• Quantitative Quantitative Structure-Activity Structure-Activity Relationships Relationships

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Structure-Activity Structure-Activity

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QSAR

Il successo dell’approccio SAR per il drug design dipende non solo dalla conoscenza e dall’esperienza del chimico

farmaceutico,ma è anche molto legato alla “fortuna”.

SERENDIPITY

La QSAR è un tentativo di eliminare la variabile “fortuna”

e di stabilire relazioni matematiche, sotto forma di equazione, tra attività biologica e parametri chimico-fisici misurabili, rappresentativi di proprietà come la lipofilicità, la forma e

la distribuzione elettronica, che influenzano l’attività del farmaco.

Compounds + biological activity

QSAR

New compounds with improved biological

activity

QSAR

QSAR

Interazione farmaco-recettore

QSAR

QSAR

Ligand Based

Structure-based

QSAR

QSAR

Nella progettazione di un farmaco la conoscenza delle caratteristiche tridimensionali comuni ad una serie di molecole attive è essenziale. Questa conoscenza permette di definire il farmacoforo e di capire quali sono i requisiti per l’azione di un farmaco: non basta infatti sapere quali sono i gruppi importanti per l'attività, occorre conoscere la loro disposizione nello spazio.

Per risalire allora alla disposizione spaziale del farmacoforo occorre definire la conformazione biologicamente attiva, cioè quella che interagisce con il recettore: questa va selezionata tra tutte le possibili conformazioni che una molecola può assumere, e che derivano dalla rotazione dei legami. Per questo si può fare una analisi conformazionale sistematica, variando con incrementi costanti tutti i legami ruotabili della molecola, in modo da generare tutte le possibili conformazioni che vengono poi minimizzate.

QSAR

Una volta trovate tutte le conformazioni stericamente permesse non è possibile prevedere a priori quale di queste è la conformazione biologicamente attiva. È però plausibile che questa sia compresa tra il numero delle conformazioni a bassa energia, che sia cioè una delle conformazioni probabili della molecola, nelle quali essa si trova più frequentemente. Questa conformazione attiva può, ma non necessariamente deve, corrispondere al minimo assoluto.

QSAR

Data l’incertezza nel definire la conformazione biologicamente attiva, è logico che questa possa di norma essere determinata dall’analisi non di una sola molecola (a meno che non sia assolutamente rigida) ma di una serie di derivati, anche molto diversi tra loro, per determinare le caratteristiche conformazionali comuni a tutti i prodotti attivi. In questo senso è importante nella modellistica molecolare anche l’analisi dei/prodotti inattivi, per valutare le caratteristiche che li diversificano dai prodotti attivi.

QSAR

L’ approccio dell'analogo attivo, una metodologia spesso utilizzata per formulare modelli di interazione tra farmaco e recettore. Prima si determinano i gruppi importanti per l’attività in un set di composti attivi (che agiscono tutti sullo stesso recettore, legandosi nello stesso sito e nello stesso modo). Si esplorano poi le possibili conformazioni della molecola, cioè quelle permesse stericamente, registrando allo stesso tempo le varie disposizioni del farmacoforo: ogni disposizione (pattern) potrebbe essere considerata quella buona. Si prende allora il pattern (o i patterns) comune a tutte le molecole attive: se non se ne trova nemmeno uno vuol dire che c’è una inconsistenza nel sistema. Il pattern prescelto deve poi essere provato, e questo può essere fatto disegnando una serie di molecole che presentano lo stesso arrangiamento tridimensionale del farmacoforo e verificando che siano attive; oppure possono essere prese in considerazione molecole che, pur presentando questo arrangiamento, sono inattive, e questo permette di valutare anche eventuali effetti sterici o elettronici sfavorevoli

QSAR

Utilizzando questa metodologia i ricercatori della Merrell Dow hanno sviluppato un modello di interazione di antagonisti al recettore 5-HT_lA: hanno condotto uno studio conformazionale su molecole come la R-metiotepina, spiperone, S-propranololo e buspirone, che hanno in comune un anello aromatico e un azoto basico, cercando le conformazioni che presentavano questi due gruppi alla stessa distanza e nella stessa orientazione. Si sono sovrapposte queste conformazioni, si è calcolato il volume totale occupato dalle molecole, creando così il volume della cavità recettoriale a disposizione del ligando.

