2. MATERIALI E METODI
2.1 Materiale biologico
Specie test
Per l’esecuzione del saggio sono stati utilizzati gameti ed embrioni del riccio di mare Paracentrotus
lividus (Lamark). Le gonadi sono 5, occupano le aree interambulacrali e sboccano nelle placche
genitali. I gameti sono rilasciati all’esterno tramite gonopori, che sono 5, uno per ciascuna gonade. Queste sono di colore rosso-arancione e vengono utilizzate per fini alimentari in più paesi mediterranei, Francia e Sud Italia in particolare. Le uova prodotte sono scarsamente pigmentate e molto trasparenti, caratteristiche che le rendono particolarmente adatte per un saggio sullo sviluppo, visto la chiarezza con cui si possono osservare gli eventi di sviluppo. Una volta che uno spermatozoo penetra nell’uovo si ha la fusione dei nuclei maschili e femminili e a partire da questo momento è possibile osservare l’innalzamento della membrana di fecondazione, evento che risulta ben visibile. Durante gli ultimi stadi della gastrulazione l’embrione assume una simmetria bilaterale ed in seguito diventa una larva planctonica definita echinopluteo. Le indagini sullo sviluppo sono state condotte prendendo in considerazione lo stadio di pluteo a 4 braccia, il quale viene raggiunto entro 72 ore dalla fecondazione a 18°C±1.
Prelievo e mantenimento degli organismi
Esemplari adulti di P. lividus sono stati raccolti tramite immersioni subacquee in apnea sui fondali rocciosi di Quercianella (LI), in zone lontane da fonti di disturbo causate da attività antropiche. Quest’aspetto risulta particolarmente importante, in quanto la qualità dell’acqua dove si trovano gli adulti può influenzare la qualità dei gameti e il successo riproduttivo (Fenaux et al., 1988). Immediatamente dopo la cattura gli animali sono stati disposti in contenitori di polistirolo contenenti carta bibula bagnata con acqua di mare raccolta nello stesso sito, al fine di minimizzare lo stress dovuto al trasporto in laboratorio. Per evitare l’emissione di gameti durante il viaggio non sono stati utilizzati sistemi di areazione e di refrigerazione, secondo le indicazioni di Volpi Ghirardini e Arizzi Novelli (2001); Flaugi e Angelini (2002).
In laboratorio gli esemplari raccolti sono stati mantenuti in camera termostatata in acquari refrigerati (18°C±1), dotati di sistema d’areazione, di filtraggio e riempiti con acqua di mare proveniente dallo stesso sito di raccolta. Durante il periodo di acclimatamento, durato almeno una
settimana, sono stati monitorati salinità (34‰ -38‰) e pH (7,8 - 8,2), mentre l’intensità luminosa è stata mantenuta a 42-46 Lux.
2.2 Materiale impiegato in laboratorio
Per la preparazione della soluzione della sostanza tossica di riferimento è stata utilizzata acqua bidistillata. Per la raccolta e diluizione dei gameti, i controlli negativi e positivi è stata invece utilizzata acqua di mare prelevata in un’area costiera (Quercianella), lontano da potenziali fonti di contaminazione. Prima del suo utilizzo l’acqua è stata filtrata con filtro di 50 μm.
Per l’esecuzione sono stati utilizzati alcuni reagenti puri per analisi, in particolare una soluzione di KCl 0,5 M, una soluzione standard (1000 mg/L) di rame in acido nitrico 0,5 M/L come tossico di riferimento, e una soluzione di Lugol per fissare i campioni prima della lettura.
