9. Risultati
9.1 Analisi funzionale dell’attività contrattile intestinale Nella prima serie di esperimenti i preparati di colon distale sono stati mantenuti in soluzione di Krebs standard e sotoposti a stimolazione elettrica a frequenze crescenti. Nei grafici riportati di seguito (Figura 3 e 4) è possibile osservare una riduzione dell’attività contrattile nei preparati colici prelevati dai ratti con MP sperimentale, rispetto ai controlli. In particolare, nel caso della muscolatura liscia longitudinale (Figura 3) prelevata dagli animali sacrificati 28 giorni dopo l’induzione della lesione, si evidenzia una riduzione del 19, 13,9, 0,1, 18,9% in seguito a stimolazione elettrica alle frequenze di 1, 5, 10, 20 Hz, rispettivamente. Nei ratti sacrificati 56 giorni dopo l’induzione della lesione, si evidenzia, invece, una riduzione del 41,1, 0,9, 25,4 e 38,6% in seguito a stimolazione elettrica alle frequenze di 1, 5, 10, 20 Hz, rispettivamente.
Nei preparati di muscolatura circolare (Figura 4) si evidenzia
una riduzione dell’attività contrattile nei preparati di colon
prelevati dai ratti sacrificati 28 giorni dopo l’induzione della
lesione del 73,1, 51,4, 40,2 e 34.8% in seguito a stimolazione
elettrica alle frequenze di 1, 5, 10 e 20 Hz, rispettivamente.
Anche nel caso dei preparati colici prelevati dai ratti sacrificati
56 giorni dopo l’induzione della lesione è possibile
evidenziare una ridotta contrattilità della muscolatura liscia,
pari a 80,8, 40,7, 46,1 e 42.5% in seguito a stimolazione
elettrica alle frequenze di 1, 5, 10 e 20 Hz rispettivamente.
Figura 3. Preparati di muscolatura liscia longitudinale mantenuti in soluzione di Krebs standard. Curve frequenza-risposta ottenute dall’applicazione di treni di impulsi elettrici della durata di 10 secondi (0.5 ms, 30 mA, 1, 5, 10 e 20 Hz). Ciascun punto della curva rappresenta la media ± E.S.M. ottenuta da 6-8 esperimenti. *P<0.05, differenza significativa rispetto al controllo.
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0
C o n t r o llo M P 28 g io r n i M P 56 g io r n i
F r eq u en z a ( H z )
T e n s io n e g /g t e s s u to
*
*
Figura 4. Preparati di muscolatura liscia circolare mantenuti in soluzione di Krebs standard. Curve frequenza-risposta ottenute dall’applicazione di treni di impulsi elettrici della durata di 10 secondi (0.5 ms, 30 mA, 1, 5, 10 e 20 Hz). Ciascun punto della curva rappresenta la media ± E.S.M. ottenuta da 6-8 esperimenti. *P<0.05, differenza significativa rispetto al controllo. *P<0.05, differenza significativa rispetto al controllo.
Nella seconda serie di esperimenti i preparati sono stati mantenuti in soluzione di Krebs contenente L-NAME, L- 732,138 e guanetidina, allo scopo di isolare la componente neurogenica colinergica. In queste condizioni, le risposte evocate da stimolazione elettrica risultavano abolite da
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0
C o n t r o llo M P 28 g io r n i M P 56 g io r n i
F r eq u en z a ( H z )
T e n s io n e ( g /g t e s s u to )
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atropina (1 µM). Nei preparati di muscolatura liscia longitudinale, queste risposte colinergiche, risultavano ridotte nei tessuti ottenuti da animali con MP, rispetto ai controlli (Figura 5), sia dopo 28 che dopo 56 giorni dall’applicazione di 6-OHDA. Nei preparati prelevati dai ratti sacrificati 28 giorni dopo l’induzione della MP sperimentale, si osserva una riduzione dell’attività contrattile del 52,2, 26.8, 37, 27,7% in seguito a stimolazione elettrica alla frequenza di 1, 5, 10, 20 Hz, rispettivamente. Nei preparati prelevati dai ratti sacrificati dopo 56 giorni si evidenzia una riduzione del 48,4, 36,5 e 24, 12,8% delle risposte contrattili evocate da stimolazione elettrica alle frequenze di 1, 5, 10, 20 Hz, rispettivamente.
