6. Materiali e metodi

6. Materiali e metodi

Gli esperimenti sono stati condotti su preparati di colon distale prelevati da ratti Sprague–Dawley maschi dal peso medio di 250 g. Gli animali sono stati alloggiati, due unità per gabbia, in ambiente a temperatura di 22-24°C, umidità controllata del 50-60%, alimentati con mangime standard del commercio ed acqua di rubinetto ad libitum e sottoposti ad esposizione alla luce per 12 ore al giorno. La stabulazione degli animali è stata eseguita in ottemperanza alle norme contenute nella Direttiva n° 86-60 della Comunità Economica Europea, riconosciuta ed adottata in Italia.

6.2 Induzione e sviluppo della lesione nigro-striatale

La MP è stata indotta mediante l’utilizzo della neurotossina 6-OHDA, in grado di causare lesioni nella substantia nigra. Gli animali sono stati anestetizzati con 50 mg/kg di sodio tiopentale e posti su telaio stereotassico. La 6-OHDA è stata solubilizzata in soluzione fisiologica contenente acido ascorbico allo 0,02 % e iniettata unilateralmente in due siti del fascio mediale destro del prosencefalo, secondo le seguenti coordinate (mm): (I) AP: -4,0, ML: -0,8, DV: -8,0 (3 µl); (II)

AP: -4,4, ML: -1,2, DV: -7,8 (2,5 µl) (Paxinos and Watson, 1998). Le iniezioni sono state eseguite alla velocità di 1 µl/min. Dopo l’iniezione l’ago è stato lasciato in situ per 5 minuti per consentire la completa diffusione della sostanza e successivamente la ferita è stata suturata. L’area controlaterale non trattata è servita da controllo interno. Gli animali di controllo sono stati sottoposti ad iniezione di soluzione fisiologica contenente acido ascorbico allo 0,02 %. Le indagini sperimentali sono state effettuate dopo 4 e 8 settimane dall’induzione della lesione.

6.3 Analisi funzionale dell’attività contrattile intestinale

L’attività contrattile della muscolatura liscia longitudinale e circolare del colon distale è stata analizzata mediante l’utilizzo di trasduttori isometrici e acquisita con programma Biopac System. I preparati di colon, di lunghezza di circa 20 mm, sono stati posti in bagni per organi isolati contenenti soluzione di Krebs, mantenuta ad una temperatura di 37°C e gorgogliata con una miscela al 95% di O2 e 5% di CO2. La soluzione di

Krebs presentava la seguente composizione (mM): NaCl 113, KCl 4,7, CaCl2 2,5, KH2PO4 1,2, MgSO4 1,2, NaHCO3 25 e

I preparati colici sono stati mantenuti tra due elettrodi coassiali di platino posizionati ad una distanza di 10 mm dall’asse longitudinale del preparato stesso e lasciato in incubazione per almeno 30 minuti. Prima dell’inizio delle procedure sperimentali, i preparati sono stati sottoposti a stimolazione elettrica transmurale (SET) per 2 o 3 volte ad una frequenza di 10 Hz ogni 20 minuti, mediante l’utilizzo dello stimolatore BM-ST6 (Biomedica Mangoni, Pisa, Italy), fino all’ottenimento di risposte contrattili riproducibili.

Nella prima serie di esperimenti, i preparati di colon distale sono stati mantenuti in soluzione di Krebs standard. Le risposte contrattili sono state evocate mediante l’applicazione di treni di impulsi elettrici della durata di 10 secondi, alla frequenza di 1, 5, 10 e 20 Hz (0,5 ms, 30 mA), applicati ad intervalli di 20 minuti. Nella seconda serie di esperimenti, gli impulsi elettrici sono stati applicati a preparati mantenuti in soluzione di Krebs contenente L-NAME 100 µM (inibitore della NO sintetasi), L-732,138 10 µM (antagonista del recettore NK1 della sostanza P) e guanetidina 10 µM (bloccante adrenergico), allo scopo di ottenere risposte contrattili di natura prevalentemente colinergica. Nella terza serie di esperimenti i preparati sono stati sottoposti a

stimolazione colinergica diretta della muscolatura liscia mediante l’applicazione di carbacolo (0,01-100 M) in presenza di tetrodotossina (1 M).