In aggiunta alle usuali apparecchiature da laboratorio sono state inoltre utilizzate: Piastre sterili per la coltura in polistirene a sei pozzetti con coperchio Microscopio ottico per controllo e conta dei gameti e degli embrioni Siringhe da 1 ml
Eppendorf per la raccolta e dello sperma
Conta-cellule per la conta delle uova e degli embrioni
Emocitometro per il conteggio dello sperma (Camera di Toma) Vetrini a orologio per il controllo e la conta delle uova
Urine da 200 ml Acquari termostatati
Sonda multiparametrica (termometro, pHmetro, rifrattometro, ossimetro) Micropipette automatiche e manuali graduate da 100 e 1000 μL
Beakers di vetro borosilicato da 50 e 1000 ml per la raccolta delle uova
Filtro da 50 μm e 200 μm per filtrare rispettivamente l’acqua di mare e le uova Cilindri graduati da 10 ml
Parafilm
Pipette Pasteur in vetro da 7x230 mm
Contenitori in polistirolo per il trasporto degli organismi Bagni termostatati rispettivamente a 13 e 24°C.
2.3 Materiale impiegato in situ
Parte del materiale utilizzato in campo è il medesimo di quello dedicato ai saggi di laboratorio. Tra questo rientrano i Beakers da 1000 ml chiusi con parafilm per il trasporto delle uova in campo e le Eppendorf per lo sperma. E’ stata inoltre utilizzata una micropipetta da 100 μL dotata di puntale per liquidi viscosi per unire lo sperma alle uova al momento della fecondazione. Il tutto è stato caricato e bloccato in contenitori di polistirolo.
Per consentire l’esposizione in situ nella colonna d’acqua degli embrioni di P.lividus è stata appositamente costruita una “sonda biologica” (Fig. 1). Questa è costituita da un supporto rigido sul quale sono inserite tre camere d’esposizione contenenti gli embrioni. Non è stato impiegato nessun tipo di materiale metallico, al fine di evitare l’ossidazione dovuta all’esposizione prolungata all’acqua di mare.
In particolare il supporto, realizzato in PVC, è stato dotato di appositi fori, al fine di fissarvi saldamente le camere utilizzando con fascette in materiale plastico. Ogni singola camera è di forma cilindrica e del volume di 50 ml (Fig. 1A). In corrispondenza dell’estremità superiore è dotata di un’apertura, realizzata forando il tappo a vite, e alla quale è applicata una rete con maglia di 55 μm E’ così possibile esporre alla matrice ambientale il contenuto della camera senza però provocare la fuoriuscita degli embrioni, visto che il diametro delle uova non fecondate è compreso tra gli 80 e i 90 μm. Al centro della sonda è applicata un’asola di filo di nylon da 1 mm di diametro, a cui legare la sagola per fissare le camere in mare. Al centro del supporto è stato inoltre fissato un secondo filo di nylon di 40 cm di lunghezza e collegato all’estremità opposta ad un peso di 300 gr. Sia nell’asola che alle due estremità del filo che porta il piombo, il nylon è stato serrato con impiombature in acciaio. La sonda così realizzata è stata fissata alla riva utilizzando una sagola, legata ad un estremo a una struttura emersa (bitta o anello a seconda del sito) e dall’altra all’asola di nylon della sonda biologica. Quest’ultima è stata mantenuta a un metro di profondità, grazie al peso da 300 g che le conferiva un assetto negativo e alla sagola dalla lunghezza appositamente regolata che la collega alla costa mantenendola sollevata dal fondale (Fig. 1B). Nei siti dove per la morfologia della costa non è risultato possibile fissare a una struttura fissa la sonda questa è stata modificata. In particolare è stato eliminato il piombo sostituendolo con una seconda asola in nylon. A una delle due asole è stata collegata una sagola vincolata a un galleggiante, mentre all’asola rivolta verso il basso è stata fissata un secondo spezzone di sagola collegata ad un corpo morto in cemento appositamente predisposto sul fondale. In questo modo le camere sono state mantenute a un metro di profondità e allo stesso tempo bloccate dal corpo morto e dalla tensione della sagola dovuta al galleggiante. La messa in campo è stata compiuta tramite immersioni subacquee e il galleggiante predisposto sotto la
superficie, in modo da non risultare visibile, riducendo la probabilità di possibili furti o danneggiamenti del materiale. Il ritrovamento del materiale è avvenuto prendendo tre allineamenti a terra al fine di ritrovare il punto in mare.
