5.1.1 – Raccolta e conservazione dei campioni

5 – Materiali e metodi

5.1 – Attività di laboratorio

Le analisi di laboratorio sono state effettuate con l’obiettivo di confermare il riconoscimento tassonomico sul campo di Paraleucilla magna mediante allestimento di dissociati scheletrici, di studiarne lo stato riproduttivo mediante preparazione di sezioni istologiche e di misurarne le variazioni di biomassa.

5.1.1 – Raccolta e conservazione dei campioni

I campionamenti sono stati effettuati in immersione con autorespiratore tra marzo ed agosto 2007. I campioni di Paraleucilla magna sono stati prelevati dai mitili posti in allevamento nel primo seno del Mar Piccolo, nell’area denominata “ex-Cantieri Tosi”

(Fig. 5.1.1.A-2). Ogni mese sono stati raccolti, con criterio random, 10 esemplari. Ogni esemplare al momento della raccolta veniva rinchiuso in un contenitore rigido da due litri per evitarne il danneggiamento e trasportato in ambiente refrigerato, nei laboratori del Dipartimento di Zoologia dell’Università dei Bari.

5.1.2 – Misure di biomassa e frequenza

Per ognuno dei 10 esemplari raccolti, in laboratorio è stato misurato il volume mediante beacker graduato. Quindi l’esemplare è stato suddiviso in due sub-campioni, uno destinato alla preparazione dei dissociati scheletrici, l’altro per le analisi istologiche. I primi sono stati fissati e conservati in una soluzione di formalina al 4%, i secondi sono stati fissati nella soluzione di Bouin.

Mensilmente, inoltre, è stata rilevata l’infestazione dei mitili da parte della spugna,

espressa come misura di frequenza. La frequenza di infestazione è stata calcolata su

100 esemplari di Mytilus galloprovincialis prelevati casualmente dalle ventie di allevamento degli impianti di mitilicoltura e trasportati a terra (Fig. 5.1.2.A). Gli esemplari di Paraleucilla magna sono stati individuati, contati e campionati per il successivo studio delle caratteristiche scheletriche, indispensabile per definirne con certezza l’identità tassonomica.

La distribuzione normale dei valori mensili di biomassa è stata verificata con test di Shapiro-Wilk.

Per verificare la significativa differenza dei valori di biomassa, espressi in volume, tra i vari mesi, è stato effettuato il test non parametrico di Kruskal-Wallis. E’ stata così verificata l’ipotesi nulla H

che i sei gruppi provengano dalla stessa popolazione e/o da popolazioni che abbiano la medesima mediana.

I test statistici sono stati eseguiti con software SPSS 13.0.

5.1.3 – Preparazione dei dissociati scheletrici

La procedura per l’identificazione tassonomica dei poriferi prevede l’isolamento degli elementi scheletrici (spicole e/o fibre di spongina), mediante eliminazione della sostanza organica con metodiche che variano in funzione della natura dello scheletro.

Nel caso delle Calcisponge viene utilizzata la metodica di seguito riportata.

I campioni fissati in formalina sono stati lavati per alcuni minuti con acqua di fonte. In seguito è stata prelevata una sezione longitudinale di dimensioni ridotte (pochi mm

).

La parte restante del campione è stata conservata in alcool al 70%.

Il frammento è stato messo in una provetta, quindi vi è stato aggiunto ipoclorito di

sodio (NaClO) in quantità sufficiente da ricoprire completamente il frammento. Sono

seguiti diversi passaggi su fiamma, allo scopo di sciogliere la materia organica. Le

spicole così ottenute sono state lasciate in acqua distillata per 30 minuti.

La soluzione acquosa è stata quindi delicatamente rimossa e sostituita con etanolo (due successivi lavaggi in alcool al 70% della durata di 30 minuti).

Al termine di questa operazione le spicole, rimaste come corpo di fondo nella provetta, sono state versate su vetrini. Questi ultimi sono stati posti su piastra calda per alcuni minuti, l’alcool residuo è stato fatto bruciare, dopodichè sono stati lasciati ad asciugare sulla piastra calda per 30 minuti.

Il preparato è stato chiuso con un vetrino copri-oggetto utilizzando come montante il DPX.

5.1.4 – Allestimento di preparati istologici Inclusione in paraffina

FISSAZIONE. Da ogni campione di Paraleucilla magna sono stati prelevati due frammenti di circa 1 cm

. I frammenti sono stati fissati per 48 ore nel Bouin, una soluzione preparata con:

- 15 ml di acido picrico;

- 5 ml di formalina pura;

- 1 ml di acido acetico glaciale.

Per terminare la fissazione sono stati eseguiti quattro lavaggi in alcool diluito al 50%.

