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Sardegna FESR 2014/2020 - ASSE PRIORITARIO I
“RICERCA SCIENTIFICA, SVILUPPO TECNOLOGICO E INNOVAZIONE”
Azione 1.1.4 Sostegno alle attività collaborative di R&S per lo sviluppo di nuove tecnologie sostenibili, di nuovi prodotti e servizi
Progetto COMISAR “COltivazione di ceppi MIcroalgali SARdi per applicazioni innovative nei settori agro- alimentare, nutraceutico, cosmetico e ambientale”
Organismo di Ricerca: Centro di Ingegneria e Scienze Ambientali (CINSA) e Centro di Ricerca Sviluppo e Studi Superiori in Sardegna (CRS4)
Progetto Cluster Top Down: COltivazione di ceppi MIcroalgali SARdi per applicazioni innovative nei settori agro-alimentare, nutraceutico, cosmetico e
ambientale (COMISAR)
Rapporto tecnico sul WP-3 Ottimizzazione dei terreni di
coltura.
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WP-3. Ottimizzazione dei terreni di coltura
A seguito dell’identificazione dei ceppi algali sardi da investigare e della categoria di biomolecole da estrarre ai fini della valorizzazione sul mercato dei prodotti nutraceutici e cosmetici come riportato nel rapporto tecnico relativo al WP-2, nell’ambito del WP-3 è stato individuato il mezzo di coltura in cui coltivare i ceppi in oggetto. L’obiettivo era quello di capire quale mezzo di coltura fosse più adatto a garantire la più veloce replicazione dei ceppi a seguito di stimolo luminoso ma anche il massimo rateo di biosintesi dei composti da valorizzare, ossia di lipidi e acidi grassi, compatibilmente con i crismi di qualità del prodotto stesso ma anche di sostenibilità economica del processo di coltivazione stesso. Per questo motivo si è deciso di articolare il WP nel modo riportato in Figura 1.
Figura 1. Schema a blocchi dell’articolazione dell’obiettivo realizzativo WP-3
Prima si è deciso di individuare in letteratura almeno tre mezzi di coltura tipicamente utilizzati per coltivare le alghe verdi e di seguito scegliere, sulla base di considerazioni prettamente biochimiche, uno di questi con cui condurre le successive prove sperimentali. In seguito, si è cercato di capire quali potessero essere i cambiamenti da apportare nel mezzo al fine di renderlo il meno costoso possibile. Infatti, nei processi di produzione delle alghe su scala industriale, la realizzazione del mezzo di coltura a partire da reagenti di sintesi costituisce una voce di costo non indifferente che
Ottimizzazione dei terreni di coltura
WP-3.1 Individuazione di
specifiche composizioni del terreno di coltura in grado di indirizzare il
metabolismo algale verso la produzione di
composti ad alto valore aggiunto.
WP-3.2 Individuazione di nuovi mezzi di coltura
che consentano la limitazione dei costi
operativi della coltivazione.
WP-3.3
Verificare l’uso di CO2 da gas di scarico per arricchire in carbonio il mezzo di coltura necessario alle alghe
per la fotosintesi.
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può influire in maniera sostanziale sulla sostenibilità economica del processo. Infine, il progetto prevedeva una fase di individuazione di studio della possibilità di utilizzare CO2 da gas di scarico per fornire il carbonio necessario alla crescita algale. Come meglio precisato però tale pratica è impedita dalla normativa italiana quando si vogliano utilizzare le alghe nel settore nutraceutico e/o alimentare e/o cosmetico ma solo nel settore biocarburanti e bio-lubrificanti che non sono stati riconosciuti essere strategici nell’ambito del WP-2 in relazione ai ceppi algali scelti.
WP-3.1. Individuazione di specifiche composizioni del terreno di coltura in grado di indirizzare il metabolismo algale verso la produzione di composti ad alto valore aggiunto.
Parte integrante dell’attività svolta nell’ambito del primo semestre è stata la preparazione dei terreni di coltura ed il mantenimento delle colture algali della SCCA per la ricerca di base e gli usi applicativi.
Di seguito si riportano i terreni di coltura principalmente utilizzati: Bold’s Basal Medium (Bold 1949;
Bischoff & Bold 1963); Waris-H (McFadden & Melkonian 1986); BG11-H (Stanier et al. 1971).