2.4 Prove in laboratorio
2.4.1 Saggio di laboratorio
Metodologia di esecuzione del test
La metodologia per quanto riguarda il saggio di laboratorio è stata sviluppata in accordo con le procedure standard descritte in ASTM (2004), ICES (1997), USEPA (1994, 1995, 2000) e dati di letteratura: Arizzi Novelli (2002), Volpi Ghirardini et al. (2005), Lera et al. (2006).
Il saggio di embriotossicità consiste nell’esporre una soluzione di uova fecondate a una matrice acquosa al fine di determinare una diminuzione nella percentuale di plutei normoformati a 4 braccia dopo un tempo di 48/72 ore a 18°C±1.
Recupero dei gameti
L’emissione dei gameti è stata provocata tramite l’iniezione di 1 ml di KCl attraverso la membrana peristomale e il successivo scuotimento meccanico dell’animale per alcuni secondi. Tale trattamento stimola ulteriormente l’emissione e aiuta a distribuire omogeneamente il KCl sulle
B 1 m aria acqua sagola piombo Sonda biologica Tappo a vite Rete (55 µm) Camera (50 ml) A B 1 m aria acqua sagola piombo Sonda biologica Tappo a vite Rete (55 µm) Camera (50 ml) A
gonadi. Sono stati individuati almeno 3 maschi e 3 femmine, i cui gameti sono stati raccolti separatamente. In particolare le uova sono state recuperate utilizzando dei beaker da 50 ml riempiti d’acqua di mare filtrata e ponendo ciascuna femmina al di sopra del beaker, con il poro genitale rivolto verso l’acqua. In seguito le uova sono state selezionate per la loro qualità, tramite controlli al microscopio, scartando le uova vacuolate, irregolari o troppo piccole. La selezione viene facilitata eseguendo 3 lavaggi, per poi porre le uova all’interno di beaker da 1 l con acqua di mare filtrata. Per quanto riguarda la raccolta dello sperma questa è stata effettuata “a secco”, vale a dire nelle stesse condizioni in cui usciva dal poro genitale (evitando l’utilizzo di alcuna soluzione acquosa), tramite una pipetta Pasteur, e conservato in una eppendorf.
Rapporto sperma/uovo
Vengono prelevati 100 μl della soluzione di uova per essere contate su di un vetrino ad orologio, fino ad ottenere una soluzione con 1000 uova/ml. La concentrazione dello sperma raccolto viene determinata raccogliendo con una micropipetta con puntale per liquidi viscosi 25 μl di sperma e ponendoli in un cilindro graduato contenente 25 ml di acqua dolce. Si ottiene così una soluzione con fattore di diluizione (FD) uguale a 100. Da tale soluzione, dopo essere stata agitata ed aver atteso qualche minuto, sono state prelevate alcune gocce e poste sul vetrino superiore di una camera di Thoma, affinché la soluzione spermatica diffonda all’interno per capillarità. Dopo aver atteso circa 10 minuti che gli spermatozoi sedimentassero è stato effettuato il conteggio mediante microscopio ottico (40 x). In base a tale conteggio viene determinato il fattore di diluizione dello sperma e il conseguente volume da aggiungere alla soluzione di uova per raggiungere una concentrazione sperma/uova di 20.000:1
Esecuzione
Il test in laboratorio è stato eseguito in contemporanea rispetto alla metodologia in situ e i campioni d’acqua prelevati al momento delle prove in campo sono stati utilizzati per il saggio di laboratorio. Quest’ultimo ha richiesto anche l’allestimento di un controllo negativo con acqua di mare filtrata e un controllo positivo impiegando, oltre ai gameti immediatamente prelevati dagli organismi in laboratorio, i gameti trasportati in campo e riportati in laboratorio per valutare la risposta dei gameti a seguito dello stress legato al “trasporto”. Tale valutazione è stata fatta utilizzando il tossico di riferimento Cu(NO3)2 in saggi di spermiotossicità e di embriotossicità, con successivo calcolo
dell’EC50.
