Materiali e Metodi
Gel di agarosio
Agarosio 0,8-1,5% (peso/volume)
Bromuro di etidio 10 µg/ml finale
TBE 1X
2.3.d Estrazione di DNA da gel di agarosio
Con tale procedura è possibile estrarre singoli frammenti di DNA da gel, dopo averli separati mediante una corsa elettroforetica. Questo metodo permette di separare i frammenti ottenuti dalla digestione di un vettore con endonucleasi di restrizione, come, ad esempio, l'inserto ed il vettore in cui era inserito. Analogamente, è possibile eluire frammenti di DNA da gel, ottenuti mediante amplificazione per PCR. Dopo aver effettuato la corsa elettroforetica, per un tempo sufficiente a garantire una buona separazione dei frammenti, si procede all'escissione della banda, visibile al transilluminatore UV, ritagliandola con una lama. Per il protocollo di estrazione abbiamo utilizzato il kit di estrazione "NucleoSpin Extract", fornito dalla ditta Macherey-Nagel. Dopo aver pesato la banda, ritagliata dal gel, con una bilancia di precisione, si aggiunge la soluzione NT1, che contiene sali caotropici e sostanze per disciogliere l'agarosio, in rapporto 300 µl di soluzione : 100 mg di agarosio. Si lascia incubare la miscela a 50°C per 10 minuti, agitando ogni 2-3 minuti. Il campione viene poi caricato in colonnine "NucleoSpin Extract", da cui si effettua l'eluizione centrifugando per 1 minuto a 11.000 RPM. La soluzione NT1 facilita, infatti, il legame del DNA al supporto di silice della colonnina. Dopo aver eliminato l'eluato, si aggiungono 600 µl di soluzione NT3,
Materiali e Metodi
contenente etanolo, per eliminare contaminazioni come sali e componenti macromolecolari solubili; si effettua una centrifugazione per 1 minuto a 11.000 RPM, si elimina l'eluato e si risciacqua con NT3. Infine, si eluisce il DNA con 50 µl di buffer NE, lasciando agire per 1 minuto e centrifugando per 1 minuto a 13.000 RPM.
L'estrazione può essere verificata tramite una corsa su gel di controllo.
2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR)
(Sambrook et al., 1989)
La tecnica della reazione a catena della DNA polimerasi, o PCR, permette di amplificare un frammento di DNA utilizzando specifici primers, grazie alle proprietà di sintesi di una DNA-polimerasi. I primers sono oligonucleotidi, sintetizzati in vitro, lunghi qualche decina di deossiribonucleotidi e complementari, su eliche diverse, alle estremità del frammento di DNA da amplificare. In opportune condizioni, essi si appaiano alle sequenze complementari sul DNA e fungono da inneschi per la polimerasi. Per i procedimenti di clonazione, i primers vengono disegnati in modo da avere alla loro estremità 5' una sequenza di riconoscimento per un enzima di restrizione, che non taglia all’interno del frammento di interesse. Questo consente, al termine della reazione di amplificazione, di digerire le estremità del DNA ottenuto, in modo da poterlo clonare in un vettore precedentemente tagliato con lo stesso enzima (o gli stessi enzimi) di restrizione. La reazione, generalmente, viene effettuata in un volume di 50-100 µl. Il protocollo, qui
