Fig.1
Rappresentazione schematica della struttura molecolare dei tiazolidinedioni (TZDs), ligandi sintetici agonisti di PPARγA
) CiglitazoneB
) RosiglitazoneO
S
O
O
NH
O
S
O
O
NH
N
N
A
B
hPPARγγγγ1
hPPARγγγγ2
hPPARγγγγ3
Esoni 1-6
A1 A2 B A1 A1 A2 A2 B B A1 A2 B A2477 aa
505 aa
477 aa
Fig.2
A)
Rappresentazione schematica delle isoforme di PPARγγγγ
Il gene di PPARγ umano contiene 3 promotori (indicati dalla freccia) e codifica per tre mRNA che , in seguito a splicing alternativo, danno origine a tre isoforme proteiche diverse; 6 esoni sono comuni a tutte le isoforme; gli esoni A1 e A2 sono specifici per PPARγ1; l’esone B è specifico per PPARγ2 e codifica per i 28 aminoacidi N-terminali aggiuntivi ( Endocr Rev 1999 20:649-688).
B) Rappresentazione schematica della struttura proteica di PPARγγγγ
La struttura proteica di PPARγ è costituita da 5 domini funzionalmente diversi:
-dominio A/B amino-terminale contenente una regione di regolazione ligando-indipendente (activation function 1 domain, AF-1) che svolge un ruolo importante durante la fosforilazione del recettore
;
dominio C o DNA binding domain (DBD) adibito al legame con il gene bersaglio; regione “cerniera” centrale (hinge region o dominio D); dominio E o ligand binding domain, (LBD), sito di interazione con i ligandi naturali o sintetici; dominio F carbossi-terminale. All’interno di LBD, la 12° alfa-elica (H12) denominata anche “activation function 2 domain (AF-2)” ha un ruolo essenziale nella regolazione della trascrizione mediata da PPARgamma.A
B
N
AF-1
C
A/B
C
D
E/F
PPRE
Fig.3
Elemento di risposta a PPAR (PPRE)
L’eterodimero PPARγ-RXRα riconosce nel promotore del gene-bersaglio una sequenza nucleotidica specifica denominata “elemento di risposta a PPAR” (PPRE).
La sequenza nucleotidica (“consensus motif”) che costituisce i più comuni PPRE è caratterizzata da un esteso emisito in posizione 5’, da un nucleo centrale imperfetto ( la lettera N indica una base relativamente variabile), dal nucleotide adenina come elemento separatore e dal conservato esamero in posizione 3’. PPARγ, interagisce con l’emisito in posizione 5’ mentre RXRα prende contatto con l’emisito in posizione 3’.
5’-CAAAACT/AGGNCA/A/AGGTCA-3’
3’-GTTTTGA/TCCNGT/T/TCCAGT-5’
PPAR
RXR
Fig.4
Trasduzione del segnale GH-dipendente
Il GH si lega al suo recettore di membrana che dimerizza. La
dimerizzazione del recettore attiva specifiche proteine chinasi (JAK2s) che fosforilano i residui tirosinici intracellulari del recettore del GH. I residui tirosinici fungono da siti di legame per le proteine STAT. Le proteine STAT si attivano, dimerizzano e traslocano nel nucleo cellulare, regolando la trascrizione genica di IGF-I (Growth Hormone & IGF Research 2004 14:200-206).
IGF-I
nucleo
membrana cellulare
Fig.5
A)
Confronto tra un esemplare di topo wild-type C57Bl/6JxCBA (wt) e un esemplare di topo acromegalico (acro) di 12 settimane. I topi acro esprimono la sequenza codificante del gene del GH bovino sotto il controllo del promotore della metallotioneina (MTbGH). Il peso corporeo dei topi acro è circa 1,5-2 volte maggiore rispetto a quello dei topi wt.B)
Confronto tra organi prelevati da topi wt e acro. Il peso del fegato dei topi acro è circa 1,5-3 volte maggiore rispetto a quello dei topi wt per la presenza di iperplasia e ipertrofia cellulare.WT
ACRO
INTESTINO
FEGATO
CUORE
WT
ACRO
A
B
G H ( n g /m l)
A
G H ( n g /m l) G H ( n g /m l)B
C
Veicolo RosFig.6
Rosiglitazone (ros) riduce la secrezione di GH dalle GH3
Le cellule GH3 sono trattate come descritto in Materiali e metodi. Il GH è misurato mediante dosaggio radioimmunologico.
