Materiali e Metodi
Sequenze primers:
Xotx5 87 NS F: GTGCAGGTCTGGTTTTAAAACAGAAGGGCAAAATG Xotx5 87 NS R: CATTTTGCCCTTCTGTTTTAAAACCAGACCTGCAC
2.5 Embrioni di Xenopus laevis
(Newport e Kirschner, 1982)
Gli embrioni utilizzati sono stati ottenuti mediante la fecondazione in vitro. Il maschio viene anestetizzato immergendolo in una soluzione allo 0,1% di MS-222 (metansulfonato dell’estere etilico dell’acido 3-aminobenzoico), prima di essere operato per la rimozione dei testicoli. I testicoli possono essere conservati per qualche giorno a 4°C in MMR 1X e gentamicina (20 µg/ml).
Le femmine di Xenopus laevis vengono prestimolate con 100 UI di Folligon Intervet per uso veterinario, da 4 a 11 giorni prima della deposizione e con 800/1000 UI di Profasi HP 5000 Serono (gonadotropina corionica) 12-15 ore prima della deposizione; entrambi gli ormoni vengono somministrati tramite iniezione nel sacco perilinfatico.
La stimolazione con Profasi viene effettuata di sera e le femmine stimolate iniziano a deporre dopo circa 12 ore. Le uova da fecondare vengono ottenute esercitando una leggera pressione sull’addome degli animali e vengono raccolte in piastre Petri, contenenti MMR 0,1X. La fecondazione è effettuata tramite omogenato di testicolo in MMR 1X, disposto sulle uova da fecondare. L'avvenuta fecondazione è evidenziata dal fenomeno della rotazione corticale.
Materiali e Metodi
Dopo almeno 25 minuti dalla fecondazione, gli embrioni vengono privati del loro rivestimento gelatinoso, mediante un trattamento con la soluzione degelificante, contenente DTT (ditiotreitolo). L’MMR 0,1X viene rimosso e sostituito con la soluzione di “dejelling”, in cui gli embrioni vengono lasciati per circa 5 minuti e, comunque, fino a che non sia evidente la perdita del rivestimento gelatinoso. A questo punto, la soluzione di DTT viene eliminata sciacquando le uova fecondate in MMR 0,1X.
Gli stadi embrionali sono stati identificati secondo i criteri di Nieuwkoop e Faber (1967). Soluzioni: MMR NaCl 0,1 M KCl 2 mM MgSO4 1 mM CaCl2 2 mM HEPES 5 mM pH 7.8 EDTA 0,2 M Soluzione degelificante DTT 3,2 mM Tris-HCl 0,2 M pH 8.8
In genere si preparano stocks sterili di una soluzione 10X dei sali che viene diluita aggiungendo, inoltre, la formaldeide, al momento dell’uso.