Tabella 1. Composizione del mezzo di coltura BG11-H
Composto Concentrazione finale (mg L-1)
Macronutrients
NaNO3 1500
CaCl2.7H2O 36
MgSO4-7H2O 75
K2HPO4 40
Citric Acid 6
Na2CO2 20
NA2EDTA 1
Ferric ammonium citrate 6
Microelement nutrient
H3BO3 2.86
ZnSO4 7 H2O 0.222
MnCL2 4 H2O 1.81
Na2MoO3 2 H2O
CuSO4 5H2O 0.079
Co(NO3)2 6H2O 0.0494
4/11 Tabella 2. Composizione del mezzo di coltura WARIS-H (McFadden & Melkonian 1986)
Composto Concentrazione
Stock Solution
Volume da aggiungere per L di coltura
1. HEPES (1.00 mM) 238.10 g / l dH2O 1.ml
2. KNO3 (1.00 mM) 100.00 g / l dH2O 1 ml
3. MgSO4 x 7 H2O (81.1 µM) 20.00 g / l dH2O 1 ml
4. (NH4)2HPO4 (0.15 mM) 20.00 g / l dH2O 1 ml
5. Ca(NO3)2 x 4 H2O (0.42 mM) 100.00 g / l dH2O 1 ml
6. Vitamin Solution 1 ml
Vitamin B12 (0.15 nM) 0.20 mg / l dH2O
Biotin (4.10 nM) 1.00 mg / l dH2O
Thiamine-HCl (0.30 µM) 100.00 mg / l dH2O Niacinamide (0.80 nM) 0.10 mg / l dH2O
7. P-II Metals 1 ml
EDTA (Titriplex III) (8.06 µM) 3.00 g / l dH2O H3BO3 (18.43 µM) 1.14 g / l dH2O MnCl2 x 4 H2O (0.73 µM) 144.00 mg / l dH2O ZnSO4 x 7 H2O (73.00 nM) 21.00 mg / l dH2O CoCl2 x 6 H2O (16.80 nM) 4.00 mg / l dH2O
8. Fe-EDTA 1 ml
EDTA (Titriplex II) (17.86 µM) 5.22 g / l dH2O FeSO4 x 7 H2O (17.90 µM) 4.98 g / l dH2O
1 N KOH 54.00 ml / l dH2O
EDTA (Titriplex II) and FeSO4 x 7 H2O is heated for 30 min (100oC); KOH is added to the cooled mixture.
9. Soil extract 10 ml
5/11 Tabella 2. Composizione del mezzo di coltura BBM (Bold 1949; Bischoff & Bold 1963))
Composto
Concentrazione Stock Solution (g L-1)
Volume di stock
solution per L coltura (mL) Concnetrazione Finale (M) Macronutrients
NaNO3 25 10 2.90E-03
CaCl2.2H2O 2.5 10 1.70E-04
MgSO4-7H2O 7.5 10 3.04E-04
K2HPO4 7.5 10 4.31E-04
KH2PO4 17.5 10 1.29E-03
NaCl 2.5 10 4.28E-04
Alkaline EDTA solution 1
EDTA 50 1.71E-04
KOH 31 5.53E-04
Acidified iron solution 1
FeSO4.7H2O 4.98
H2SO4 1.79E-05
Boron solution 1
H3BO3 11.42 1.85E-04
Trace metals solution 1
ZnSO4 7 H2O 8.82 3.70E-05
MnCL2 4 H2O 1.44 7.28E-06
MoO3 0.71 4.93E-06
CuSO4 5H2O 1.57 6.29E-06
Co(NO3)2 6H2O 0.49 1.68E-06
Come tutte le alghe verdi la C. melkonianii accumula amido come carboidrato di riserva, però, se coltivata in condizioni operative specifiche, è in grado di immagazzinare una notevole quantità di lipidi e acidi grassi. A tal proposito è stato individuato il mezzo di coltura più adatto per la coltivazione del ceppo C. melkonianii su scala di laboratorio. Questo è stato dimostrato attraverso l’analisi metabolomica effettuata nell’ambito del WP-2 che ha messo in evidenza la presenza di significative quantità di acidi grassi nella cellula (ca 15 %wt). Tale categoria di composti, ossia acidi grassi e lipidi sono stati scelti come composto utile da valirzzare sul mercato. Perciò, tra i tre mezzi presi in considerazione si è proceduto a scegliere quello che poteva massimizzare la produttività lipidica.
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Dalla letteratura (Concas et al., 2016) è noto che la crescita in condizioni di deprivazione da azoto può incrementare la biosintesi di lipidi in seguito ai fenomeni biochimici sinteticamente riportati in Figura 2.
Figura 2. Meccanismi coinvolti nella sintesi lipidica in relazione alla disponibilità di azoto nel mezzo di coltura. Si può notare che prima la concentrazione d’azoto è ridotta in fase liquida e prima il metabolismo algale è indirizzato verso la sintesi lipidica.