Gli estratti cellulari sono ottenuti come descritto in Materiali e metodi.
A)
Le GH3 sono esposte a ros 10µM fino a 72 ore. La concentrazione di GH nel mezzo di coltura si riduce da 8,3±1,4 a 1,9±0,7 ng/ml dopo 24h(p<0,04), da 16,5±3,7 a 3,6±0,9 ng/ml dopo 48h (p<0,03) e da 43,7±5,4 a 2,1±0,3 ng/ml dopo72h(p<0,0001)B)
Le GH3 sono esposte a ros 1-50µM per 24h.. Ros riduce la concentrazione di GH nel mezzo di coltura in maniera dose-dipendente (p<0,04)C) Negli estratti cellulari delle GH3 trattate con ros 10 µM per 72h la
concentrazione di GH si riduce da 233±13 a109±11 ng/ml (p<0,004).
Cig 1µµµµM Cig 10µµµµM Ros 10µµµµM Ros 1µµµµM
GH3
NIH3T3
G H (c op ie d i tr as cr it ti )x 10 6GH3 NT
Cig
Ros
Fig.7
L’espressione dell’mRNA di GH nelle GH3 è ridotta
dalla presenza di ciglitazone (cig) e rosiglitazone (ros)
Le GH3 sono esposte a cig (1-10µM) e ros 1-10µM per 24h. Il livello di espressione di mRNA di GH è valutato con RT-PCR, come riportato in Materiali e metodi.
Le copie dei trascritti di mRNA di GH si riducono da 5,7x106 a 3,0x106 e
1,8x106 nelle GH3 trattate con cig 1 µM e10µM, rispettivamente
(p<0,002). Risultati simili si ottengono anche con ros 1-10µM. L’RNA ottenuto dalle NIH3T3 è utilizzato come controllo negativo. I risultati rappresentano la media di 4 esperimenti condotti in triplicato.
pBLCAT2 pACOPPRE pSG5PPARγγγγ Cig 1µµµµM Ros 1µµµM µ
GH3 NT
Cig 1µ
µ
µ
µM 6h
Cig 1µ
µ
µ
µM 12h
A tt iv it à C A T ( %)A
B
Fig.8
Nelle GH3 PPARγγγγ è espresso e funzionalmente attivo
A)
La presenza di PPARγ è rivelata con la metodica dell’immunofluorescenza come riportato in Materiali e Metodi. PPARγ è espesso nelle GH3 non trattate e trasloca nel nucleo quando le cellule sono esposte a ciglitazone (cig) 1 µM. Ingrandimento immagini 60x. I colori verde, rosso e giallo indicano PPARγ, il nucleo cellulare e PPARγ dentro il nucleo, rispettivamente.B)
Il plasmide chimerico pACOPPRE contenente l’elemento di risposta a PPAR (PPRE) dell’enzima Acil-CoA Ossidasi, è trasfettato in maniera transitoria nelle GH3 e NIH3T3. Le cellule sono esposte a ciglitazone (cig) e rosiglitazone (ros) 1µM L’attività di CAT, è espressa come unità percentuale arbitraria, considerando 100% il valore ottenuto trasfettando il vettore pBLCAT2 privo di inserto, in assenza di ligando. Nelle NIH3T3 è cotrasfettato anche il plasmide pSG5PPARγ. I risultati rappresentano la media di 4 esperimenti condotti in triplicato.A tt iv it à C A T ( %) pSG5RXRαααα pSG5PPARγγγγ Cig 1µµµµM Cig 10µµµM µ
Fig.9
L’effetto inibitorio dei TZDs sulla trascrizione di hGHè mediato da PPARγγγγ e coinvolge il promotore del gene
Il plasmide chimerico phGH contenente la 5’flanking region (-397/+1) di hGH, è trasfettato nelle GH3 in presenza o assenza dei plasmidi di espressione pSG5PPARγ e pSG5RXRα. Il trattamento delle cellule trasfettate con ciglitazone (cig)
1-10µM diminuisce l’attività di CAT, del 50% (p<0,0005 vs GH3 non trattate). La cotrasfezione con PPARγ e RXRα riduce ulteriormente l’attività di CAT fino al 65% (p<0,0001 vs GH3 non trattate). L’attività di CAT è espressa come unità percentuale arbitraria, considerando 100% il valore in assenza di ligando.