Anche i preparati di muscolatura liscia circolare mostravano profili di risposte contrattili simili a quanto osservato per i preparati di muscolatura longitudinale (Figura 6).
Nella terza serie di esperimenti i preparati di colon sono stati
sottoposti a stimolazione con carbacolo a concentrazioni
crescenti (0,01-100 M) in presenza di tetrodotossina (1 M),
allo scopo di analizzare le risposte contrattili miogene mediate
dai recettori muscarinici post-sinaptici. Come mostrato nei
grafici (Figura 7 e Figura 8), negli animali con MP è stato
osservato un aumento dell’attività contrattile, rispetto al
*
controllo. Nella Figura 7, sono rappresentate le curve ottenute nei preparati colici di muscolatura liscia longitunale.
.
Figura 5. Preparati di muscolatura liscia longitudinale mantenuti in soluzione di Krebs contenente L-NAME, L-732,138 e guanetidina. Curve frequenza-risposta ottenute dall’applicazione di treni di impulsi elettrici della durata di 10 secondi (0.5 ms, 30 mA, 1, 5, 10 e 20 Hz). Ciascun punto della curva rappresenta la media ± E.S.M. ottenuta da 6-8 esperimenti. *P<0.05, differenza significativa rispetto al controllo.
*P<0.05, differenza significativa rispetto al controllo.
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5
0 2 5 5 0 7 5
C o n t r o llo M P 28 g io r n i M P 56 g io r n i
F r eq u en z a ( H z )
T e n s io n e g /g t e s s u to
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Figura 6. Preparati di muscolatura liscia circolare mantenuti in soluzione di Krebs contenente L-NAME, L-732,138 e guanetidina. Curve frequenza-risposta ottenute dall’applicazione di treni di impulsi elettrici della durata di 10 secondi (0.5 ms, 30 mA, 1, 5, 10 e 20 Hz). Ciascun punto della curva rappresenta la media ± E.S.M. ottenuta da 6-8 esperimenti. *P<0.05, differenza significativa rispetto al controllo.
Nei tessuti prelevati dai ratti sacrificati 28 giorni dopo l’induzione della MP, si evidenzia un aumento dell’attività
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0
C o n t r o llo M P 28 g io r n i M P 56 g io r n i
F r eq u en z a ( H z )
T e n s io n e ( g /g t e s s u to )
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contrattile muscarinica pari a 2,2, 3,6, 53,5, 79,3 e 118,8% alle concentrazioni di 0,01, 0,1, 1, 10 e 100 M, rispettivamente.
Nei preparati prelevati dai ratti sacrificati dopo 56 giorni, si osserva un aumento del 16, 51,3, 71, 77,6 e 104,6% alle concentrazioni di 0,01, 0,1, 1, 10 e 100 M, rispettivamente.
In Figura 8, è riportato l’andamento dell’attività contrattile
della muscolatura liscia circolare. Negli animali sacrificati 28
giorni dopo l’induzione della MP, è possibile osservare un
aumento delle risposte contrattili pari a 0,2, 42,9, 14,3, 56 e
104,7% alle concentrazioni di 0.01, 0.1, 1, 10 e 100 M,
rispettivamente. Nei ratti sacrificati dopo 56 giorni dalla
somministrazione di 6-OHDA, l’aumento dell’attività
contrattile è stata del 68,7, 1,74, 61,9, 88,1, 144,6% alla
concentrazione di 0,01, 0,1, 1, 100 M, rispettivamente.
Figura 7. Preparati di muscolatura liscia longitudinale mantenuti in soluzione di Krebs contenente TTX. Curve concentrazione-risposta ottenute dall’applicazione di carbacolo a concentrazioni crescenti (0,01- 100 M). Ciascun punto della curva rappresenta la media ± E.S.M.
ottenuta da 6-8 esperimenti. *P<0.05, differenza significativa rispetto al controllo.