DISIDRATAZIONE. Per disidratare i campioni sono stati effettuati lavaggi in alcooli progressivamente sempre meno diluiti:

- due passaggi in alcool al 70% per 30 minuti;

- due passaggi in alcool al 80% per 30 minuti;

- due passaggi in alcool al 95% per 30 minuti;

- due passaggi in alcool assoluto per 30 minuti.

DIAFANIZZAZIONE. I campioni sono stati immersi per 30 minuti in Histolemon (due passaggi).

INCLUSIONE. I campioni sono stati immersi in paraffina liquida e posti nella stufa alla temperatura di 58°C per 30 minuti. Al cambio di paraffina successivo sono seguiti altri 60 minuti in stufa.

I campioni sono stati posti negli anelli di inclusione pieni di paraffina liquida, nella posizione più adatta al taglio, e lasciati asciugare per 30 minuti.

Taglio dei campioni inclusi in paraffina.

Dai campioni inclusi sono state ottenute sezioni di 5 µm di spessore utilizzando un microtomo Reichert-Jung modello 2030. Le sezioni ottenute sono state poste su vetrini e lasciate asciugare per 24 ore su piastra tiepida.

Colorazione con Blu di Toluidina

RIMOZIONE DELLA PARAFFINA. Sono stati effettuati 2 bagni in Histolemon della durata di 5 minuti ciascuno.

RE-IDRATAZIONE. I campioni hanno subito:

- un passaggio in alcool assoluto per 5 minuti;

- un passaggio in alcool al 95% per 5 minuti;

- un passaggio in alcool al 80% per 5 minuti;

- un passaggio in alcool al 70% per 5 minuti;

- un passaggio in alcool al 50% per 5 minuti;

- un breve sciacquo in acqua distillata.

COLORAZIONE. I vetrini sono stati immersi per 20-25 minuti in soluzione di Blu di Toluidina, ottenuta con 2 parti di acqua distillata e una di Blu di Toluidina pura.

Successivamente i campioni sono stati lavati in acqua distillata e immersi prima in alcool al 95% e dopo in alcool assoluto per rimuovere il colorante non fissato. E’

importante che questi passaggi siano veloci per evitare che la sezione colorata sbiadisca.

Dopo due passaggi in Histolemon di 2-3 minuti ciascuno sono stati montati i vetrini copri-oggetto con DPX.

5.1.5 – Studio della riproduzione sessuale

Le sezioni istologiche di Paraleucilla magna sono state esaminate al microscopio ottico con oculare micrometrico per valutarne lo stato riproduttivo. Sono state effettuate le seguenti misurazioni:

- individuazione di ovociti, embrioni e larve per campione;

- frequenza dei campioni con elementi riproduttivi;

- diametro degli elementi riproduttivi;

- numero di ovociti e di embrioni e/o larve per unità di superficie della sezione (n°/mm

).

Per confrontare il numero di elementi riproduttivi per unità di superficie tra i sei mesi di campionamento è stata eseguita un’ANOVA ad una via seguita da un test di Tukey per i confronti multipli.

Il numero di elementi riproduttivi per unità di superficie è stato trasformato prima dell’analisi con formula “log (x+1)”.

I test statistici sono stati eseguiti con software SPSS 13.0.

Figura 5.1.1.A. Mappa satellitare di Taranto (Da GoogleMaps).

Figura 5.1.2.A. Esemplari di Paraleucilla magna sulle ventie dei mitili.

5.2 – Attività sperimentale

5.2.1 – Area di studio

L’impianto sperimentale di allevamento utilizzato nella presente tesi è stato allestito presso uno stabilimento di molluschicoltura situato in località Capo San Vito, nella zona sud di Mar Grande (Fig. 5.1.1.A-1).

5.2.2 – Materiali

Lanternet

I lanternet sono contenitori in materiale plastico costituiti da una rete con maglia pari a circa 4 cm

e sei anelli dal diametro di circa 40 cm (Fig. 5.2.2.A). Tale struttura permette di suddividere il contenitore in 5 ripiani alti circa 30 cm, per un’altezza totale del contenitore di circa un metro e mezzo.

I lanternet sono stati acquistati da una ditta specializzata e messi a disposizione della presente tesi dal Prof. A. Matarrese, referente scientifico del progetto Re.O.Tar.

Ostrea edulis

Gli esemplari di Ostrea edulis usati per il progetto provengono da banchi naturali situati a largo del Golfo di Taranto. Sono stati utilizzati 135 esemplari, provenienti da uno stock di individui della stessa età.

Mytilus galloprovincialis

Gli esemplari di Mytilus galloprovincialis utilizzati sono stati prelevati dagli impianti

di mitilicoltura ospitanti.