In sintesi, quando l’alga cresce in un mezzo carente d’azoto il rateo a cui introita carbonio grazie alla fotosintesi diventa maggiore del rateo con il quale la stessa cellula assorbe l’azoto. All’interno della cellula si produce uno sbilanciamento tra i contenuti di azoto e carbonio tale per cui il rapporto stechiometrico tra i due non soddisfa quello necessario per effettuare la sintesi proteica. Questo determina un accumulo di carbonio nella cellula. Il carbonio in eccesso anche grazie all’energia fornita dalla fotosintesi viene utilizzato quindi per produrre carboidrati di riserva come amido e lipidi che risultano utili nei processi biochimici in cui è richiesta energia (mitosi e citochinesi, contrasto dell’attività ossidante di radicali, etc.). L’esito è quindi un accumulo di lipidi.
Di conseguenza per massimizzare la produttività lipidica è stato scelto tra i tre mezzi considerati quello che garantiva le minori concentrazioni d’azoto ossia il BBM (Bold’s Basal Medium), Tale mezzo è stato quindi utilizzato in tutte le successive fasi del progetto.
Dopo l’individuazione del mezzo sono state effettuate prove sperimentali in foto-bioreattori batch con mezzi di tipo BBM nei quali veniva variata la concentrazione d’azoto per verificare le risposte dell’alga sarda C. melkonianii in termini di concentrazione lipidica totale. L’obiettivo era di ottimizzare
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il mezzo di coltura individuando la concentrazione di azoto che massimizzava la produzione lipidica.
Nella fattispecie sono state effettuate delle prove di crescita in bottiglie da 2 litri riempite con terreno di coltura (BBM standard o modificato) e, per garantire la riproducibilità dei risultati, ogni prova sperimentale è stata ripetuta due volte. Per mantenere la sterilità del campione è stato preparato un tappo di garza e cotone necessario a chiudere la bottiglia ed uno strato di carta stagnola (che chiude la bottiglia coprendola fino al collo). I terreni sono stati sterilizzati in autoclave a 121°C e l’inoculo è stato fatto sotto una cappa a flusso laminare. Durante le prove sperimentali è stata variata la concentrazione di azoto utilizzando BBM con 1/5 di Nitrato di Sodio (NaNO3) e BBM con 5 volte di Nitrato di Sodio (NaNO3). A fine coltivazione è stata calcolata valutata la concentrazione di biomassa algale mediante tecniche spettrofotometriche meglio spiegato nel rapporto relativo al WP-4 mentre per l’analisi del contenuto lipidico sono state utilizzate tecniche colorimetriche basate sull’utilizzo di sulfovanillina. I risultati di tali prove di crescita sono sintetizzati nei grafici in Figura 3.
1/5N BBM 5N
10 20 30 40
50 Contenuto lipidico
qL , (% wt)
1/5N BBM 5N
0.0 0.5 1.0 1.5
Concentrazione biomassa
Cx, (g L-1)
1/5N BBM 5N
15 20 25
Concentrazione lipidi
CL , (g L-1 )
Figura 3. Effetto della variazione di azoto nel mezzo BBM sul contenuto lipidico intracellulare (a), la concentrazione di biomassa algale (b) e la concentrazione totale di lipidi (b).
Come atteso, dalla figura 3-a si può notare che il massimo contenuto intracellulare di lipidi (ca 40
%wt) si otteneva con le concentrazioni minime di azoto, ossia con il mezzo 1/N. Tale aspetto era tra l’altro confermato dal fatto che, passando da 1/5N a N (BBM) e poi a5N si poteva osservare una progressiva riduzione del contenuto intracellulare di azoto. La carenza di azoto nel mezzo 1/5N si ripercuoteva però, in maniera importante, anche sulla crescita cellulare. Infatti, come si può notare dalla Figura 3-b la concentrazione di biomassa algale ottenuta utilizzando 1/5N era piuttosto bassa.
