4. RISULTATI
4.1 Disegno sperimentale
Sieri di gatti sottoposti a vaccinazione prime-boost sono stati utilizzati per valutare la presenza di NAb diretti contro FIV mediante saggi di neutralizzazione tradizionali e di ultima generazione.
Il primo metodo ha previsto l’utilizzo del virus wild-type e della linea cellulare MBM suscettibile all’infezione con FIV mentre il secondo saggio è stato allestito impiegando la linea cellulare CRFK CD134+ e particelle virali pseudotipizzate con la glicoproteina di superficie Env di FIV. Lo pseudovirus è stato prodotto mediante vettori FIV- derivati basandosi sul sistema split-component il quale prevede la suddivisione del genoma virale in tre costrutti. Un plasmide chiamato packaging che codifica le proteine strutturali ed enzimatiche, un costrutto envelope che esprime l’Env ed un plasmide (vettore) che veicola il gene reporter luciferasi. Quest’ultimo costrutto è stato costruito a partire dal plasmide LAW34GFP già presente nel nostro laboratorio.
Sono state inoltre prodotte particelle virali pseudotipizzate con la glicoproteina G del virus della stomatite vescicolare esprimenti sempre la luciferasi ed impiegate come controllo positivo nel saggio di trasduzione.
4.2 Produzione del plasmide vettore codificante luciferasi
4.2.1 Amplificazione del gene luciferasi
Il gene reporter luciferasi (Luc) è stato amplificato mediante PCR partendo dal vettore commerciale pGL3 utilizzando i primer BglII S ed ECORV A contenenti all’estremità 5’ siti di taglio per gli enzimi BglII ed ECORV (§ 3.2.1).
L’avvenuta amplificazione del frammento, lungo 1600 bp, è stata controllata su gel d’agarosio dopo corsa elettroforetica (Fig. 4.1).
Figura 4.1: Amplificazione del gene reporter luciferasi.
4.2.2 Clonaggio del gene luciferasi nel plasmide LAW34GFP
L’amplificato ed il plasmide LAW34GFP sono stati digeriti con gli enzimi di restrizione BglII ed ECORV; in questo modo il vettore è stato linearizzato mediante distacco della GFP (700 bp) (§ 3.2.2); inserto e vettore sono stati quindi ligati come descritto nel paragrafo 3.2.3 (Fig. 4.2).
Per verificare l’avvenuta inserzione del frammento di interesse nel plasmide LAW34GFP, le colonie ottenute dalla trasformazione sono state sottoposte a screening mediante amplificazione con i primer ScrEC S e ScrEC AS (dati non mostrati) (§
3.2.5). Dalla ligazione è stato selezionato un clone buono denominato LAW34Luc.
+
LAW34GFP LAW34GFP BglII
BglII EcoRV EcoRV
LAW34GFP LAW34GFP BglII
BglII EcoRV EcoRV
1600 bp 1600 bp
LucLuc Marker 1 Kb Marker
1 Kb
EcoRV EcoRV BglII
BglII
Luc EcoRV EcoRV BglII
BglII BglII Luc BglII
Luc
Digestione
EcoRV AS EcoRV AS BglII S Luc
BglII S
EcoRV AS EcoRV AS BglII S Luc
BglII SBglII S Luc BglII S
LAW34Luc LAW34Luc Ligation
Per ottenere un ulteriore conferma dell’avvenuto inserimento del gene Luc nel vettore, il DNA plasmidico, estratto dalla colonia positiva per PCR, è stato digerito con gli enzimi BglII ed ECORV (§ 3.2.6). I risultati ottenuti dalla digestione sono indicati in figura 4.3. Come si può osservare, dal plasmide LAW34Luc è stata staccata una banda di 1600 bp rappresentante il gene luciferasi.
Figura 4.3: Digestione del clone LAW34Luc con gli enzimi BglII ed ECORV.