Paraleucilla magna

I campioni di Paraleucilla magna introdotti nei lanternet sono stati prelevati da mitili dell’impianto di molluschicoltura ospitante. In particolare sono stati inseriti nei lanternet esemplari di spugna di medie dimensioni (3-5 cm di diametro circa) insediati su mitili.

5.2.3 – Disegno sperimentale

I tre lanternets sono stati allestiti con 9 esemplari di Ostrea edulis per ripiano, per un totale di 45 ostriche per unità sperimentale. In data 3 aprile 2007 le tre unità sperimentali sono state posizionate lungo le ventie di un impianto di mitilicoltura presente nel Mar Grande di Taranto, in località Capo San Vito, a due metri di profondità circa ed a circa due metri l’una dall’altra (Figg. 5.2.3.A, 5.2.3.B).

I tre lanternets sono stati sottoposti a differenti trattamenti:

- nel primo lanternet sono stati introdotti 20 esemplari di Paraleucilla magna di dimensioni paragonabili, e distribuiti nei cinque ripiani, utilizzando esemplari di Mytilus galloprovincialis come veicolo di introduzione (Figg. 5.2.3.C, 5.2.3.D). I

bivalvi non hanno subito alcun tipo di pulizia durante l’intero periodo di sperimentazione;

- nel secondo non sono state introdotte spugne. Anche questo lanternet non ha subito alcun tipo di pulizia durante l’intero periodo di sperimentazione;

- nel terzo, privo di spugne introdotte, i bivalvi sono stati sottoposti mensilmente a interventi di rimozione degli epibionti.

Al momento del posizionamento delle unità sperimentali, ed in seguito con cadenza

bimestrale, sono stati effettuati rilievi biometrici su bivalvi (altezza dell’umbone,

diametro maggiore e diametro minore) (Fig. 5.2.3.E).

Sono stati inoltre misurati il tasso di infestazione di P. magna sulle ostriche e il tasso di mortalità dei bivalvi.

Per valutare il primo sono stati considerati il numero di individui vivi che presentavano individui di P. magna fissati sulle valve.

Inoltre per cercare di stabilire eventuali preferenze dell’infestazione sono state esaminate 50 ostriche selezionate casualmente tra quelle infestate dalla spugna. E’ stata quindi osservata e annotata la posizione della spugna sulla valva. Le spugne ritrovate sono state quindi suddivise in base alla valva infestata (inferiore o superiore) ed in base alla posizione occupata sulla stessa:

- centrale;

- margine posteriore (camera inalante);

- margine anteriore (camera esalante);

- margine dorsale (umbone);

- margine ventrale.

E’ stato contato il numero di individui di O. edulis morti al termine del periodo sperimentale (aprile-ottobre) ed alle date intermedie ed è stato calcolato il tasso di mortalità percentuale con la formula: M = (n° morti ! 100) / (n° totale).

Infine, contestualmente al prelievo dei campioni biologici, è stato effettuato il

rilevamento dei parametri chimico-fisici della colonna d’acqua, in prossimità

dell’impianto sperimentale di Mar Grande, tramite sonda multiparametrica Idronaut

Ocean 7 - 316 plus. L’elaborazione degli stessi è stata effettuata con il software in

dotazione.

5.2.4 – Analisi statistica

Per poter studiare eventuali influenze della presenza della spugna sulla crescita delle ostriche, comunque, sono state condotte tre analisi della varianza (ANOVA) a due fattori sui valori biometrici misurati, considerando separatamente le date di misurazione T0, T1 e T2. I fattori considerati sono stati:

- il fattore trattamento;

- il fattore ripiano (profondità),

e la loro interazione, secondo il seguente schema:

Sorgente Livelli G.d.L

Trattamento 3 2

Profondità 5 4

Tratt. x Prof. - 8

TOTALE - 134

Residuo - 120

L’analisi della varianza è stata usata per testare l’ipotesi nulla H

che i gruppi provengano dalla stessa popolazione e/o da popolazioni che abbiano la medesima media.

Per le analisi che mostravano significative differenze per un fattore sono effettuati confronti multipli attraverso il test di Tukey HSD (Honest Significant Differences). Il test di Tukey permette di creare un set di intervalli di confidenza sulle differenze tra medie dei livelli di un fattore con probabilità di copertura del 95%.

L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software open source “R”.

Figura 5.2.2.A. Lanternet: rappresentazione schematica e foto.

Figura 5.2.3.A. Rappresentazione schematica dell’impianto sperimentale.

Figura 5.2.3.B. Foto subacquea dell’impianto sperimentale.

Figura 5.2.3.C. Esemplare di Mytilus galloprovincialis infestato da

Paraleucilla magna.

Figura 5.2.3.D. Foto subacquea del lanternet I.

Figura 5.2.3.E. Raccolta dei parametri biometrici di Ostrea edulis: diametro