CAPITOLO 5 – DISCUSSIONE
Uno dei principali obiettivi della ricerca biomedica odierna è il controllo della diffusione dell’AIDS.
Molti tentativi di sviluppare un vaccino sono stati rallentati in parte dalla difficoltà di definire chiaramente i meccanismi specifici che intervengono nella risposta immunitaria contro il virus, in parte da caratteristiche specifiche del virus stesso.
Comprendere le modalità con cui i lentivirus si replicano, sfuggono al sistema immune e provocano malattia sono obiettivi da raggiungere al fine di mettere a punto terapie antivirali e sviluppare vaccini.
In questo ambito i cloni molecolari di isolati virali rappresentano una risorsa insostituibile nella pratica di laboratorio; essi, infatti, possono essere utilizzati per produrre proteine, caratterizzare funzionalmente geni e, se replicazione competenti, possono essere usati per chiarire sia vari aspetti della biologia del virus, quali i meccanismi di replicazione e patogenesi, sia per per la messa a punto di strategie vaccinali e terapeutiche.
In relazione a tutto ciò, nel lavoro oggetto di questa tesi è stato costruito un clone molecolare replicazione competente di un ceppo FIV di sottotipo B a partire dall’isolato FIV M2, ottenuto localmente; detto isolato è stato scelto in considerazione dell’ampia diffusione di ceppi FIV di questo sottotipo in Italia e nel Sud Europa in generale (Pistello et al., 1997). Un tale clone potrà quindi essere utilizzato sia per quanto sopra detto sia per
produrre immunogeni in grado di conferire protezione vaccinale contro isolati virali circolanti nell’Europa Meridionale.
Poichè è stato deciso, per ottenere maggiori garanzie riguardo il mantenimento delle caratteristiche biologiche e immunopatogenetiche del ceppo circolante in vivo, di usare un isolato primario di fresco ottenimento, il DNA provirale è stato estratto da cellule (linfociti della milza) e tessuti (midollo osseo, timo, milza, linfonodo sottomascellare e linfonodo
mesenterico) prelevati da un gatto infettato da oltre 10 anni da FIV M2 e
deceduto per gravi complicazioni respiratorie; questi tessuti sono stati
scelti in considerazione del maggior tropismo del virus verso i compartimenti linfoidi.
Prima di amplificare l’intero genoma di M2, i DNA estratti dai tessuti in esame sono stati testati per alcuni parametri, quali la competenza per l’amplificazione, la positività per FIV e il carico provirale mediante, rispettivamente, amplificazione del gene felino α-TNF, del gene virale gag codificante per la proteina p25 e metodica TaqMan PCR.
I campioni linfonodo sottomascellare e milza sono stati scartati in quanto i DNA estratti da tali tessuti sono risultati essere non amplificabili. Il carico provirale, nei campioni rimanenti, tutti positivi per FIV, è risultato essere piuttosto basso; ciò soprattutto nel timo, come atteso a causa dell’età adulta dell’animale. Tuttavia, quantità di DNA provirale idonee per l’amplificazione sono risultate essere presenti nei campioni midollo osseo, linfonodo mesenterico e cellule della milza.
E’ stata, quindi, sviluppata una strategia di amplificazione del DNA provirale che prevede il disegno di opportuni primer (dedotti dalla sequenza nucleotidica di FIV TM2, ceppo prototipo di sottotipo B di cui era nota la sequenza dell’intero genoma), con i quali ottenere cinque
frammenti parzialmente sovrapposti dell’intero DNA provirale: LTR5’, gag-pol, pol-env, env e LTR3’ (Fig. 3.1).
Alcuni inconvenienti, ovvero la notevole lunghezza dei frammenti sottoposti ad amplificazione e il basso numero di copie di DNA provirale presenti nei vari campioni di partenza, hanno reso piuttosto problematica l’amplificazione dei frammenti gag-pol, pol-env ed env. Al fine di aumentare l’efficienza e la sensibilità della reazione di amplificazione, è stata sviluppata una nested-PCR apposita e, per la messa a punto del saggio, sono state eseguite, per ciascun frammento, diverse reazioni di amplificazione al fine di ottimizzare i vari parametri di PCR (quantità di templato, temperature di annealing, ecc).
Nonostante varie prove, non sempre è stato possibile ottenere tutti gli amplificati attesi da tutti i campioni di partenza, probabilmente a causa di non ottimali compatibilità tra primer e/o condizioni di saggio.
Particolarmente complicata si è rivelata l’amplificazione di env poichè, in questo caso, oltre alla banda di interesse, è stato ottenuto anche un frammento aspecifico assai più corto in tutte le reazioni effettuate; questo, sottoposto a sequenziamento, si è mostrato essere env contenente un’ampia delezione nella regione centrale.
Per tutte le ragioni sopra riportate, al fine di amplificare le LTR, oltre ai campioni linfonodo mesenterico, linfociti milza e midollo osseo, sono state utilizzate anche cellule MBM infettate con l’isolato M2 di FIV.