In particolare una volta preparata la soluzione di uova (1000 uova/ml) e determinata la concentrazione dello sperma, i gameti tenuti ancora separati, vengono trasportati sul campo. Qui
viene fatta avvenire la fecondazione e vengono prelevati i campioni d’acqua. Di conseguenza al rientro in laboratorio sono state utilizzati gli embrioni e le acque provenienti dal campo. Di quest’ultime ne sono stati prelevati 10 ml per campione, ponendoli in piastre sterili per coltura in polistirene a sei pozzetti con coperchio. Per ciascun campione sono state allestite 3 repliche. In ciascun pozzetto si è aggiunto 1 ml della soluzione di embrioni proveniente dal campo, sulla quale sono state osservate le anomalie dello sviluppo dopo 72 ore, quando è stato raggiunto lo stadio di pluteo a 4 braccia.
Per quanto riguarda invece il controllo positivo sono state utilizzate soluzioni a concentrazioni crescenti di nitrito di rame (24, 48, 60 ,72 μg/l), allestite in piastre sterili con 3 pozzetti per ciascuna concentrazione. Utilizzando tali soluzioni è stato allestito sia il saggio di embriotossicità, con gli stessi embrioni impiegati per valutare i campioni d’acqua, sia quello di spermiotossicità, con i gameti portati sul campo e riportati in laboratorio senza far avvenire la fecondazione. Nel primo caso è stato aggiunto 1 ml della soluzione di embrioni a ciascun pozzetto, per poi fare le letture dopo 72 ore. Il saggio di spermiotossicità è stato eseguito invece inserendo all’interno delle camere test un numero definito di spermatozoi. Dopo un’ora di esposizione alla matrice acquosa sono state aggiunte le uova e trascorsi altri 20 minuti il saggio è stato bloccato con l’aggiunta di Lugol. Lo sperma e le uova, prima del loro inserimento nelle camere test, sono stati conteggiati e diluiti fino al raggiungimento di 1000 uova e un rapporto sperma/uovo di 15.000:1 in ogni camera test. Successivamente è stata determinata la diminuzione di percentuale di fecondazione al crescere della concentrazione del tossico e rispetto al controllo negativo contenete acqua di mare filtrata.
Conteggio e elaborazione dei dati di tossicità
La lettura viene effettuata con l’osservazione random dell’intero pozzetto. Per ogni replica vengono contati 100 embrioni. A 18°C±1 dopo 48 ore gli zigoti generalmentearrivano allo stadio di Pluteo a 4 braccia ma il test viene letto a 72 h, in modo da essere sicuri che tutti gli embrioni siano arrivati allo stadio di sviluppo desiderato. Le letture vengono effettuate contando il numero di plutei normoformati, da cui si ricava il valore percentuale, scartando le larve non sviluppate e quelle che presentano malformazioni(Fig 2.2), come ad esempio malformazioni delle braccia, incrocio delle spicole e/o malformazioni dell’apparato digerente. Affinché il saggio venga considerato valido la percentuale di larve del controllo deve essere maggiore o uguale al 70% ma comunque inferiore al 100%.
Inoltre, al fine di valutare l’effetto del controllo negativo, viene utilizzata la “correzione di Abbott” mediante la seguente formula:
Dove:
X = % di effetto nel campione testato Y = % di effetto nel controllo
La correzione di Abbott viene utilizzata per quantificare la tossicità dei campioni nelle indagini ambientali. Talvolta, in assenza dei risultati di effetto a diverse diluizioni del campione da testare, in alternativa ai metodi che utilizzano l’EC20/EC50, viene considerata la concentrazione (diluizione) di massimo effetto, in sostanza il campione liquido tal quale. In particolare in Tabella 2.1 è riportata la scala per il test di spermiotossicità che tiene conto della correzione di Abbott e della significatività derivante dal confronto tra campione e controllo effettuato mediante un test t.
