL’EMISSIONE LUMINOSA DEL Vibrio fischeri –

TEST MICROTOX

L’attività tossica dei campioni è stata misurata con il sistema Microtox (Azur Environmental, USA), che utilizza una matrice biologica dei batteri marini bioluminescenti (Vibrio fischeri) (Eco Bioqual, 2004).

In questi batteri c’è una corrispondenza tra la produzione di luce e il loro stato di salute; in presenza di tossicità uno dei tanti enzimi coinvolti nella produzione di luce viene inibito.

La capacità luminosa dei batteri risulta inversamente proporzionale al grado di tossicità della sostanza analizzata.

I batteri liofilizzati (circa 1 milione per ogni unità di preparato) vengono reidratati e la sospensione viene messa in contatto con diluizioni scalari del campione da analizzare, alla temperatura di 15° C. La lettura viene effettuata contro un bianco che misura (tramite un fotometro termostatato) le potenzialità luminose intrinseche dei batteri prima dell’introduzione del campione, per evitare interferenze dovute al loro decadimento naturale.

I valori di luminosità, registrati a tempo zero dopo 5’, 15’ e 30’, sono utilizzati per il conteggio della perdita di luminosità e

conseguentemente, della capacità tossica del campione, ponendoli in relazione con le diluizioni operate sul campione stesso (Eco Bioqual, 2004).

La potenzialità tossica del campione è espressa come EC50 che

indica la diluizione del campione, che ha portato a una riduzione del 50% della intensità luminosa dei batteri.

I risultati delle analisi sono state espresse in Unità Tossica, che corrisponde al reciproco dell’EC50 e mostra quindi, una correlazione

diretta con il grado di tossicità posseduto dal campione.

2.4.2 SAGGIO DI TOSSICITA’ ACUTA CON IL

CROSTACEO MARINO Artemia salina

( VALUTAZIONE DELLA LC

A 24 h)

Il saggio si basa sulla mortalità di organismi di Artemia salina nel campione analizzato, nei confronti di un campione di controllo. Il test eseguito è stato messo a punto dal team di ricerca del prof. G. Persone all’ Università di Ghent (LABRAP), in Belgio, in accordo con le normative in materia (OECD Guidelines 202, ISO, USEPA, ASTM) (Eco Bioqual, 2004).

Prima di iniziare il test, sono state preparate le soluzioni necessarie utilizzando la soluzioni standard fornite.

Nel corso del test, effettuato a 25°C e al buio, sono state

analizzate 5 diluizioni con 3 repliche per ognuna; in ogni replica sono stati utilizzati 10 organismi.

I risultati laddove necessario, sono stati elaborati con un

programma statistico basato sull’ analisi dei probit: in particolare, la curva sigmoide caratteristica della relazione tra dose analizzata e i valori percentuali di risposta, viene trasformata in una retta.

L’analisi dei probits consiste nel calcolo della retta dose – risposta mediante il sistema della regressione lineare con un procedimento iterativo per approssimazioni successive. Calcolata la retta è

possibile determinare il valore della concentrazione efficace mediana (EC50 o LC50) (Eco Bioqual, 2004).

2.4.3 SAGGIO DI TOSSICITA’ ACUTA CON IL

ROTIFERO MARINO Brachionus plicatilis

(VALUTAZIONE DELLA LC

A 24 h/48 h)

Il saggio si basa sulla mortalità di organismi di Brachionus plicatilis nel campione analizzato, nei confronti di un campione di controllo. Il test eseguito è stato messo a punto dal team di ricerca del prof. G. Persone all’Università di Ghent (LABRAP), in Belgio, in accordo con le normative in materia (OECD Guidelines 202, ISO, USEPA, ASTM) (Eco Bioqual, 2004).

Prima di iniziare il test, sono state preparate le soluzioni necessarie utilizzando la soluzioni standard fornite.

Nel corso del test, effettuato a 25°C e al buio, sono state

analizzate 5 diluizioni con 6 repliche per ognuna; in ogni replica sono stati utilizzati 5 organismi.

I risultati laddove necessario, sono stati elaborati con un

programma statistico basato sull’analisi dei probit: in particolare, la curva sigmoide caratteristica della relazione tra dose analizzata e i valori percentuali di risposta, viene trasformata in una retta.

L’analisi dei probits consiste nel calcolo della retta dose – risposta mediante il sistema della regressione lineare con un procedimento iterativo per approssimazioni successive. Calcolata la retta è

possibile determinare il valore della concentrazione efficace mediana (EC50 o LC50) (Eco Bioqual, 2004).

2.4.4 SAGGIO DI TOSSICITA’ ACUTA : INIBIZIONE

DELL’EMISSIONE LUMINOSA DEL Vibrio fischeri

PER CAMPIONI SOLIDI. (MICROTOX SOLID PHASE)

• IRSA (1996) Saggio di tossicità acuta con batteri bioluminescenti, CNR – Istituto di ricerca sulle acque, “Notiziario dei metodi analitici”, giugno, 1996, 1-8;

• Manuale MICROTOX “Microtox Acute Toxicity Solid-Phase Test” – Azur Environemental (1995);

Il saggio si basa sulla variazione d’intensità della luce (H%) emessa dal batterio bioluminescente Vibrio fischeri in presenza di fonti di stress, rispetto al controllo.

Questo test consente la valutazione delle proprietà tossiche di campioni solidi dal momento che, prevede l’esposizione diretta dei batteri bioluminescenti al campione solido per 20 minuti ed una successiva incubazione di 10 minuti nel lumenometro (M 500

Toxicity Analyser) delle sospensioni batteriche ottenute, filtrando la serie di diluizioni del campione in apposite colonnine filtro.

Per ogni campione analizzato il risultato viene espresso in EC50 che

indica la percentuale di campione che dopo 30’ di esposizione, ha provocato un decremento dell’intensità luminosa, nel 50% dei batteri utilizzati.