QSAR

QSAR

Gli stessi ricercatori hanno disegnato poi, sulla base di questi risultati, delle molecole che presentassero la giusta orientazione del farmacoforo e il cui volume non oltrepassasse quello precedentemente individuato. Si è così arrivati ad un composto, MDL 72832, che presentava le necessarie caratteristiche di affinità e selettività, e che poteva costituire un lead per lo sviluppo di farmaci per il SNC.

QSAR

Un momento cruciale nell'approccio dell’analogo attivo è la scelta del gruppo di molecole da analizzare, il cosiddetto training set.

Dovrebbero essere scelte le molecole più informative possibili, cioè diverse strutturalmente sia dal punto di vista sterico che elettronico, in modo da avere un ampio ventaglio di informazioni; alcune di queste molecole dovrebbero essere rigide o semirigide in modo da delimitare il campo conformazionale. Naturalmente si devono avere evidenze sperimentali che queste molecole interagiscono con lo stesso sito recettoriale. Un training set di molecole strutturalmente molto simili dà usualmente informazioni più limitate; un set di molecole con struttura chimica molto diversa può portare ad una descrizione del farmacoforo molto più ampia e quindi può più facilmente suggerire nuove strutture, anche se la sovrapposizione è molto più imprevedibile.

QSAR

Il punto chiave è l’allineamento delle molecole: il criterio con cui le molecole sono sovrapposte è di fondamentale importanza per lo sviluppo del modello. Due molecole infatti possono essere sovrapposte facendo coincidere le parti uguali, metodo forse logico, ma a volte fuorviante, oppure la posizione di gruppi scelti in base alle ipotesi sul farmacoforo.

QSAR

Si possono sovrapporre le molecole anche in base a

proprietà come la forma o il potenziale

elettrostatico molecolare (MEP), o in base ai campi

di interazione; il vantaggio di questo metodo è

quello di paragonare molecole strutturalmente

diverse che non si sovrappongono bene con le altre

tecniche.

QSAR

Il potenziale elettrostatico molecolare (MEP) che ha origine dal fatto che la distribuzione elettronica della molecola crea un campo elettrico tridimensionale nell'ambiente attorno ad essa. Quando due molecole (ad esempio ligando e recettore) si avvicinano, il contatto iniziale avviene tramite interazioni elettrostatiche, e può essere attrattivo o repulsivo, a seconda che vengano a contatto cariche di segno opposto o uguale.

Il MEP rappresenta l’energia di interazione tra la distribuzione elettronica della molecola e una carica positiva puntiforme, posta ad una certa distanza da essa su una griglia tridimensionale che la circonda. Tramite metodi di calcolo quantomeccanici è possibile calcolare la densità elettronica e da questa risalire al MEP .

QSAR

QSAR

La cimetidina e la tiotepina, due ligandi del recettore istaminergico, hanno rispettivamente un gruppo metil-imidazolico e un gruppo guanidinotiazolico: utilizzando una sovrapposizione atomo su atomo sarebbe stato difficile scegliere gli azoti da sovrapporre.

QSAR

I parametri chimico-fisici che definiscono le proprietà molecolari:

1) sono una misura soddisfacente dell’effetto di queste proprietà sull’attività del composto;

2) sono in forma di numero e derivano da dati empirici ritenuti correlati alla proprietà che il parametro rappresenta.

E’ dunque possibile misurare o calcolare questi parametri per una classe di molecole e correlarli ai dati di attività biologica mediante equazioni matematiche e con l’ausilio di metodi

statistici (analisi di regressione).

QSAR

Concetti di Statistica

Input: n descrittori P1,..Pn e il valore dell’attività biologica (EC50 per esempio) per m composti

.

Attività

P

₁

P

₂

... P

_n

Cpd 1 0.7 3.7 Cpd 2 3.2 0.4

…

Cpd m

QSAR

 Il problema delle QSAR è trovare coefficienti C0,C1,...Cn tali che:

Attività biologica = C0+(C1*P1)+...+(Cn*Pn)

e l’errore di predizione sia minimizzato all’interno di una lista di m composti dati.