32P sonda
lisato PPARγγγγ RXRαααα
Comp.spec. Comp. non spec.
Ab-PPARγγγγ Cig 10µµµM µ
Supershift Eterodimero
Fig.10
PPARγγγγ interagisce con il promotore di hGH
La 5’flanking region (-397/-144) di hGH è marcata con 32P e
utilizzata come sonda, in presenza o assenza di PPARγ e RXRα come descritto in Materiali e metodi. L’eterodimero PPARγ-RXRα forma uno specifico complesso con il promotore di hGH, indicato dalla freccia. La specificità di legame è confermata aggiungendo un PPRE competitivo che riduce il legame tra l’eterodimero e il promotore del GH. La diversa configurazione di binding dovuta alla presenza di un anticorpo anti-PPARγ (supershift) indica che PPARγ è presente nel complesso eterodimerico.
G+A
PPAR
RXR Lis
-330 bp
-276 bp
5’aggactggcctatcctgacatccttcgcccgcgtgcaggttggccaccatggcc 3’
3’tcctgaccggataggactgtaggaagcgggcgcacgtccaaccggtggtaccgg 5’
-330 bp -276 bpA
B
Fig.11
Il promotore del gene del GH contiene un putativo PPRE
A)
Dettaglio della autoradiografia del footprinting assay descritto in Materiali e Metodi. Il complesso PPARγ-RXRα si lega alla 5’ flanking region di hGH, impedendo la digestione della DNAsi, in corrispondenza della sequenzanucleotidica di 54 bp tra la posizione
-330 e -276 del promotore di hGH, indicando la presenza di un putativo PPRE Lis: lisato privo di recettori sintetizzati in vitro. G+A: sonda marcata e digerita secondo il metodo di Maxam e Gilbert e usata come marker.
B)
Sequenza nucleotidica individuata con il footprinting assay. Il PPRE putativo è sottolineato in rosso.0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
Cig 10µ
µ
µ
µM
Ros 10µ
µ
µ
µM
GH 50nM
+
-
-
- -
+ +
-
-
-
-
-
-
+
+
+
n
g/
m
l
IGF-I
-
+
Fig.12
I TZDs riducono la secrezione di IGF-I dalle HepG2
Le HepG2 sono trattate con ciglitazone (cig) e rosiglitazone (ros) 1-10µM, in presenza o assenza di GH 50nM, come descritto in Materiali e metodi. Il livello di IGF-I nel mezzo di coltura è misurato mediante dosaggio radioimmunologico. La secrezione GH-dipendente di IGF-I dalle HepG2 si riduce da 2,89±0,2 ng/ml a 1,87±0,08 (p<0,0012 vs HepG2 trattate con GH) e 1,75±0,15 ng/ml (p<0,0014 vs HepG2 trattate con GH), in presenza di cig e ros 10 µM, rispettivamente. La riduzione della secrezione di IGF-I indipendente dal GH non è significativa. I risultati rappresentano la media di 5 esperimenti condotti in duplicato.
18 S
IGF-1
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cig 10µ
µ
µ
µM
GH 50nM
-
-
+
-
+
-
+
+
Fig.13
Nelle HepG2, l’aumento di espressione dell’ mRNA di
IGF-I, GH-dipendente, è inibito dalla presenza dei TZDs
Le HepG2 sono trattate con ciglitazone (cig) 10µM, in presenza o assenza di GH 50nM, come descritto in Materiali emetodi.
Il livello di espressione dell’mRNA di IGF-I è valutato con Northern Blot come descritto in Materiali e metodi. La presenza di ciglitazone (cig) 10µM nel mezzo di coltura inibisce in modo significativo l’aumento di espressione dell’ mRNA di IGF-I, osservato dopo stimolazione con GH, mentre è
inefficace sulla trascrizione di IGF-I GH-indipendente. Il cDNA della subunità 18s ribosomiale è utilizzato per normalizzare i risultati.