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Questo è dovuto al fatto che essendo troppo bassa la concentrazione d’azoto le cellule non sono in grado di sintetizzare quelle proteine che le consentono di replicarsi e quindi espandersi. Di conseguenza all’aumento del contenuto intracellulare di lipidi faceva da contraltare una riduzione della concentrazione di biomassa. Come si vede dalla Figura 3 questa grandezza invece cresceva al crescere della concentrazione di azoto nel mezzo. La concentrazione totale di lipidi nel reattore a fine coltivazione, valutata come prodotto della concentrazione di alghe per il loro contenuto intracellulare di lipidi stessi, è riportata in Figura 3. Come si vede in questo caso il mezzo di coltura che consente di ottenere le migliori prestazioni è costituito proprio dal BBM tal quale. Quindi, la massimizzazione della concentrazione totale di lipidi prodotta si ottiene con un valore di concentrazione di azoto che costituisce un compromesso tra la sintesi intracellulare e la crescita cellulare. In definitiva, questa analisi consente di confermare ulteriormente che il mezzo di coltura ottimale per la produzione di lipidi mediante l’alga Coccomyxa melknonianii è costituito dal BBM nella sua formulazione originale. Tale mezzo è stato utilizzato quindi come base-case in tutta la sperimentazione trattata nelle parti seguenti del documento.
WP-3.2. Individuazione di nuovi mezzi di coltura che consentano la limitazione dei costi operativi della coltivazione.
Coccomyxa melkonianii SCCA 048 è stata descritta come una specie nuova per la scienza e classificata come una microalga estremofila capace di tollerare alte concentrazioni di metalli pesanti (Malavasi et al., 2016). Questo aspetto rappresenta un vantaggio competitivo rispetto ad altri organismi che non sono in grado di sopravvivere in condizioni simili. Infatti, questa caratteristica consentirebbe l’adozione di particolari strategie di coltivazione in sistemi aperti che limiterebbero notevolmente i costi di realizzazione e gestione degli impianti.
Nell’ambito delle attività di ricerca COMISAR, sono state variate le concentrazioni di azoto e il pH del mezzo di coltura sopra riportato, al fine di individuare le condizioni che potessero ottimizzarne la crescita in sistemi di coltivazione aperti come gli Open Ponds (OP) o gli Open Raceways (OR). Gli
“Open Ponds” e gli “Open Raceways” infatti, pur essendo particolarmente semplici da realizzare e da gestire, e di conseguenza meno dispendiosi degli equivalenti sistemi chiusi (fotobioreattori), sono soggetti a fenomeni di contaminazione da batteri e altri organismi competitori che ne riducono la
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produttività algale e quindi la convenienza generale. Con i ceppi estremofili si possono adottare condizioni di coltivazione quali per esempio mezzi di coltura molto acidi e/o molto basici, non tollerate dagli organismi competitori, che pertanto non sono in grado di esplicare la loro azione inibente e/o limitante sulla crescita del ceppo target. Questo consentirebbe di evitare la contaminazione e sfruttare quindi “Open Ponds” e/o “Open Raceways” con tutti i vantaggi economici che ne deriverebbero, ossia semplicità di realizzazione e gestione e abbattimento di costi di investimento e operativi in particolare quelli energetici.
A tal fine sono stati valutati, con le modalità meglio precisate nelle successive sezioni del documento, il pH ottimale del mezzo di coltura e i valori di pH estremi entro i quali la crescita del ceppo avviene con una produttività ancora accettabile. Tale attività ha mostrato che, sebbene il ceppo presenti un optimum della velocità di crescita in mezzi con pH vicini alla neutralità (pH = 6,8), esso riesca a crescere con velocità discrete anche a valori di pH estremi sia in senso acido (pH = 4,0) sia in senso basico (pH = 8,0) per cui ben si adatta all’applicazione delle strategie di coltivazione selettive nei sistemi aperti sopra descritti. Si può quindi affermare che C. melkonianii non mostra differenze significative nel tasso di crescita se coltivata a pH compresi tra 4,0 e 8,0; di conseguenza questo risultato indica la sua alta adattabilità a crescere in terreni di coltura a valori di pH più alti e più bassi rispetto al suo optimum.
Pertanto, lo stesso mezzo di coltura BBM, opportunamente condizionato per avere in modo da avere pH molto bassi (ca 4 – 5) o molto alti (ca 9-10), consentirebbe la limitazione dei costi di gestione permettendo la coltivazione in sistemi estremamente economici come gli open ponds o gli open racewyas.
Un ulteriore riduzione dei costi associati alla coltivazione delle alghe potrebbe aversi utilizzando acque reflue domestiche o agricole come sorgenti di macronutrienti quali azoto e fosforo. Questo consentirebbe infatti la limitazione dei costi associati all’acquisto dei reagenti di sintesi quali NaNO3
o H2PO4 necessari alla realizzazione del BBM. Tale ipotesi è stata validata effettuando opportune prove sperimentali di crescita di un ceppo non sardo noto come Pseudochloris wilhelmii in una miscela di acqua di mare e simulanti di acque reflue. I risultati di questa attività, opportunamente pubblicati su articoli scientifici allegati alla presente in cui era ringraziato il progetto COMISAR, hanno consentito di validare l’ipotesi di utilizzo delle acque reflue per coltivare le alghe in un contesto di impianto che accanto alla depurazione delle stesse acque prevedeva la valorizzazione della
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biomassa microalgae prodotta come materia prima per biocarburanti, lubrificanti o altri chemicals non destinati al consumo umano, secondo lo schema riportato in Figura 4.
