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16 2.1 Reagenti
Sodio fosfato dibasico, solfato d'ammonio, cloruro di sodio, nitrato d'argento, acido citrico (J.T. Baker);
Biorad protein assay solution, acrilammide, N,N'-metilenbisacrilammide, TEMED, ammonio persolfato, SDS, standard proteici per SDS-page (BioRAD Laboratories);
D- eritrosio, D-galattosio, D-xilosio (Sigma Aldrich);
D-glucosio, glicerolo, Tris (BDH);
D-ribosio (Carlo Erba)
L-idoso, L-treoso, L-glucosio (Carbosynth);
Sephadex G-75 (GE Healthcare);
Inibitori di proteasi (ICN);
EDTA (Juoro);
Matrex Orange A (Millipore Amicon);
NADP+, NADPH, D,L-gliceraldeide, DTT, metanolo, albumina di siero bovino (BSA) AgNO3, acido citrico, metanolo, formaldeide (Sigma Aldrich);
dietilamminoetil cellulosa DE-52 (Whatman);
4-nitrobenzaldeide (Sigma Aldrich);
17 2.2 Strumentazione
Centrifuga (Beckman modello J2-21);
spettrofotometro (Biochrom Libra S32 PC)
apparato elettroforetico (Biorad);
pHmetro con elettrodo a vetro (Denver Instrument Company);
cellette da dialisi e membrane per ultrafiltrazione (Millipore Amicon);
18 2.3 Determinazione dell’attività aldoso reduttasica
La reazione viene seguita per via spettrofotometrica a 37°C alla lunghezza d'onda di 340 nm, seguendo la reazione di ossidazione del cofattore NADPH in presenza del substrato aldeidico.
I saggi enzimatici vengono eseguiti in un volume finale di 0,7 mL in tampone sodio-fosfato 0,25 M, pH 6.8 contenente: EDTA 0,47 mM, solfato d’ammonio 0,38 M, NADPH 0,18 mM e un’opportuna quantità di enzima. La reazione viene avviata per aggiunta del substrato; le condizioni standard di saggio sono ottenute utilizzando come substrato la D,L.gliceraldeide (GAL) 4,0mM. Le medesime condizioni di saggio sono state utilizzate anche per le prove in cui sono stati utilizzati differenti substrati alle concentrazioni indicate nella sezione dei Risultati.Per ogni saggio eseguito si sottrae al valore della variazione di assorbanza al minuto ottenuta il corrispondente in assenza del substrato.
Un’unità enzimatica è definita come la quantità di enzima che catalizza la conversione di 1 micromole di substrato in un minuto nelle condizioni di saggio standard.
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2.4 Determinazione della concentrazione delle proteine
La concentrazione proteica nei vari campioni è stata misurata utilizzato il metodo di Bradford (Bradford MM, 1976).Il saggio viene effettuato in duplicato prendendo quantità diverse di campione proteico, aggiungendo 200µL di colorante e quindi portando a 1mL con acqua milliQ. Dopo 15 minuti dall'aggiunta del colorante si misura l'assorbanza a 595 nm e la concentrazione proteica viene determinata sulla base di una retta di taratura riportata in Fig .3, costruita utilizzando concentrazioni note di albumina di siero bovino.
20 2.5 Elettroforesi
La purezza dell'enzima ottenuto nel corso della purificazione è stata valutata con un'elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di SDS (SDS-PAGE).
Composizione dei gel:
Separating gel: Acrilammide/bis-acrilammide 30%: 4ml Tris HCl 1.5M pH8.8: 2.5ml SDS 10%: 0.1ml Ammonio persolfato (40mg/100µl): 0.005ml N,N,N,N-tetrametiletilendiammina (TEMED): 0.005ml H2O milliQ: 3.35ml Stacking gel: Acrilammide/bis- acrilammide 30%: 1 ml Tris HCl 1.5M pH6.8: 2ml SDS 10%: 0.08ml Ammonio persolfato (40mg/100µl): 0.004ml N,N,N,N-tetrametiletilendiammina (TEMED): 0.008ml H2O milliQ: 5 ml acrilammide N,N'-metilen-bis-acrilammide
21 sodio dedecilsolfato TEMED
β-mercaptoetanolo
Prima di caricare i pozzetti ricavati nello stacking gel i campioni vengono trattati con una soluzione (sample buffer) così composta: 9,5 mldi H2O milliQ; 50 ml Glicerolo; 23 ml SDS 10%; 12,5 ml Tris fosfato 0,5 M pH 6,8; 5 ml Blu di bromofenolo 1%; ad essa si aggiunge β-mercaptoetanolo 1:20 appena prima dell'uso.