2 4 6 8 10 12 14 16 IG F -1 (c op ie d i tr as cr it ti (x 10 5)
-
-
+
-
+
+
-
+
+
-
-
-
+
-
-
-
+
- -
- + -
-
-
HepG2
NIH3T3
GH 50nM
Ros 1µ
µ
µ
µM
Ros 10µ
µ
µM
µ
IGF-I
Fig.14
Nelle HepG2, l’aumento di espressione dell’ mRNA di
IGF-I, GH-dipendente, è inibito dalla presenza dei TZDs
Le HepG2 sono trattate con rosiglitazone (ros) 1-10µM, in presenza o assenza di GH 50nM, come descritto in Materiali e metodi..Il livello di espressione dell’mRNA di IGF-I nelle HepG2 è valutato con RT-PCR come descritto in Materiali e Metodi. Le copie dei trascritti di mRNA di IGF-I si riducono da 12,4x105 a 7,4x105 (p<0,0005 vs HepG2 trattate con GH) e 5,7x105 (p<0,0004
vs HepG2 trattate con GH) nelle HepG2 trattate con ros 1µM e 10µM,
rispettivamente, solo dopo che le cellule sono stimolate con GH. L’mRNA delle NIH3T3 è utilizzato come controllo negativo dal momento che queste cellule non esprimono IGF-I.
+
HepG2 NT
-
-
-
-
-
+
GH 50 nM
+
+
-
-
-
cig 10µ
µ
µM
µ
+
-
-
+
-
-
cig 1µ
µ
µ
µM
-
+
-
-
+
-
IGF-I
HepG2 NT
GH 50 nM
ros 10µ
µ
µ
µM
GH 50 nM
ros 10µ
µ
µ
µM
IGF-I
A
B
Fig.15
La sintesi proteica di IGF-I , osservata dopo stimolo con GH è
ridotta dalla presenza di ciglitazone (cig) e rosiglitazone (ros)
La sintesi proteica di IGF-1 è valutata con Western blot e immunofluorescenza come riportato in materiali e metodi.
A)
Il livello di IGF-I nelle HepG2 trattate con cig 1-10µM non varia rispetto alla condizione basale delle cellule non trattate (HepG2 NT). Al contrario, l’espressione proteica di IGF-I è ridotta dalla presenza di cig 1-10 µM quando le HepG2 sono esposte contemporaneamente a GH 50 nM.B)
Il livello di IGF-I nelle HepG2 trattate con ros 10µM non varia rispetto alla condizione basale delle cellule nonRos 10µ
µ
µ
µM +GW 10µ
µ
µ
µM
HepG2 NT
Ros 10µ
µ
µ
µM
PPARγγγγ
Nucleo
Fig 16
Nelle HepG2 PPARγγγγ è espresso e funzionalmente attivo
Le HepG2 sono trattate in presenza o in assenza di rosiglitazone (ros) 10µM per 20 ore. PPARγ è rivelato con la metodica dell’immunofluorescenza come riportato in Materiali e metodi. PPARγ, in condizioni basali (HepG2 NT), è localizzato quasi esclusivamente nel citoplasma. Quando le HepG2 sono esposte a ros 10µM , l’espressione di PPARγ aumenta e si accresce anche la sua presenza nel nucleo cellulare. L’attivazione e la traslocazione nucleare di PPARγ sono bloccate dal suo specifico antagonista sintetico GW9662 (GW). Il colore rosso rappresenta PPARγ. Il nucleo cellulare è colorato con il colorante blu 4,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
HMG1
Cig 1µ
µ
µM
µ
Cig 10µ
µ
µ
µM
Ros 1µ
µ
µ
µM
Ros 10µ
µ
µM
µ
+
+ +
+ +
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
R
L
U
(x10
3)
Fig.17
Nelle HepG2 PPARγγγγ è funzionalmente attivo
Il plasmide chimerico pHMG1, contenente l’elemento di risposta a PPAR( PPRE) dell’enzima 3-idrossi-3-metil-glutaril-CoA sintasi di ratto (HMG), costruito come riportato in Materiali e metodi, è trasfettato in maniera transitoria nelle HepG2. Esponendo le cellule trasfettate a rosiglitazone (ros) 1-10 µM.l’attività di LUC, aumenta da 6±0,17 a 11,3±0,91(p<0,0006 vs HepG2 non trattate) e 15,8±1,51 (p<0,0004 vs HepG2 non trattate), indicando che nelle HepG2 PPARγ è funzionalmente attivo. Simili risultati sono ottenuti incubando le HepG2 con ciglitazone (cig) 1-10 µM. L’attività di LUC è espressa come unità di luce relativa (RLU)
HepG2 NT
GH
GH+ros
GH+ros
GW
IGF-I
PPARγγγγ
Nucleo
Fig.18
L’effetto inibitorio dei TZDs sull’espressione
di IGF1, dopo stimolo con GH, è PPARγγγγ-dipendente
Le HepG2 sono esposte a GH 50nM in presenza o assenza di rosiglitazone (ros) 10µM e GW9662 (GW), come descritto in Materiali e metodi. L’espressione di IGF-I e PPARγ è valutata con la metodica della doppia immunofluorescenza come riportato in Materiali e metodi..Dopo stimolo con GH, ros 10µM riduce l’espressione di IGF-1 attivando PPARγ. La presenza di GW 9662 blocca l’effetto inibitorio di ros mediato da PPARγ e di
conseguenza l’espressione di IGF-I si intensifica. I colori verde e rosso rappresentano IGF-I e PPARγ, rispettivamente. Il nucleo cellulare è colorato con blu 4,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).