6.4 Valutazione del release dell’acetilcolina

La valutazione del release dell’acetilcolina è stata eseguita sui preparati di colon distale mediante un saggio fluorimetrico, come descritto da Milara e colleghi (2012). Aliquote di soluzione di Krebs sono state prelevate dai bagni per organi isolati contenenti i preparati colici in incubazione, secondo il seguente schema temporale: 180, 60 e 10 secondi prima della stimolazione elettrica (10 Hz), nel momento in cui lo stimolo elettrico è stato applicato e 10, 60 e 180 secondi dopo la stimolazione elettrica. I campioni sono stati diluiti 1:10 con il tampone e i risultati sono stati espressi in concentrazione µM.

6.5 Analisi immunoistochimica

I preparati colici, con spessore di 5 µm, sono stati prelevati dai ratti controllo e con MP sperimentale per essere sottoposti ad analisi immunoistochimica. Sono stati fissati con formalina al 4%, diluiti in tampone fosfato (PBS), disidratati in etanolo e trattati con xilene per essere poi inclusi in paraffina a 56°C. I

preparati sono stati quindi trattati con perossido di idrogeno all’1% in metanolo (30 minuti), portati a riscaldamento in tampone citrato (5x5’600W) e fissati con siero di suino (1:20; Dakopatts, Glostrup, Denmark). Successivamente sono stati incubati con un anticorpo murino anti-colina acetiltransferasi (anti-ChAT) (1:400; Millipore, Temecula, CA, USA). Le immunoglobuline sono state diluite con siero di albumina suina all’ 1% e sodio azide all’ 1% in PBS. I preparati sono stati poi sottoposti a lavaggi con PBS, incubati prima con immunoglobuline biotinilate (Vector, Burlingame, CA, USA), a seguire con il complesso di streptavidina marcata con perossidasi (kit Vectastain Elite, Vector) ed infine con la 3,3-diaminobenzidina tetraidro cloridrato (DAB; Dakopatts). I preparati sono stati quindi controcolorati con l’ematossilina di Harris. Tutte le reazioni sono state condotte a temperatura ambiente in condizioni di umidità. I controlli negativi sono stati ottenuti omettendo l’anticorpo primario o sostituendolo con un serio preimmune di coniglio. La verifica dell’attività perossidasica endogena e la capacità legante dell’avidina, è stata eseguita ponendo in incubazione i preparati con la DAB o con il complesso di streptavidina marcato con la perossidasi in presenza di DAB, rispettivamente. I preparati ottenuti sono

stati quindi analizzati con il microscopio a fluorescenza Leica DMRB. Sono stati accuratamente selezionati i campi microscopici ben orientati e ben colorati per ogni struttura di interesse e le microfotografie sono state ottenute utilizzando la fotocamera digitale DFC480 (Leica, Mycrosistem, Cambridge, UK) selezionando le più rappresentative.

L’analisi quantitativa della densità del segnale relativo all’espressione di ChAT è stata condotta come descritto di seguito. I rilievi immunoistochimici sono stati valutati quantitativamente da due osservatori in cieco. Per ogni sezione esaminata, 5 campi microscopici random sono stati analizzati e ottenute con un microscopio Leica DMRB a 20x dotato di fotocamera digitale DFC480. Ogni campo è stato sottoposto ad un’intensità soglia (da 150/255 a 185/255 in base al rapporto segnale-rumore) al fine di analizzare l’area immunoreattiva che è stata espressa come percentuale di pixel positivi (PPP) presenti nell’area totale di tessuto esaminata. Per ogni sezione i dati sono stati espressi come percentuale di area positiva alla ChAT ± D.S. di aree positive stimate in 5 settori esaminati. Per ogni gruppo, il valore di area positiva ChAT stato espresso come media ± D.S. di singole percentuali superficie stimata in campioni trattati o controllo.