Tabella 2.1 – scala di tossicità per il Test di embrio e spermiotossicità
I valori ottenuti nel controllo positivo, cioè nelle prove di sviluppo con il tossico di riferimento alle diverse concentrazioni stabilite dal protocollo, corretti con Abbott, vengono utilizzati per il calcolo dell’EC50, tramite il metodo di Trimmed Spearman-Kaber (Hamilton et al.1978). Il risultato, perché sia considerata accettabile la prova, deve rientrare nella carta di controllo del laboratorio, cioè nell’intervallo di variazione della EC50 considerata la serie storica di prove eseguite correttamente.
Valore di
Abbott Test T Tossicità A < 0 - 0 < A 8 p 0,05 Assente 0 < A 8 A > 8 p < 0,05p > 0,05 Bassa 8 < A 24 p < 0,05 Media 24 < A 56 p < 0,05 Alta A 56 p < 0,05 Molto alta
2.4.2 Analisi chimiche sulla colonna d’acqua
I campioni d’acqua prelevati in campo nei siti scelti per le differenti prove definitive sono stati sottoposti ad analisi chimiche, in modo tale da poter valutare l’applicabilità della metodologia in
situ avvalendosi di un ulteriore riscontro in aggiunta al test di laboratorio. In particolare sono state
determinate le concentrazioni di metalli quali As Cd, Cr totale, Pb, Cu e Zn (EPA 6020A 2007) oltre agli idrocarburi totale (EPA 5021A 2003; EPA 3510C 1996; EPA 8015D 2003). Sono stati
Fig. 2.2 – Analisi dello sviluppo. A: pluteo normoformato, B: Pluteo malformato (malformazione delle braccia), C: Pluteo normoformato (in alto) ed embrione malformato con ritado dello
sviluppo (in basso). Foto: Lorenzo Morroni
inoltre quantificati anche i solidi sospesi, in conformità col metodo APAT CNR IRSA 2090 Man 29 2003.
Per quanto riguarda la determinazione dei metalli e degli idrocarburi questa è stata effettuata da un laboratorio esterno (Chelab s.r.l.), mentre le analisi sui solidi sospesi sono state eseguite nell’ambito del laboratorio di tesi.
2.5 Prove in situ
2.5.1 Prove preliminari
Al fine di mettere a punto la parte metodologica sono state eseguite alcune prove preliminari che , sebbene limitate da un punto di vista spazio-temporale hanno fornito utili indicazioni riguardo:
l’eventuale presenza di effetti tossici dovuti ai materiali da utilizzare nei saggi in situ; la tipologia della sonda biologica e in particolare della camera di esposizione;
le stazioni di campionamento in situ in cui effettuare le prove definitive.
Mentre la prova dei materiali è avvenuta in una prima fase di laboratorio, la scelta della sonda e delle stazioni di campionamento per la prova definitiva sono avvenute in campo, in date successive.
Prova dei materiali
Al fine di verificare la possibile presenza di effetti tossici dovuti ai materiali impiegati nella metodologia in situ sono state eseguite delle prove preliminari in laboratorio. Il test di embriotossicità è stato condotto utilizzando come matrice acqua di mare filtrata. In particolare sono stati allestiti in parallelo due saggi, uno condotto con i pozzetti normalmente impiegati nelle procedure standard (3 repliche) e l’altro utilizzando la sonda biologica (con 6 camere test) da utilizzare in situ, posta in un acquario nelle medesime condizioni. Le prove sono state ripetute in 2 date differenti con un nuovo pool di gameti. In questo modo è stato possibile orientare la scelta dei materiali, evitando il rischio di confondere gli eventuali effetti di questi ultimi con le possibili differenze dovute alle due metodologie d’esecuzione del saggio (laboratorio e situ).