20 40 60 80 100 120 140 PPARγγγγ1 RXRαααα Ros 10µµµµM
-
-
-
-
+
+
+
-
-
-
-
-
-
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
+
+
+
-
+
+
+
- -
-
-
+
PPARγγγγ2u
n
it
à
ar
b
it
rar
ie
(
%)
Fig.19
L’effetto inibitorio dei TZDs, mediato da PPARγγγγ
non coinvolge la 5’ flanking region del gene di IGF-1
Il plasmide chimerico phIGF-I, contenente la 5’-flanking region (-1621/+415) di hIGF-I, costruito come riportato in Materiali e Metodi, è trasfettato nelle HepG2 in presenza o assenza dei plasmidi di espressione pCMVXL4PPARγ1, pSG5PPARγ2 e pSG5RXRα. Il trattamento delle cellule trasfettate con rosiglitazone (ros) 10µM non riduce in modo significativo l’attività di LUC, La cotrasfezione con pCMVXL4PPARγ1, pSG5PPARγ2 e pSG5RXRα non produce variazioni significative dell’attività di LUC. L’attività di LUC è espressa in unità percentuali arbitrarie considerando come 100% il
HepG2 NT
GH
GH+ros
GH+ros
GW
IGF-I
Nucleo
STAT5b
Fig.20
L’effetto inibitorio dei TZDs sull’espressione
GH-dipendente di IGF1, coinvolge STAT5b
Le HepG2 sono esposte a GH 50nM in presenza o assenza di
rosiglitazone (ros) 10µM e dell’antagonista specifico di PPARγ GW9662 (GW), come descritto in Materiali e metodi. L’espressione di IGF-I e STAT5b è valutata con la metodica della doppia immunofluorescenza come riportato in materiali e metodi. Dopo stimolo con GH, ros 10µM riduce l’espressione di IGF-1 e di STAT5b . La presenza di GW 9662 blocca l’effetto inibitorio di ros e di conseguenza l’espressione di IGF-I e di STAT5b si intensifica.
HepG2 NT
Ros 1µ
µ
µ
µM
Ros 10µ
µ
µ
µM
GH 50nM
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
STAT5b
Fig.21
L’ aumento di espressione GH-dipendente di STAT5b
è inibito dalla presenza di rosiglitazone
Le HepG2 sono esposte a rosiglitazone (ros) 1-10µM in presenza o assenza di GH 50nM, come descritto in Materiali e metodi. L’espressione di STAT5b è valutata con la metodica del western blot come riportato in Materiali e metodi. La presenza di ros 1µM inibisce l’aumento di espressione GH-dipendente di STAT5b.
