CAPITOLO 5 MATERIALI E METODI
5.1 Popolazione di studio. L'analisi mutazionale dei geni Gata4 e Nkx2.5 è stata effettuata su un totale di 10 pazienti affetti da CC afferenti presso l'Ospedale Pasquinucci di Massa. Di questi, 5 avevano una storia familiare positiva (2 maschi; 24 mesi ± 36) e 5 erano casi sporadici (1 maschio; 35 mesi ± 67) e risultavano appaiati per il tipo di CC. Dai pazienti con CC familiare abbiamo ottenuto un campione di sangue periferico (5 cc) dal quale è stato estratto il DNA genomico, mentre dai pazienti con una forma sporadica di CC abbiamo analizzato il DNA estratto da un campione bioptico di tessuto cardiaco, ottenuto da interventi chirurgici di correzione del difetto.
Nelle tabella 2 e 3 sono riportate le caratteristiche demografiche e cliniche dei pazienti ed in figura 14 è rappresentata la ricorrenza della patologia nei casi familiari di CC.
Tab.2. Caratteristiche demografiche e cliniche dei pazienti con storia familiare di CC.
*Età al momento del prelievo.
Tof: tetralogia di Fallot; DIV: difetto del setto inter-ventricolre; DIA: difetto del setto inter-atriale; AP: atresia polmonare
Fig.14. Ricorrenza della patologia nei 5 casi familiari. F-1
F-3
F-2
F-4
Tab.3.Caratteristiche demografiche e cliniche dei pazienti con CC sporadica.
*Età al momento del prelievo.
Tof: tetralogia di Fallot; DIV: difetto del setto ventricolre; DIA: difetto del setto inter-atriale; AP: atresia polmonare
5.2. Estrazione del DNA totale. Il DNA di ciascun paziente è stato estratto mediante l’utilizzo del Biorobot
EZ1 (QIAGEN) che permette l'estrazione di DNA sia da sangue che da
tessuto, in maniera automatico, da 6 campioni in un unico step che prevede:
1. lisi dei campioni,
2. legame del DNA a particelle magnetiche, 3. lavaggio ed eluizione del DNA.
5.3. Valutazione quantitativa del DNA totale. Sono state preparate diluizioni 1:250 in acqua sterile del DNA estratto per la lettura spettrofotometrica alle lunghezze d’onda di 260 nm e di 280 nm. La misura consente la determinazione quantitativa della concentrazione del DNA e, dalla lettura a 280 nm per la stima delle proteine, si ricavano
informazioni anche di tipo qualitativo. Infatti, il rapporto delle assorbanze a 260 nm e a 280 nm è considerato un indice di purezza del campione. Un valore accettabile di tale rapporto per il DNA è di 1.7-1.9. Le concentrazioni finali dei campioni si sono ricavate tramite la seguente formula: CONC. FINALE= λ260 x fattore di diluizione.
5.4. Sequenziamento genico. L'amplificazione dei frammenti d'interesse del gene Gata4 e Nkx2.5 è stata ottenuta mediante la reazione a catena della Polimerasi (PCR). Le sequenze relative ai primers specifici e le relative condizioni di reazioni sono riportate tabelle 4 e 5.
I primer utilizzati per il gene Nkx2.5 sono stati descritti in studi precedenti (Zhang et al. 2009).
Le sequenze dei primer per gli esoni 1, 3-7 e per la regione 3'UTR del gene Gata4 sono state precedentemente descritte (Borlak J et al.,2007). La sequenza dei primer per l'esone 2 è stata, invece, disegnata mediante l'utilizzo del software Primer3
Tab.4. Primers e condizioni di reazione per Gata4.
*Reazioni di PCR svolte con DMSO (8,7%) e BSA (0,6 ng/mL) TD: touch down PCR
Tab.5. Primers e condizioni di reazione per Nkx2.5.