 Le tecniche di “Partial least squares” (PLS) e di regressione lineare multipla sono usate per il calcolo dei coefficienti dei descrittori strutturali.

 Per entrambe le tecniche si cerca di correlare descrittori chimici e dati biologici multipli per definire i principali fattori di dipendenza dell’attività biologica osservata.

 La PLS è una generalizzazione della regressione

Concetti di Statistica

QSAR

Dall’Esperienza alla Teoria alle Regole

1930‘s, L. Hammett: electronic  constants 1964, C. Hansch e T. Fujita: QSAR

1984, P. Andrews: affinity contributions of functional groups

1985, P. Goodford: GRID (hot spots at protein surface) 1988, R. Cramer: 3D QSAR

1992, H.-J. Böhm: LUDI interaction sites, docking, scoring

1997, C. Lipinski: bioavailability; rule of five

1998, Ajay, W. P. Walters and M. A. Murcko; J. Sadowski and H. Kubinyi: drug-like character

QSAR

• Analisi QSAR classica (Hansch and Free Wilson analyses).

 Si considerano solo le strutture 2D.

 Il principale campo di applicazione è la variazione dei sostituenti di uno scaffold comune.

• Analisi 3D-QSAR (CoMFA,GRID): Analisi 3D-QSAR (CoMFA,GRID):

 Ha uno scopo più ampio.

 Parte da strutture 3D e correla l’attività biologica con le proprietà 3D dei campi.

 Le molecole sono descritte da proprietà

calcolate direttamente sulla struttura 3D e

non sulle proprietà dei sostituenti, come nella 2D.

QSAR

Analisi di Hansch

QSAR

Proprietà chimico fisiche

IDROFOBICITA’

PARAMETRI DI RIPARTIZIONE:

 Coefficiente di ripartizione (P):

parametro usato per misurare il movimento di un farmaco attraverso le membrane biologiche.

La sua determinazione dipende dal “sistema solvente” :

• n-ottanolo/acqua è il più usato, moltissimi i dati a disposizione (ripartizione nel tratto GI);

• olio di oliva/acqua (ripartizione nella membrana ematoencefalica);

• cloroformio/acqua (ripartizione nella membrana buccale).

 Costante di sostituenti idrofobici ():

rappresenta il contributo di ciascun gruppo sostituente della molecola al coefficiente di ripartizione ed è generalmente determinato nel sistema n-ottanolo/acqua.

QSAR

QSAR

PARAMETRI ELETTRONICI:

 Costante di Hammett ()

La distribuzione degli e^- in un farmaco ne influenza la distribuzione nei tessuti e l’attività biologica.

Come regola generale farmaci non-polari e polari in forma non ionizzata sono più facilmente trasportati attraverso le membrane rispetto a quelli polari e ionizzati.

Una volta raggiunto il sito d’azione, la distribuzione di e^- nella struttura influenza il tipo di legame che si stabilisce con il target.

QSAR

Hammett (1940): primo tentativo di quantificare gli effettieffetti elettronici

elettronici dei gruppi sostituenti dell’acido benzoico

X = gruppi elettron attrattori Equilibrio spostato a destra X = gruppi elettron donatori Equilibrio spostato a sinistra Hammett ha calcolato le costanti (_X) per vari sostituenti

dell’acido benzoico

X K

KX

 log

 K = Costante di dissociazione dell’acido benzoico K_X = Costante di dissociazione dell’acido benzoico sostituito

QSAR

La costante di Hammet è una misura dell’effetto elettron-attrattore o elettron- donatore di un sostituente ed è stata determinata misurando la dissociazione di una serie di acidi benzoici sostituiti in confronto con la dissociazione dell’acido benzoico.

Essa rappresenta la somma degli effetti sia induttivi che di risonanza (mesomerici) del sostituente.

QSAR

PARAMETRI STERICI:

 Parametro sterico di Taft (E_s))

• Le dimensioni del farmacoforo di una classe di molecole devono essere complementari a quelle del sito target.