0 5 10 15 20 25 30 35
A
WT
ACRO
Peso (g)
WT
ACRO
IGF-I
ng/ml
100 200 300 400 500 600 700Fig.22
I topi wild-type C57Bl/6JxCBA (wt) e i topi transgenici acromegalici che esprimono la sequenza codificante del gene del GH bovino sotto il controllo del promotore della metallotioneina (acro) sono trattati come descritto in materiali e metodi.A)
Il peso corporeo medio dei topi acro è maggiore rispetto a quello degli animali wt nelle condizioni sperimentali iniziali (31,75±0,50 g vs 23,50±1,00 g p<0,0001)B)
La concentrazione media iniziale di IGF-I è significativamente più alta nei topi acro rispetto a quella dei topi wt ( 549,33± 23,46 ng/ml vs 438,29± 48,21 ng/ml p=0,0061) La concentrazione di IGF-I nel siero murino è misurata con un kit commerciale, mediante dosaggio radioimmunologico.WT
ACRO
0 10 20 30 40 50Peso (g)
Peso (g)
WT
ACRO
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5Fig.23
I topi wild-type C57Bl/6JxCBA (wt) e i topi transgenici acromegalici che esprimono la sequenza codificante del gene del GH bovino sotto il controllo del promotore della metallotioneina (acro) sono trattati come descritto in materiali e metodi.A
) Il peso corporeo medio dei topi acro è maggiore rispetto a quello degli animali wt nelle condizioni sperimentali finali (36±2,16 g vs 26±1,83 g p=0,0004).B)
Alla fine del trattamento, il peso medio del fegato dei topi acro è maggiore rispetto a quello dei topi wt (2,80±0,21 g vs 1,72±0,42 g p=0,0039).A
IGF-I ng/ml 100 200 300 400 500 600
WT
T30 T0 0 100 200 300 400 500WT ROS
T0 T30 IGF-I ng/ml T0 T30 IGF-I ng/ml 100 200 300 400 500 600 700ACRO
100 200 300 400 500 600ACRO ROS
T0 T30 IGF-I ng/mlFig.24
I topi wt (n=5) e acro (n=5) sono trattati con dieta standard; i topi wt-ros (n=5) e acro-ros (n=5) sono trattati per 30 giorni con dieta standard contenente rosiglitazone (12 mg/Kg dieta) come descritto in materiali e metodi. La concentrazione di IGF-I nel siero murino è misurata con un kit commerciale, mediante dosaggio radioimmunologico, come descritto in materiali e metodi.T0: inizio trattamento; T30: fine trattamento.
A)
La concentrazione media finale di IGF-I nel siero dei topi wt non varia in maniera significativa rispetto a quella iniziale (T30=467,7± 41,25 ng/ml vs T0=476,81±3,74ng/ml p=NS)B)
La concentrazione media finale di IGF-I nel siero dei topi wt-ros non varia in maniera significativa rispetto a quella iniziale(T30= 425,07±26,49 ng/ml vs T0=399,77±32,00 ng/ml p=NS)C) La concentrazione media finale di IGF-I nel siero dei topi acro non varia in maniera significativa rispetto a quella iniziale (T30=551,44±88,05 ng/ml vs T0=559,42 ±34,41 ng/ml p=NS)
D)La concentrazione media finale di IGF-I nel siero dei topi acro-ros non varia in maniera significativa rispetto a quella iniziale (T30=495,30±15,54 ng/ml vs T0= 539,24±7,23 ng/ml p=NS)
A
B
D
C
0 100 200 300 400 500 600 700
T0
T20
IGF-I
ng/ml
0 100 200 300 400 500 600 700IGF-I
ng/ml
T0
T20
A
B
Fig.25
Ratti Wistar-Furth (n=10) sono inoculati sottocute con 2 x 106 cellule GHsecernenti GH3. Dopo lo sviluppo tumorale ( 2 settimane) gli animali sono trattati per 20 giorni con ros 120 mg/Kg die (n=5) o 40mg/Kg die (n=5). La
concentrazione di IGF-I nel siero è misurata con un kit commerciale, mediante dosaggio radioimmunologico, come descritto in materiali e metodi.
T0: inizio trattamento; T20: fine trattamento.
A) La concentrazione media finale di IGF-I nel siero dei ratti Wistar-Furth (n=5)
dopo trattamento con ros 120mg/Kg die si riduce in maniera significativa rispetto a quella iniziale (T20=387,8±50,4 ng/ml vs T0=547,2±28,9 ng/ml p=0,0002).
B) La concentrazione media finale di IGF-I nel siero dei ratti Wistar-Furth (n=5)