Scelta della sonda biologica
Sono state effettuate 4 prove preliminari in situ, in 4 differenti date (25.05.2010, 18.11.2010, 29.11.2010, 13.12.2010), con l’obbiettivo di progettare la sonda biologica che superasse tutte le criticità emerse durante l’esposizione in mare. Durante la durata dell’intera fase preliminare sono state testate 3 tipologie di camere test per valutare le eventuali differenze nell’esposizione degli embrioni ai contaminanti ambientali. La prima tipologia di camera è dotata di una sola apertura, del diametro di 2,5 cm (Fig. 2A), in corrispondenza dell’estremità superiore. La seconda tipologia presenta, oltre alla precedente “finestra”, una seconda apertura in corrispondenza della superficie laterale del cilindro delle dimensioni di 1,5 x 4 cm (Fig. 2B). Infine la terza tipologia di camera prevede 2 finestre laterali di 1,5 x 4 cm. e una terza apertura in corrispondenza dell’estremità superiore (Fig 2C). Tutte le aperture sono state rivestite con una rete da plancton con maglia di 85 μm. Tale misura impedisce la fuoriuscita delle uova fecondate e massimizza il ricambio d’acqua all’interno della camera. Tutte le reti sono incollate con colla specifica per tubi e raccordi in PVC rigido (Tangit), applicata esclusivamente sulla superficie esterna delle camere. Come detto inizialmente, le camere sono fissate a un supporto rigido in PVC, del diametro di 10 cm per 2 cm di altezza. Nelle ultime 2 date (29.11.2010 e 13.12.2010) sono state inoltre testate anche reti con maglie di 55 μm, al fine di trovare il giusto compromesso tra ricambio d’acqua e quantità di
Tappo a vite Camera (50 ml) B C Tappo a vite Rete (maglia 85 μm) Camera (50 ml) A Rete (maglia 85 μm)
Finestra laterale con rete (maglia 85 μm)
Tappo a vite
Camera (50 ml) Rete (maglia 85 μm)
Finestre lateralicon rete (maglia 85 μm)
Fig. 2.3 – Camere d’esposizione utilizzate nelle prove preliminari. A: camera a 1 apertura, B: camera a 2 aperture, C: camera a 3 aperture.
particolato all’interno delle camere. Tutte le sonde sono state fissate alla riva e dotate di peso di 300 g, che dopo le prime prove si è dimostrato il peso più idoneo
Siti di campionamento
Il disegno sperimentale ha previsto l’allocazione delle sonde biologiche in 3 diversi siti. In particolare i siti L1 (43° 33’ 52.88’’ N -10° 18’ 08.12’’ E) e L2 (43° 33’ 45.00’’ N - 10° 17’ 55.00’’ E) sono situati all’interno del porto di Livorno, dove analisi precedenti avevano mostrato alti livelli di contaminazione. Il terzo sito è stato scelto come controllo. Questo, nella prima prova del 12 maggio, è stato posizionato all’esterno delle acque portuali e precisamente nello specchio di mare posto di fronte alla vasca di colmata d nominato. Il sito è stato denominato L3 (43° 33’ 47.66’’ N - 10° 17’ 45.71’’ E). Nella prova successiva (18 novembre 2010) sono state mantenuti L1 e L2, mentre come sito di controllo si è preferito un sito situato nella zona militare dell’Accademia Navale di Livorno, in una zona relativamente lontana dalle acque portuali e dalle onde grazie alla presenza di una barriera frangiflutti (L4: 43°31'30.70"N - 10°18'29.62"E). Il 29 novembre, a causa di una mareggiata particolarmente violenta, non è stato possibile utilizzare alcun sito di controllo. Infine il 13 dicembre, in aggiunta ai siti L1 e L2 si è utilizzata la stazione L5 (43°25'41.37"N - 10°23'40.34"E), un nuovo sito di controllo, posto nella zona di Quercianella (LI) più lontano da possibili fonti di contaminazione rispetto a L4 e ugualmente protetto dalle mareggiate.
Nelle prime 2 date (25.05.2010 e 18.11.2010) in ciascun sito sono state utilizzate le 3 tipologie di camera, ognuna delle quali replicata 3 volte (Fig .2.4). Nella data successiva è stata applicata la rete da 55 μm, montata su un’unica apertura nell’ultima data (13.112.2010).