Figura 4. Schema per l’utilizzo di acque reflue per coltivazione delle alghe con depurazione delle prime e contestuale produzione di composti valorizzabili (cf. Concas et al., 2109).
Tale schema non è però proponibile quando si vogliano coltivare alghe al fine del consumo umano e pertanto non risulta applicabile al ceppo sardo preso in esame per cui si era prevista la valorizzazione dei lipidi nel settore nutraceutico, alimentare e cosmetico. La normativa Italiana infatti impedisce l’utilizzo in questi settori di prodotti biologici ottenuti utilizzando rifiuti come sorgente di nutrienti per le cellule. Pertanto, sebbene l’ipotesi operativa in Figura 4 ipotizzata in sede di progetto per limitare i costi di realizzazione del mezzo di coltura, risulti percorribile quando si vogliano produrre biocarburanti, bio-lubrificanti, bioplastiche etc., essa non si presta alla casistica in esame nel progetto, ossia l’utilizzo della C. melkonianii per produrre lipidi da commercializzare nel settore nutraceutico, alimentare e cosmetico. Non è stata pertanto svolta attività sperimentale in questo senso con un ceppo sardo. Tuttavia, per ottemperare alle indicazioni progettuali, tale attività è stata svolta con un altro ceppo che ha fornito i risultati abbastanza promettenti riportati nella pubblicazione allegata alla presente (Concas et al, 2019) in cui è stato ringraziato il progetto COMISAR e Sardegna Ricerche come ente finanziatore dell’attività.
Primary clarifier
Secondary clarifier Aeration Tank
WW
Anaerobic digester
Photobioreactors / Open raceways
Lipid extraction Recycled sludge Sludge Sludge
Algae Exausted
algae
Algae harvesting Methane
Compost
Lipids Water discharge
N, P, S removal Oxygen
Carbon dioxide
Biofuels Lubricants Other chemicals
Seawater
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WP-3.3. Verificare l’uso di CO2 da gas di scarico per arricchire in carbonio il mezzo di coltura necessario alle alghe per la fotosintesi.
Per le stesse motivazioni addotte nel WP-3.2 tale attività non è stata effettuata con il ceppo sardo perché i gas di scarico sono considerati a tutti gli effetti rifiuti e pertanto non utilizzabili, ai termini idi legge, per la produzione di composti da destinare al mercato alimentare, nutraceutico e cosmetico.
L’ipotesi risulta comunque percorribile quando si vogliano produrre prodotti da destinarsi a mercati differenti da questi ultimi.
Conclusioni
In ultima istanza, l’attività svolta nell’ambito del WP-3 ha consentito di stabilire che il mezzo di coltura d’elezione per la coltivazione di C. melkonianii al fine della produzione di lipidi da destinarsi ai mercati di cui sopra, è costituito dal BBM eventualmente acidificato o basificato qualora si effettui la coltivazione in sistemi aperti a basso costo come “open ponds” o “open raceways”.
Bibliografia
Bischoff H. W., Bold H. C., 1963 - Phycological studies. IV. Some soil algae from Enchanted Rock and related algal species. University of Texas Publications 6318: 1-95.
Bold H.C., 1949 - The morphology of Chlamydomonas chlamydogama sp. nov.. Bull. Torrey Bot. Club. 76: 101 - 108.
Concas A., Lutzu G.A., Pisu M. and Cao G., 2019 - Biofuel production from Pseudochloris wilhelmii cultivated in sea-wastewater mixtures: modeling and experiments - J. Environ. Chem. Eng., vol.7 (5), 103301
McFadden G. I., Melkonian M., 1986 - Culture Medium Waris-H. Phycologia 25: 551-557.
Stanier R. Y., Kunisawa R., Mandel M., Cohen-Bazire G., 1971 - Purification and properties of unicellular blue- green algae (Order Chroococcales). Bacteriol. Rev. 35: 171-205.
Il sottoscritto ______________________________________ in qualità di Responsabile scientifico del progetto Cluster Top Down
Timbro e Firma_________________________________ Data __________________________