Come atteso, il carico provirale valutato mediante tecnica TaqMan-PCR sul DNA estratto da tali cellule è risultato essere decisamente maggiore rispetto a quello stimato nei campioni di tessuti autoptici.
Le due LTR sono state inizialmente amplificate mediante Vectorette-PCR; tuttavia, con tale metodica è stato ottenuto soltanto un elevato
numero di aspecifici. Sulla base dell’osservazione che LTR di ceppi FIV appartenenti a sottotipi diversi non mostrano differenze significative nella sequenza nucleotidica e che, nell’ ambito di uno stesso sottotipo, le LTR sono altamente conservate, i primer necessari per l’amplificazione delle due LTR sono stati dedotti, come per i frammenti gag-pol, pol-env ed env, dalla sequenza nucleotidica dell’isolato TM2.
Con lo scopo di verificare il possibile inserimento di mutazioni durante la reazione di PCR, tutti i frammenti sono stati amplificati un minimo di due volte in reazioni separate.
Per verificare, prima del clonaggio, che gli amplificati ottenuti fossero
realmente il ceppo FIV M2 e non altri ceppi FIV, quali Petaluma (ceppo
prototipo di sottotipo A ampiamente utilizzato nel laboratorio da cui potrebbe derivare una contaminazione), o frammenti di genoma cellulare, è stata effettuata una digestione degli amplificati con specifici enzimi scelti in riferimento alle mappe di restrizione degli isolati TM2 e Petaluma in modo da ottenere due distinti pattern di restrizione.
Il sequenziamento dei frammenti gag-pol, pol-env, env e LTR ha escluso l’inserimento di mutazioni durante il processo di PCR.
Poiché le sequenze nucleotidiche dei frammenti gag-pol, pol-env, env e LTR con i relativi frammenti sono del tutto simili all’isolato TM2, mentre mostrano differenze significative quando confrontate con il ceppo Petaluma, è stato possibile concludere che gli amplificati ottenuti sono realmente il ceppo M2, come dimostrato in precedenza mediante digestione enzimatica.
Tutte le reazioni di clonaggio nel vettore pCRII-TOPO sono risultate essere poco efficienti a causa della notevole lunghezza degli inserti; in particolare, il clonaggio di env è risultato essere il più complicato poiché la
banda indesiderata (presente nella miscela di reazione), essendo molto più corta del frammento di interesse è stata clonata con maggiore facilità. A causa di questi inconvenienti sono stati ottenuti pochi cloni per ciascun frammento, sebbene sia stato analizzato un elevato numero di colonie.
Le sequenze nucleotidiche, così come quelle aminoacidiche,
appartenenti ad uno stesso frammento sono risultate essere pressocchè identiche anche se provenienti da tessuti diversi. Questo aspetto ha indubbiamente facilitato il nostro lavoro in quanto, come illustrato nei Risultati, non è stato possibile amplificare i frammenti comprendenti l’intero genoma da uno stesso tessuto. L’identità di sequenza ci ha permesso quindi di clonare frammenti da tessuti diversi e di ricostruire un genoma provirale rappresentativo, in linea di massima, di quello del ceppo FIV circolante in natura.
Poichè non è stato possibile individuare enzimi con siti di taglio unici nei singoli frammenti (in particolare nelle regioni di sovrapposizione) e sull’intero genoma di M2, la ligazione dei frammenti nel vettore pUC19 è stata effettuata seguendo un ordine ben preciso.
Le maggiori difficoltà sono state incontrate nel ligare il frammento pol poichè BpmI, l’unico enzima a disposizione per ligare i frammenti gag-pol e gag-pol-env, possiede siti di taglio sia sul pUC19, nel gene di resistenza all’ampicillina, sia su tutti gli altri frammenti in cui il genoma di FIV è stato suddiviso. Al fine di clonare tale frammento, è stata quindi sviluppata una strategia che prevede la ligazione dei frammenti gag-pol e pol-env mediante due PCR successive e digestione dell’amplificato ottenuto con opportuni enzimi (§ 4.6.2.5).
Per valutarne la capacità replicativa, il clone prodotto contenente il
fibroblasti renali felini CrFK ed il virus rilasciato nel surnatante di coltura è stato raccolto ed utilizzato per infettare la linea di linfoblasti T felini MBM. Il rapido e costante aumento della p25 nel surnatante della coltura suggerisce che il clone molecolare prodotto è replicazione competente; questa proprietà è stata poi verificata mediante propagazione a lungo termine in vitro in cellule MBM e per sequenziamento dell’intero virus. Questo lavoro, conclusosi quindi con la conferma delle proprietà replicative in vitro dell’isolato ex vivo e il suo completo sequenziamento, costituisce indispensabile premessa ad una fase di studio in vivo nella quale verranno valutate propietà patogenetiche ed immunogenetiche del clone. Una volta pienamente caratterizzato, il clone molecolare ottenuto costituirà un valido ausilio per lo sviluppo di vaccini e terapie anti-FIV.