N
L2
Prove a diverse temperature
Le procedure standard per il test di embriotossicità (ASTM 2004; ICES 1997; USEPA 1994, 1995, 2000) condotto in laboratorio prevedono una temperatura di 18°C±1. Nel Mar Ligure questa temperatura si raggiunge solamente in un ristretto periodo alla fine della primavera e agli inizi dell’autunno (ai limiti del periodo estivo). Appare quindi fondamentale, al fine di una confrontabilità con le prove in situ, valutare l’applicabilità della metodologia anche a diverse temperature, sia più basse (in riferimento al lungo periodo che intercorre tra il tardo autunno e la fine della primavera), che più alte, per una eventuale applicabilità delle prove al periodo estivo. E’ noto l’effetto ritardante delle basse temperature sullo sviluppo embrionale dei ricci di mare (Beiras
et al., 2001). Al fine di meglio calibrare le prove di campo sono state quindi eseguite alcune prove
di laboratorio a temperature differenti. In particolare gli embrioni di P. lividus sono stati esposti secondo il saggio di embriotossicità, alle temperature di 13, 18 e 24°C. Come variabile di risposta è stato considerato il tempo nel quale una percentuale superiore al 70% raggiunge lo stadio di pluteo a 4 braccia in un controllo negativo. Come matrice è stata utilizzata acqua di mare filtrata e le diverse temperature sono state ottenute tramite l’utilizzo di camera e bagni termostatati. Le prove sono state ripetute in 7 date differenti e per ciascuna combinazione dei fattori tempo ed esposizione sono state allestite 3 repliche. La verifica del livello di sviluppo veniva eseguita ogni 24h.
Come sopra accennato, le diverse temperature sono state scelte in funzione della variabilità stagionale. In particolare la temperatura di 13°C è paragonabile a quella media delle aree costiere del litorale livornese nel periodo invernale. 18°C è la temperatura prevista dalle procedure standard, mentre 24°C è una temperatura che in mare si raggiunge esclusivamente nel periodo estivo.
2.5.2 Prove definitive
Al termine di questa prima serie di prove è stata concepita la sonda biologica definitiva (2.3) ubicata in 3 differenti siti lungo il litorale livornese (Fig. 5): uno individuato in una zona antropizzata ma priva di attività industriali (S1) e 2 siti posti lontani da possibili fonti di contaminazione (S2 e S3). In particolare il sito S1 (43°31'1.87"N, 10°18'57.70"E ) è stato scelto in corrispondenza del porticciolo di Ardenza, in una area densamente antropizzata ma priva di attività industriali. Altri due siti sono stati scelti come controlli e si trovano a sud della città di Livorno nei pressi di Quercianella, in zone costiere relativamente incontaminate e a basso impatto antropico. In particolare S2 (43°27'40.02"N, 10°21'36.32"E) è situato a circa 400 m in direzione E dalla punta del Sonnino in corrispondenza del “Lido del Rogiolo” ed S3 (43°25'37.10"N, 10°23'48.27"E ) a 300
m. a SE da punta del Fortullino, sito usualmente utilizzato per il prelievo degli organismi test. In ciascuno dei 3 siti sono state immerse tre sonde biologiche, ognuna delle quali è costituita da 3 camere. Di conseguenza sono state utilizzate 9 repliche per sito (Fig. 3).
Come per le prove preliminari è stato eseguito in parallelo il saggio di laboratorio e il controllo positivo con i gameti trasportati in campo e riportati in laboratorio per valutare un possibile stress legato al trasporto (§ 2.3.1).