Come tampone di connessione viene utilizzato un tampone così composto: 30 g/L Tris, 144 g/L glicina, 10g/L SDS, previa diluizione 1:10 in H2O milliQ. La corsa elettroforetica viene effettuata ad una intensità di corrente costante di 20 mA per gel. Quando il fronte del colorante blu di bromofenolo raggiunge il fondo del gel, si interrompe l'alimentazione e i gel vengono colorati con il metodo del Silver Staining (Wray et al.1981). Il gel viene fissato con metanolo al 50% per 1 h e quindi lavato più volte in H2O milliQ. Si prepara quindi una soluzione costituita da 0.8g di AgNO3 in 4 mL di H2O che viene aggiunta goggia a goccia ad una soluzione la soluzione composta da 21 ml di NaOH allo 0,36% e 1 ml NH3 al 30%. La soluzione risultante viene portata poi ad un volume finale di 100 ml con H2O milliQ, ed in essa i gel vengono posti per 15 minuti in agitazione e poi lavati con H2O milliQ.
Successivamente i gel vengono immersi nella soluzione di sviluppo, composta da 1,25 ml di acido citrico all'1% e 125 μl di formaldeide al 38%, portati ad un volume totale di 250 ml con H2O milliQ, agitando fino allo sviluppo delle bande. La colorazione viene bloccata immergendo i gel in metanolo al 50%. I risultati dell’elettroforesi in SDS page sono visibili in Fig.7.
22 2.6 Purificazione dell'ALR2 ricombinante umana
Tutti i passaggi sono stati condotti a 4°C. I valori di attività enzimatica e di concentrazione proteica dei singoli passaggi sono riportati in tabella 1.
VOLUME U/ml mg/ml U/m g mg tot Utot Fattore di purificazione Resa % Eg 15 3.72 14.8 0.25 222 56 1 100 De52 40 1.94 0.74 2.61 29.6 77.5 10.44 138 Matrex picco 1 9 5.8 0.97 5.97 8.75 65 23.88 84 G75 picco 1 38 1.43 0.29 4.93 11 55 19.72 71
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2.6.1 Preparazione dell’estratto grezzo
L'ALR2 ricombinante di placenta umana viene sovraespressa utilizzando cellule di EColi BL21 precedentemente trasformate con un vettore di espressione contenente la sequenza codificante l'ALR2.
Le cellule di E.Coli sono state inoculate in terreno LB/canamicina e quindi trasferite in un litro di terreno e cresciute a 37° C.
Quando la densità ottica del terreno di coltura misurata a 600nm ha raggiunto un valore di 0,8 l'espressione della proteina è stata indotta con l'aggiunta di IPTG ad una concentrazione finale di 0,4 mM e mantenute overnight a 37° C.
Il terreno di coltura raccolto e stato sottoposto a centrifugazione a 2000 xg a 4° C per 30 minuti. Il precipitato e stato risospeso in 60 ml di tampone standard contenente DTT 2 mM, EDTA 0,5 mM, NADP+ 15 μM ed inibitori di proteasi. Meta della sospensione e stata congelata a -80° C e la restante aliquota e stata sottoposta a sonicazione (5 pulse da 3 minuti alternati a pause di 2 minuti). La sospensione e stata centrifugata a 12000 xg a 4° C per 30 minuti. Il sovranatante rappresenta l'estratto grezzo contenente la proteina ricombinante.