4.3 Produzione particelle virali FIV-Luc e VSV-G/Luc
Le particelle virali VSV-G/Luc e FIV-Luc sono state prodotte mediante cotrasfezione del costrutto packaging, costrutto vettore LAW34Luc e specifico plasmide envelope, nella linea cellulare CrFK come descritto nel paragrafo 3.4 (Fig. 4.4).
Figura 4.4: Plasmidi utilizzati per produrre particelle virali FIV-Luc e VSV-G/Luc. Dall’alto in basso: costrutto packaging, plasmide vettore LAW34Luc ed i due costrutti envelope.
rev
gag pol
vif
ORF A
Δenv
Δψ
CMV RRE polyABGH
rev
gag pol
vif
ORF A
Δenv
Δψ CMV
CMV RRE polyABGH
ψ
gag
RRE
CMV R U5 CMV Luc WPRE Sin R U5
ψ
gag
RRE CMV
CMV RR U5U5 CMVCMV LucLuc WPRE Sin RR U5U5
1600 bp 1600 bp
Marker 1 Kb Marker
LAW34Luc 1 Kb
dig.
LAW34Luc
dig. LAW34LucNo dig.
LAW34Luc No dig.
CMV VSV -G
CMV VSV -G
CMV
CMV VSV -GVSV -G
CMV VSV -G
CMV VSV -G
CMV
CMV VSV -GVSV -G CMVCMVCMVCMVCMVCMV EnvEnvEnvEnv
L’efficienza di trasfezione è stata rilevata mediante luminometro ed espressa come attività luciferasica (RLU); il background è stato calcolato mediante un controllo negativo (Kc) costituito dalle sole CrFK (§ 3.6). Per le cellule trasfettate con VSV- G/Luc è stata misurata un’espressione di luciferasi pari a 3,3 × 106 RLU mentre per le CrFK trasfettate con FIV-Luc è stato ottenuto un valore di 3,1 × 105 RLU (Fig. 4.5).
Possiamo quindi concludere che tutti i costrutti una volta trasfettati esprimono il gene reporter in modo efficiente.
Figura 4.5: Efficienza di trasfezione ed espressione di Luc dei costrutti prodotti. Kc=350 RLU (non mostrato).
4.4 Saggio di trasduzione
Le particelle virali VSV-G/Luc e FIV-Luc, raccolte dal sovranatante delle cellule trasfettate, sono state testate per capacità di trasdurre le linee cellulari CrFK CD134+ e CrFK, quest’ultima utilizzata come controllo negativo in quanto non possiede il recettore FIV. Lo pseudovirus VSV-G/Luc è stato invece impiegato come controllo positivo di trasduzione (§ 3.5).
L’efficienza del saggio è stata valutata come attività luciferasica espressa in RLU ed il background è stato calcolato mediante un controllo negativo costituito dalle sole CrFK CD134+ e CrFK (Kc). I risultati ottenuti sono mostrati in figura 4.6.
0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000
CrFK
RLU VSV-G
Env
CrFK 1×106
1,5×106 3,5×106 3×106
5×105 2,5×106 2×106
0
VSV-G Env
0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000
CrFK
RLU VSV-G
Env
0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000
CrFK
RLU VSV-G
Env
CrFK 1×106
1,5×106 3,5×106 3×106
5×105 2,5×106 2×106
0
VSV-G Env
Le cellule CrFK CD134+ trasdotte con VSV-G/Luc mostrano un’espressione di luminescenza pari a 4,8 × 105 RLU mentre nella trasduzione delle stesse cellule con FIV-Luc si ottiene un valore di 1,3 × 105 RLU.
Nel saggio allestito con la linea cellulare CrFK, l’efficienza di trasduzione delle particelle VSV-G/Luc è sempre molto alta e pari a 4,7 × 105 RLU mentre quella delle particelle FIV-Luc è risultata come atteso, piuttosto ridotta (1 × 104 RLU). I risultati indicano quindi un’elevata capacità delle particelle VSV-G/Luc di trasdurre entrambi gli istotipi cellulari mentre le particelle FIV-Luc sono in grado di trasdurre in modo efficiente solo la linea cellulare CrFK CD134+ (Fig. 4.6).