In particolare una volta arrivati al sito oggetto di studio viene prelevato il giusto volume di sperma e trasferito dalla eppendorf al beaker contente le uova, agitando e aspettando 20 minuti in modo da essere sicuri che la fecondazione sia avvenuta. Intanto sono state disposte le camere d’esposizione già aperte e al termine dei 20 minuti 50 ml della soluzione di uova fecondate vengono iniettati all’interno delle camere, le quali sono già predisposte per essere posizionate in mare. Appena conclusa l’operazione le repliche vengono contemporaneamente calate e bloccate in acqua. A questo punto, attraverso l’uso della sonda multiparametrica Eutech Instruments PCD 650, vengono registrati temperatura, salinità, pH e ossigeno disciolto nel punto di campionamento. Viene inoltre preso un campione di acqua di mare da riportare in laboratorio. Tale operazione è sempre stata fatta tassativamente entro un’ora dalla fecondazione, per essere sicuri che l’esposizione alla matrice avvenisse sempre prima della prima divisione cellulare dell’embrione. A tal fine sono state opportunamente preparate 2 aliquote di gameti provenienti dallo stesso pool e portate sul campo, in modo da utilizzare, sia in campo che in laboratorio, zigoti che non abbiano mai raggiunto la prima divisione. Infine una parte di gameti è stata mantenuta separata in campo, per poi essere riportata in laboratorio, in modo da verificare un possibile stress dovuto al trasporto.
Considerato il periodo invernale è stato allestito in parallelo anche un controllo di laboratorio a 13°C. Una volta che gli embrioni esposti a questa temperatura hanno raggiunto lo stadio di pluteo 4 braccia sono stati recuperati i campioni in campo. Il contenuto delle camere di esposizione viene trasferito sul campo in contenitori da urina sterili e immediatamente bloccato con Lugol. Tali soluzioni vengono poi disposte all’interno di contenitori di polistirolo, pronte per essere trasportate in laboratorio per le letture dei dati. In questa occasione è stata inoltre ripetuta la lettura dei parametri ambientali (Temperatura, salinità, pH e ossigeno disciolto), i cui valori verranno successivamente mediati con quelli rilevati al momento della messa in acqua della sonda biologica.
2.6 Raccolta ed elaborazione dei dati
In laboratorio è stato prelevato 1 ml di soluzione da ciascun contenitore proveniente dal campo e posta sopra un vetrino a orologio. Questo è stato analizzato al microscopio ottico per il conteggio degli embrioni (§ 2.3.1).
In alcuni campioni sono state riscontrate alcune repliche, con valore 0, le quali si discostavano nettamente da tutte le altre appartenenti al campione in esame. Il motivo di tale fenomeno è stato identificato in possibili errori durante la fase di allestimento e di posizionamento delle camere. Per evitare che questi valori potessero distorcere le stime delle statistiche di posizione e di dispersione
S1
S2
S3
LIVORNO
Livorno
Fig. 2.5 – Area di studio. S1= sito 1, S2 = sito 2 (controllo), S3 = sito 3 (controllo).
Sito
Repliche
S1
1
9
……….
1
9
Fig. 2.6 - Disegno di campionamento. S1= sito1, S2 = sito 2 (controllo), S3 = sito 3 (controllo).
S2
S3
sono stati eliminati. Questa operazione è avvenuta applicando la regola di Tukey, che ha identificato questi valori come outliers.
La regola di Tukey è basata sui quartili: data una serie di dati yi, si calcola il quartile inferiore Q1, il
quartile superiore Q3 e il range interquartile IQR = Q2 – Q1. Quindi, per ciascun dato si verifica se: yi < (Q1 – 1,5IQR)
oppure
yi < (Q3 + 1,5 IQR)
Un dato che verifica una delle due ipotesi va considerato come un potenziale outlier (OECD, 2006). Una volta eliminati gli outliers si è effettuato il confronto statistico tra i dati ottenuti. Questo è avvenuto mediante un test t per serie di dati di numero diseguale. In questo modo sono stati confrontati i risultati ottenuti mediante la metodologia in situ con quelli di laboratorio in ciascuna data e in ciascun sito. Questi dati sono stati inoltre confrontati con il controllo di laboratorio. Infine, per meglio interpretare i risultati delle prove preliminari è stata utilizzata un’ANOVA che ha confrontato le varianze di tutte le condizioni sperimentali per tutti i siti sui risultati ottenuti in una data di prova, oltre ad una seconda ANOVA unifattoriale per determinare possibili differenze tra le varie tipologie di camere sui risultati in una seconda data.