1 0- 9 1 0- 8 1 0- 7 1 0- 6 1 0- 5 1 0- 4 1 0- 3 0
2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0
C o n t r o llo M P 28 g io r n i M P 56 g io r n i
C ar b aco lo ( M )
T e n s io n e g /g t e s s u to
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Figura 8. Preparati di muscolatura liscia circolare mantenuti in soluzione di Krebs contenente TTX. Curve concentrazione-risposta ottenute dall’applicazione di carbacolo a concentrazioni crescenti (0,01-100 M).
Ciascun punto della curva rappresenta la media ± E.S.M. ottenuta da 6-8 esperimenti. *P<0.05, differenza significativa rispetto al controllo.
9.2 Valutazione del release dell’acetilcolina
La valutazione del release di acetilcolina, è stata condotta mediante saggio fluorimetrico, su aliquote di soluzione di
1 0- 9 1 0- 8 1 0- 7 1 0- 6 1 0- 5 1 0- 4 1 0- 3 1 0- 2 0
4 0 8 0 1 2 0 1 6 0
C o n tr o llo M P 28 g io r n i M P 56 g io r n i
C ar b aco lo (M )
Tensione (g/g tessuto)
*
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Krebs prelevate dai bagni per organi isolati contenenti
preparati di muscolatura liscia longitudinale. Il prelievo delle
aliquote è stato eseguito a diversi tempi rispetto
all’applicazione di uno stimolo elettrico alla frequenza di 10
Hz, come precedentemente descritto. I preparati colici sono
stati prelevati dai ratti sacrificati 56 giorni dopo l’induzione
della MP sperimentale. Il dosaggio, effettuato sulle aliquote di
soluzione di Krebs in cui erano contenuti i preparati ottenuti da
animali con MP, ha mostrato differenze significative rispetto al
controllo. La Figura 9 mostra infatti una significativa riduzione
del rilascio di acetilcolina, in accordo con quanto osservato
negli studi funzionali. In particolare, è possibile osservare una
riduzione del rilascio di acetilcolina del 47,4 e 28,4%,
rispettivamente a 60 e 10 secondi prima della stimolazione
elettrica. Durante l’applicazione dello stimolo elettrico invece
la concentrazione di acetilcolina rilasciata è risultata inferiore
del 42,8% rispetto al controllo, mentre a 10, 60 e 180 secondi
successivi alla stimolazione, la riduzione è risultata pari a 54.4,
40.9, 93.4%, rispettivamente. I preparati colici prelevati dai
ratti con MP hanno mostrato quindi una ridotta capacità di
liberare acetilcolina in seguito all’applicazione di stimoli
elettrici.
9.3 Analisi immunoistochimica
L’analisi immunoistochimica eseguita su sezioni di tessuto
neuromuscolare ottenuto da animali di controllo ha permesso
di evidenziare la presenza di ChAT a livello dei gangli del
plesso mienterico. Nei tessuti ottenuti da animali sottoposti a
induzione di MP sperimentale, è stato possibile osservare un
decremento dell’immunopositività di ChAT, sia dopo 28 che
dopo 56 giorni dall’induzione della lesione nigro-striatale
(Figura 10). L’analisi densitometrica condotta sulle sezioni di
tessuto neuromuscolare ha permesso di evidenziare una
riduzione statisticamente significativa dell’immunopositività
di ChAT nei preparati prelevati dai ratti con MP, rispetto al
controllo (Figura 11).
Figura 9. Rappresentazione del release dell’acetilcolina eseguita su aliquote di soluzione di Krebs prelevate dai bagni per organi isolati contenenti preparati di colon distale, muscolatura liscia longitudinale.
Ciascuna colonna rappresenta la media ± E.S.M. ottenuta da 6-8 esperimenti. *P<0.05, differenza significativa rispetto al controllo.
180 60 10
SE 10 Hz 10 60 180
0 1 0 2 0 3 0 4 0
C o n tr o llo MP 56 g io r n i
T em p o (sec)
Ach (M/g tessuto)