Figura 4.6: Efficienza di trasduzione delle particelle virali VSV-G/Luc e FIV-Luc sugli istotipi cellulari CrFK e CrFK CD134+. Non mostrati nei grafici i valori Kc che hanno rispettivamente il valore di 412 RLU e 382 RLU.
4.5 Saggio di neutralizzazione
Il saggio di neutralizzazione di nuova generazione ha previsto l’impiego sia della linea cellulare CrFK CD134+ sia dello pseudovirus FIV-Luc sostituendo nel test classico la linea MBM ed il virus wild-type. Per valutare l’attendibilità della nuova metodica gli stessi sieri sono stati testati in parallelo con il saggio tradizionale e col nuovo metodo.
0 100000 200000 300000 400000 500000
1 2
RLU VSV-G
Env
1×105 3×105
0
VSV-G
2×105 Env
4×105 5×105
CrFK CrFK CD134+
0 100000 200000 300000 400000 500000
1 2
RLU VSV-G
Env
1×105 3×105
0
VSV-G
2×105 Env
4×105 5×105
CrFK CrFK CD134+
I campioni di siero sono stati prelevati al momento del challenge da 7 gatti (GC, GD, GE, GF, GG, GH e GI) sottoposti ad una vaccinazione di tipo prime-boost e da 2 animali utilizzati come controllo nella vaccinazione (gatti mock: GK e GM) (§ 3.1). In particolare sono state testate 4 diverse diluizioni seriali per ogni campione: 1:32, 1:64, 1:128 e 1:256.
L’attività neutralizzante dei sieri è stata calcolata mediante lettura al luminometro (test di nuova generazione) o saggio RT (test tradizionale) ed il titolo è stato espresso come l’ultima diluizione alla quale si ha riduzione di infettività uguale o maggiore del 50%
(neutralizzazione significativa).
I sieri GC, GE, GH, GI e GD possiedono una discreta attività neutralizzante visto che l’ultima diluizione riscontrata è 1:256 per i primi quattro campioni ed 1:32 per GD.
Come mostrato in tabella 4.1 i titoli neutralizzanti ottenuti mediante il saggio di ultima generazione sono stati confermati con la metodica classica.
Tabella 4.1 Titolo neutralizzante dei sieri prelevati dai gatti vaccinati (GC, GD. GE, GF, GG, GH e GI) e mock vaccinati (GK e GM) espresso come l’ultima diluizione che riduce
GI GH GG GF GE GD
GC
1:256 1:2561:32 1:32
1:256 1:256
1:64 1:128
1:128 1:32
1:256 1:256
1:256 1:256 SIERI Test classico Test di ultima
generazione
VACCINATIMOCK
GK
GM
< 1:32 < 1:32
< 1:32
< 1:32
GI GH GG GF GE GD
GC
1:256 1:2561:32 1:32
1:256 1:256
1:64 1:128
1:128 1:32
1:256 1:256
1:256 1:256 SIERI Test classico Test di ultima
generazione
VACCINATIMOCK
GK
GM
< 1:32 < 1:32
< 1:32
< 1:32
Per i sieri GF e GG il titolo neutralizzante è rispettivamente 1:64 ed 1:32 con il test tradizionale ed 1:128 con il saggio di ultima generazione.
Con lo scopo di ottenere un’ulteriore conferma della validità del nuovo test anche i sieri dei gatti mock sono stati testati con le due metodiche alla sola diluizione di 1:32.
Con entrambi i saggi, i sieri GK e GM non presentano attività neutralizzante significativa (Tab. 4.1).
Nell’insieme tutti i risultati ottenuti sottolineano l’affidabilità del test di nuova generazione.