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2.6.2 Cromatografia a scambio ionico
L'estratto grezzo è stato caricato su una colonna contenente una resina a scambio ionico DE-52 (30x3,5cm), precedentemente equilibrata con tampone sodio fosfato 10 mM pH 7 (tampone standard) contenente DTT 2mM ad un flusso di 15ml/h; sono state raccolte frazioni di 4ml sulle quali viene misurata l'assorbanza a 280nm e l'attività enzimatica. Il profilo di eluizione è riportato in Fig. 4.
L'eluizione dell’aldoso reduttasi viene ottenuta applicando un gradiente NaCl 0-120 mM. L'enzima viene eluito ad una concentrazione di NaCl di 70mM.
Le frazioni attive sono state raccolte in un pool, che è stato poi dializzato contro tampone standard al fine di ridurre la concentrazione di NaCl e DTT di circa 30 volte e concentrato fino ad un volume di 40 mL utilizzando una membrana da ultrafiltrazione YM5.
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Figura 4. Grafico eluizione DE-52. In corrispondenza della frazione 78 è stato applicato un gradiente di cloruro di sodio 0-120 mM.
-0,05 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 0 50 100 150 200 dA /m in ab s 2 8 0 n m frazione abs 280 dA/min
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2.6.3 Cromatografia per affinità
Il pool ottenuto dalla cromatografia a scambio ionico è stato caricato su una colonna contenente una resina d'affinità Orange Matrex A (15x2cm). La colonna è stata equilibrata con tampone standard e l'eluizione è stata condotta a 15ml/h, raccogliendo frazioni di 4ml raccolti per ogni frazione. Il profilo di eluizione è riportato in Fig. 5. Una volta che il campione è stato completamente assorbito dalla resina, effettua viene proseguita l’ eluzione con tampone standard fino a che tutte le proteine non interagenti con la colonna sono state eluite. L’aldoso reduttasi viene quindi eluita applicando alla colonna una soluzione di NADPH 0.1mM in tampone standard. Le frazioni attive sono raccolte in un unico pool e concentrate mediante ultrafiltrazione su membrana YM5 fino a 10 mL.
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Figura 5. Grafico di eluizione della cromatografia per affinità su Orange Matrex. In corrispondenza della frazione 128 è stato aggiunto alla colonna tampone contenente NADPH 0,1mM.
-0,05 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 dA /m in ab s 2 8 0 n m frazione abs 280nm dA/min
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2.6.4 Cromatografia ad esclusione molecolare
Il campione ottenuto dal precedente passaggio cromatografico è stato sottoposto a cromatografia ad esclusione molecolare impiegando una colonna di Sephadex G75 (80x2,6cm). La colonna è stata equilibrata in tampone standard contenente DTT 2mM e l'eluizione è stata eseguita a 15ml/h, raccogliendo frazioni di 4ml. Il profilo di eluizione è riportato in Fig. 6. Le frazioni attive sono state raccolte in un pool, che è stato addizionato di glicerolo al 33 % (p/v) e quindi conservato a -80°. Prima di ogni esperimento l’enzima viene estensivamente dializzato contro tampone standard utilizzando una membrana da ultrafiltrazione Amicon YM5.
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Figura 6. Grafico di eluizione della gel filtrazione su Sephadex G75.
-0,02 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 dA /m in ab s 2 8 0 n m frazione abs 280nm dA/min
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2.7 Preparazione e determinazione della concentrazione di HNE
Il 4-idrossi-2,3 trans-nonenale (HNE) è stato sintetizzato come dimetilacetale come descritto (Moschini et al. Free Rad Biol Med 2015) e conservato a -80°C in esano. Prima dell'uso l'HNE viene essiccato sotto flusso d’azoto; l’aldeide viene generata per aggiunta di HCl 1 mM. La sua concentrazione viene determinata per via spettrofotometrica, misurando l’assorbanza a 224 nm (coefficiente di estinzione a 224nm Ɛ=13.75 mM-1cm-1).
Figura 7.SDS-PAGE dell'estratto grezzo e dei pool ottenuti nella cromatografia a scambio ionico e nella cromatografia d'affinità.Corsia 1: Standard di peso molecolare; Corsia 2: Estratto Grezzo; Corsia 3: DE52; Corsia 4 : Matrex Orange picco 2; Corsia 5: Matrex Orange picco escluso.