• La definizione dei parametri sterici è stato il primo

tentativo di mettere in relazione un parametro misurabile, correlato a forma e ingombro di una molecola, alle dimensioni del sito target e all’attività biologica.

E_S viene calcolato in base alle costanti relative di idrolisi di metil etanoati - sostituiti.

H3COOR) (

(XCH2COOR)

k log

k log

C

ES 

La costante di Taft del sostituente X rappresenta la misura dell’effetto del sostituente sulla densità di carica del centro reattivo rispetto al protone (X = H).

QSAR

 2) n

(n x

1)M -

n (n x

 

MR n = indice di

rifrazione

M = peso molecolare

 = densità

Un’altra misura dei fattori sterici è fornita dal parametro della refrattività molare, che è una misura del volume

occupato da un atomo o un gruppo di atomi.

Si calcola con la seguente equazione:

 Refrattività molare (MR)

Il rapporto M/^definisce un volume, mentre il termine (n x n-1)/(n x n+2) fornisce un fattore di correzione che definisce quanto facilmente il sostituente possa essere polarizzato.

QSAR

Proprietà Molecolari in QSAR

 Altre proprietà molecolari (descrittori) che sono state incluse negli studi QSAR includono proprietà calcolate come:

 energia HOMO ^ energia LUMO

 _{ovalità } area superficiale

 polarizzabilità^ cariche sugli atomi

 volume molecolare ^ superficie accessibile al solvente

 Area di superficie ^refrattività molare di VdW

QSAR

Descrittori Quanto-Meccanici in QSAR

QSAR



Altre proprietà molecolari (descrittori) che sono state incluse negli studi QSAR includono proprietà misurate come:



_{densità  pKa}

- energia di ionizzazione p.e.



_Hvaporizzazione  indice di rifrazione



peso molecolare  momento di dipolo ()



_Hidratazione  potenziale di riduzione



Coeff. ripartizione (P) = log PX - log PH

Proprietà Molecolari in QSAR

QSAR

QSAR

QSAR

QSAR

In realtà tale approccio, se

pur innovativo negli anni 60

presenta grossi limiti inerenti

la significatività del dato

REQUISITI DI BASE negli STUDI QSAR

1) Tutti gli analoghi appartengono a classi affini 2) Tutti gli analoghi hanno lo stesso meccanismo

d’azione

3) Tutti gli analoghi si legano al target in modo comparabile

4) L’effetto di una sostituzione con un isostere può essere predetto

5) L’affinità di legame è correlata alle energie di interazione

6) L’attività biologica è correlata all’affinità di legame

QSAR

L’equazione di Hansch può quindi essere applicata in casi limitati

QSAR

Per superare i limiti della QSAR tradizionale sono stati sviluppati i metodi cosiddetti 3D-QSAR (QSAR tridimensionale) che richiedono un uso esteso delle tecniche computerizzate di modellistica molecolare. Sono stati sviluppati vari metodi, tra cui comunque il più utilizzato è il CoMFA. L’approccio CoMFA (Comparative Molecular Field Analysis, analisi comparativa dei campi molecolari) si basa sul fatto che a livello molecolare le interazioni capaci di produrre un effetto biologico sono generalmente di tipo non covalente, e possono essere quindi descritte mediante forze elettrostatiche e di Van der Waals, calcolabili facilmente tramite i campi di forza della meccanica molecolare. Per caratterizzare una serie di molecole è quindi possibile utilizzare il valore di queste interazioni, calcolato ad una distanza (4-5 Å).

Computer-aided Drug Design

 E’ possibile sovrapporre la struttura tridimensionale di una molecola al suo potenziale sito d’azione.

Questo processo è definito “ docking” .

 Permette di valutare l’ “accomodamento” della molecola nel sito d’azione e, inoltre, si possono evidenziare i potenziali punti di interazione molecola-target che determinano il binding

QSAR

D

binding RT K

G  .log



Binding free energy

gas constant

Equilibrium dissociation constant Temperature

G_binding = f (Interactions)

QSAR

QSAR