*Reazioni di PCR svolte con DMSO (8,7%) e BSA (0,6 ng/mL) TD: touch down PCR
Le PCR relative ai geni Gata4 e Nkx2.5 sono state realizzate in una mix di 50 mL contenente 1x PCR Buffer, 100 ng DNA, primers (visualizzati nelle tabelle 1 e 2), 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs e 1.25 U di Hot Start taq polymerase (Euroclone, Milano, Italy). In alcuni casi sono stati aggiunti 8.7% di dimetilsulfossido (DMSO) e 0.6 ng/mL di albumina sierica bovina (BSA). Sono stati necessari 35 cicli di reazione, programmati secondo il seguente schema: denaturazione iniziale a 94°C per 5 minuti seguita da un ciclo a 94°C per 30 secondi; 58-71°C per 45 secondi e 72°C per 45 secondi per 35 cicli. L'estensione finale è stata condotta a 72°C per 10 minuti.
5.5. Elettroforesi su gel d'agarosio. La reazione di PCR è stata visualizzata e verificata su un gel d’agarosio al 1.5% contenente bromuro d'etidio 10 mg/ml ad una concentrazione finale di 0.3%. Sono stati caricati sul gel 5μl del prodotto di PCR aggiunti a 2 μl di “loading” buffer (L.B.: 0.25% blu di bromo fenolo, 0.25% cilene-cianolo, 15% glicerolo) e un marker di DNA da 100 pb (PRIME). La corsa elettroforetica è stata condotta a 100 V in tampone TBE 1X (Tris base 4 mM, 0.9 M acido borico, 50 mM EDTA, a pH 8).
5.6. Purificazione del prodotto di PCR. Al fine di rimuovere dai prodotti di PCR enzimi, oligonucleotidi, primers, dimeri dei primers e sali e ottenere così un buon esito di sequenziamento, è stato utilizzato il kit commerciale di purificazione della PCR EuroGOLD
Il kit prevedeva 3 passaggi:
• legame reversibile del DNA alla matrice di silice presente all'interno della colonnina mediante l'uso del Binding Buffer XP1,
• lavaggio del DNA da proteine, sali e nucleotidi liberi mediante SPW Wash Buffer diluito con etanolo 100%,
• eluizione del DNA purificato con Elution Buffer.
5.7. Misura spettrofotometrica del prodotto di PCR. La concentrazione del DNA è stata calcolata mediante l'uso del Fluorimetro Qubit™ (Invitrogen) in base alla relazione tra i due standards usati nella calibrazione.
Il fluorimentro Qubit™ fornisce i valori in ng/µL. Questo valore corrisponde alla concentrazione del campione dopo la diluizione, calcolata mediante la seguente equazione:
C = QF*100/X
dove:
• QF = valore della lettura del fluorimetro Qubit • X = numero di microlitri di campione aggiunti • 100 = fattore di diluizione
In base alle dimensioni dell'amplificato e alla concentrazione calcolata allo spettrofotometro, vengono stimati i ng da utilizzare nella reazione di sequenza.
5.8. Analisi di sequenza. Il sequenziamento genico dei geni Gata4 e Nkx2.5 è stato ottenuto
mediante l'impiego della piattaforma ad alta processività “GenomeLab GeXP Genetic Analysis System” (Beckman) (Fig.15).
Durante il sequenziamento, i frammenti di DNA corrono lungo il capillare e vengono rilevati, in modo automatico, da una luce laser di una lunghezza d'onda tale da eccitare la fluorescenza dei ddNTP marcati ed aggiunti alla PCR di sequenza. Il segnale risultante produce un pattern di bande con aree proporzionali all'intensità di emissione e che correla con una sequenza di DNA, detto Elettroferogramma. La sequenza ottenuta è, quindi, confrontata con la sequenza di riferimento ottenibile attraverso un software specifico che si basa sul programma Gene Bank BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), il più diffuso programma di allineamento locale delle sequenze.
Tale sistema è utilizzato per identificare mutazioni causative in geni responsabili di malattie geniche e per caratterizzare una regione di DNA al fine di ricercare mutazioni non note.
Fig.15. Sequenziatore automatico CEQ8800 (Beckman); GenomeLab DTCS Quick Start kit ed esempio di sequenza ottenuta.
2.Programma di PCR per un totale di 30 cicli:
3.Precipitazione con Etanolo
• Preparazione di una “Stop Solution” da aggiungere al prodotto di PCR di sequenza (2μl di Sodio Acetato 3M a pH 5.2, 2μl di 100 mM Na2-EDTA a ph 8.0 e 1μl di 20 mg/ml di glicogeno),
• Precipitazione con Etanolo 95%, • Precipitazione con Etanolo 70%,
